Retenția intronurilor și a pierderii nucleare a SFPQ sunt altele moleculare – Nature Communications – Comunicații 2021

Alternative Splicing

Pluriipotant indus Celulele stem

Neurologie

patogeneză

sumar

mutații care provoacă Scleroza laterală amiotrofică (ELA) implică considerabil regulatori ai prelucrării ARN exprimate în formă omniprezentă. Pentru a înțelege impactul molecular al mutațiilor care cauzează ELA în dezvoltarea neuronală și a bolii, analizăm transcriptomele în timpul diferențierii in vitro a neuronilor motorii (MN) a mutanților mutanți mutanți indusă de VCP indus de pacienți (IPSC). Identificăm o retenție mai mare a intronilor (IR) ca o caracteristică dominantă a programului de îmbinare în timpul diferențierii neuronale timpurii. Este important de observat că IR este produs prematur în culturile mutante ale VCP comparativ cu omologii lor de control. Aceste evenimente aberante IR sunt, de asemenea, văzute în seturi de date independente de MN SOD1 și FUS. Cea mai importantă IR este observată în transcripția SFPQ. Proteina SFPQ este atașată pe scară largă la intratrul reținut, prezintă o abundență mai puțin nucleară în culturile mutante VCP și se pierde de la nucleele Mn în modelele de șoarece și ALS sporadice umane. În total, arătăm SFPQ IR și pierderi nucleare ca distincții moleculare ale AL-urilor familiale și sporadice.

INTRODUCERE

Scleroza laterală amiotrofică (ELA) este o condiție rapidă progresivă și incurabilă legată de vârstă , ceea ce duce la degenerarea selectivă a neuronilor motorii (Mn). Mutațiile cauzate de ALS implică reglementările esențiale ale prelucrării ARN, exprimate în mod normal pe tot parcursul dezvoltării, în patogeneza subiacentă. Aceasta ridică posibilitatea ca schimbările post-transcripționale care să apară în stadiile incipiente ale vieții, inclusiv dezvoltarea neurologică, pot juca un rol fundamental în patogeneza moleculară subiacentă a ELA. Înțelegerea impactului mutațiilor care provoacă ALS în dezvoltarea neurologică și boala ne va permite să elucideze evenimentele de pornire moleculară. Acest lucru, la rândul său, poate ghida dezvoltarea de noi terapii care vizează mecanismele primare înainte ca boala să progresă prea mult.

Atât dezvoltarea și homeostaza neuronală, se bazează fundamental pe implementarea precisă a prelucrării alternative a ARN a tipului celulelor și pe etapă, inclusiv îmbinare alternativă (ca) și poliadenilare alternativă (APA) 1, 2, 3. Câteva mecanisme au fost stabilite, care includ omisiunea exon, exonii exclusivi și retenția introns (IR). Utilizarea alternativă a exonului este caracterizată în special în neuroni pentru a regla varietatea de proteine și funcție 4. Tipurile de celule neuronale arată o proporție mai mare de introni reținuți în comparație cu alte țesuturi și există un organism de dovezi extinse care demonstrează un rol funcțional pentru desfășurarea neuronală și homeostazia 5, 6, 7, 8. Sa demonstrat că creșterea de a merge în timpul diferențierii neuronale reglementează exprimarea transcrierilor care nu sunt necesare pentru fiziologia neuronală matură 7. Un studiu recent a arătat dovezi ale prelucrării post-transcripționale a transcrierilor care păstrează intronale ca răspuns la activitatea neuronală 8.

Apa este un mod alternativ de procesare ARN care generează diferite extreme 3 „mai frecvent în regiunea 3” Tradus (3 ‘UTR) al ARNm, generând izoforme cu lungime variabilă de 3’ UTR. UTR 3 ‘servesc ca o platformă cheie în rețeaua de reglementare ARN care controlează eficiența, amplasarea și stabilitatea traducerii ARNm 9, 10. Casa UTR 3 „O variabilitate extinsă a lungimii țesutului specific, care afectează în mod semnificativ funcția 11. Din toate tipurile de celule umane, izoformele specifice ale creierului au URT de 3 ‘mai lung 12, 13. În plus, mutațiile care perturbă structura secundară a ARNm și a siturilor de interacțiune ARNM-MIO-MIRN pot duce la neurodegenerare 14. În ciuda acestor constatări, funcțiile reglementării IR și 3 „URT în contextul dezvoltării MN și a homeostaziei au rămas puțin studiate în comparație cu alte forme ale EA.

AS și APA sunt coordonate pentru acțiunile sau combinațiile individuale de proteine de legare a ARN (RBPS) care acționează în Trans care se leagă la anumite locații din cadrul ARNm (pre-) 15, 16. RBPS mediază splicingul ARNm, exportul nuclear și locația.Acumularea de dovezi implică PRR ca regulatori-cheie ai dezvoltării neurologice și a formelor specifice de neurodegenerare. De fapt, mutații în mai multe RBP, inclusiv proteina de legare a ADN-ului transactiv, 43 KDA (TDP-43), fuzionată în sarcom (FUS) și factor asociat cu proteina legată cu cutie cu cutie (TAF15) au fost legate de cauzalitate Forma de familie a ELA, care duce la defecte de prelucrare a ARN în modelele de șoarece 17, 18.

Ipoteza noastră este că articulația aberantă și APA îndeplinesc roluri importante atât în dezvoltarea ca și în boala sistemului nervos . În acest context, încercăm să înțelegem cum apar diferite moduri precum și APA în neurogeneza motorii umane și examinează sistematic impactul mutațiilor care cauzează ELA în remodela post-transcripție în timpul restricției de linii. Prin combinarea diferențierii celulelor stem determinate de om (IPSC) cu secvențiere ARN rezolvată în timp, identificăm mai întâi programul de remodelare post-transcripțional secvențial care stă la baza neurogenezei motorii umane. Recent, am identificat fenotipurile celulare clare ale ELA prin utilizarea IPSC derivate de la pacienții cu vârsta de vallosine (VCP) 19. Această platformă ne-a permis să comparăm mutantul VCP (VCP MU) pentru a controla culturile în timpul diferențierii MN și pentru a identifica dereglementarea dependentă de mutație într-o etapă specifică de dezvoltare. Identificăm factorul de împrăștiere a prolinei și bogat (SFPQ) ca cea mai importantă transcriere de retenție între diferitele mutații cauzate de ALS (VCP, SOD1 și FUS). Arătăm că proteina SFPQ este atașată pe scară largă la intratrul său reținut, care prezintă o abundență citoplasmică ridicată în VCP MU comparativ cu controalele. Din punct de vedere fundamental, proteina este mai puțin abundentă în nucleele culturilor VCP MU și, în final, este pierdut din nucleele MN la modelele de șoareci (modele de șoareci transgenici sod1 mu și VCP MU) și eșantioane post-mortem sporadice umane de ALS. În concluzie, studiul nostru implică SFPQ IR și pierderi nucleare ca distincții moleculare generale ale familiei și sporadice ELO.

IR este modul predominant de îmbinare în neurogeneza motorului.

pentru a examina post- modificări transcripționale în timpul neurogenezei motorii umane, analizăm datele de secvențiere ARN de înaltă performanță (ARN-SEQ) pentru ARN poliadenilat izolate din celule stem pluripotente indusă (IPSCS; Ziua 0), precursori neuronali (NPC, Ziua 7), precursorii MNS „cu model „(măduva spinării ventrale, PMN-uri, Ziua 14), MNS postmitotice, dar electrofiziologice (MNS, ziua 21) și MNS electrofiziologic matur (MMN, Ziua 35) derivate de la doi pacienți cu VCP de mutație ALS și două comenzi sănătoase (Fig. 1a, 31 de eșantioane de 5 puncte temporare și 3 genotipuri; 2 clone de 2 comenzi sănătoase și 3 clone de 2 pacienți cu ELA cu mutațiile VCP: R155C și R191Q). Eșantioanele celulare ale fiecărei etape a diferențierii MN au fost caracterizate așa cum au fost raportate anterior. Aici efectuăm o caracterizare suplimentară extinsă pentru a confirma culturile MN foarte îmbogățite (> 90%; Fig.1A complementară). Este important de observat că eficiența diferențierii Mn a fost similară între controlul și culturile VCP (fig.1b, c). Folosind un set de 19 markeri genetic cheie ai maturarii MN și dezvoltării embrionare, confirmăm, de asemenea, o constatare prealabilă că NMM derivate din IPSC seamănă cu 10 fetele în loc de adulți (Figura 2a, B, Suplimentar B). Gruparea ierarhică non-supravegheată (corelația rangului Spearman și gruparea completă) a celor 31 de eșantioane utilizând 15, 989 de probe segregate de gene exprimate într-un mod de încredere, în funcție de stadiul lor de dezvoltare în interiorul liniei MN în locul fundalului sau controlului genetic mutant (fig. 1b).

div Id = „724AA78C71”>iv id = „5c7400ad75”

Intron reținere este Schimbarea joncțiunii predominante în timpul neurogenezei motorii timpurii și este produs prematur în culturile MU ale VCP. O schemă care reprezintă strategia de diferențiere IPSC pentru neurogeneza motorii. Săgețile indică punctele de timp de eșantionare în zilele. Clonele IPSC au fost obținute de la doi pacienți cu mutațiile confirmate de VCP (R155C și R191Q, un total de 3 linii IPSC, 1 inducție a fiecărei linii) și 1 clona fiecăruia dintre cele 2 comenzi sănătoase (un total de 2 linii IPSC diferite, 2 inducții ale unei linii și 1 inducție de pe cealaltă linie).Celule stem pluripotent indus (IPSC); precursori neuronali (NPC); Neuroni motori precursori „modelați” (măduva spinării ventrale, PMN); neuroni motori imaturi postmitootici, dar electrofiziologic (Mn); MBS (MMN) mature electrofiziologic (MMN). B grupul ierarhic non-supravegheat de 15, 989 de gene grupează cele 31 de eșantioane conform etapei de dezvoltare neuronală, în loc de fundalul genetic. Cercuri gri = eșantioane de control; Circlele Magenta = probe VCP MU; Punctele de timp de eșantionare sunt indicate în interiorul cercurilor. C Grafica circulară reprezentând proporții de evenimente de îmbinare în probele de control și VCP mu în diferite etape ale neurogenezei motorii comparativ cu punctul temporar anterior. Zonele grafice sunt proporționale cu numărul total de evenimente din fiecare etapă. Reținerea intronurilor (IR); Exon alternativ (Altex); Microexonii (MIC); Alternative 5 ‘și 3’ UTR (Alt5 și Alt3). D, grafică f, reprezentând numărul de evenimente de îmbinare externe și intronice, respectiv în probele de control (gri) și VCP MU (Bars Magenta) la puncte specifice în timpul diferențierii MN. E, grafică G Bar Afișarea scorului de îmbogățire a căilor biologice Go asociate transcrierilor care experimentează evenimente exononice și introductive de îmbinare în probele de control. H În partea de sus, graficele de numerar reprezintă distribuțiile procentului de retenție (a se vedea metodele) pentru 167 introne întărite manual în replici în diferite etape de diferențiere în probele de control (stânga) și VCP MU (dreapta). Diagramele de numerar arată rezumatul a cinci numere mediane, cuvilele inferioare și superioare, valorile minime și maxime. Mai jos, hărți termice ale procentului relativ standard al IR în 167 introni în eșantioane repetate în fiecare etapă de diferențiere. I ca în H, dar pentru diferențierea in vitro a HESC la etapa de inducție neurală (1 săptămână), NPC (4-10 săptămâni) care produce numai neuroni după diferențierea suplimentară și după iv ID = „5953472805” 15 săptămâni, o etapă mai gliogenică care produce atât neuroni, cât și celule gliale 22

imagine de dimensiune completă

examinăm dinamica temporară a ca în timpul diferențierii MN. Folosind VAS-Instrumente 21 din conducta ARN-SEQ, identificăm 1599 și 1507 de evenimente de-a lungul timpului în probele de control și, respectiv, VCP MU (fig.2c, d). Potrivit studiilor anterioare, > 60% din evenimentele din etapele ulterioare ale diferențierii terminalelor MN au fost exon alternative (incluziune și excludere a exonelor casetei) și evenimente de omisiune ale Intron (figura 2C , d). Am constatat că eșantioanele de control și VCP MU prezintă o creștere progresivă similară a incluziunii exonului în casetă în timp (fig.1c, d) în genele îmbogățite pentru organizarea componentelor celulare și a funcțiilor de ononologie a axonogenezei (Go) Figura 1E).

În contrast, IR a reprezentat > 65% din evenimentele similare ca în faza anterioară a restricției de linii NPC la PMN (figura 1c) . Exprimarea transcrierilor de reținere intron a crescut în tranziția de la NPC la PMN (de exemplu, modelul neuronal) în probele de control (figura 1f). Interesant, probele VCP MU au arătat o creștere surprinzătoare a expresiei transcrierilor care păstrează intronul în tranziția anterioară de dezvoltare a IPSCS la NPCS (adică inducția neuronală, figura 1F). Am constatat că 53% din evenimentele IR au început cu modelul în probele de control (NPC la PMN); În schimb, 72% din evenimentele IR din culturile MU de VCP au început cu inducție neuronală (IPSC la NPC, figura 2e complementară, dreapta). Este important de menționat că 60% din toate evenimentele IR au implicat introne și transcrieri identice între probele VCP MU și de control (Fig.2e complementare, până la stânga), care implică foarte mult gene legate de prelucrare și splice ARN (figura 1 g) . Evenimentele rămase au fost exclusive ale culturilor VCP MU sau au avut loc într-un alt punct. Acest lucru indică faptul că eșantioanele VCP MU arată o activitate similară cu cea observată în omologii de control în timpul diferențierii, dar la o etapă prematură.

Apoi, vom vindeca fiecare eveniment identificat automat la lista scurtă 167 mare încredere. O valoare de reținere a fost atribuită pentru fiecare eveniment care urmează să fie legat de expresia exonelor de flancă (a se vedea metodele). Este imediat evident din FIG. 1H că cele 167 de intronale sunt reținute în mod sistematic mai mult în VCP MU în etapa NPC comparativ cu probele de control ale oricărei etape.

Ca o validare inițială, evaluăm dacă cele 167 de introni sunt, de asemenea, reținute în două seturi de date transcriptomice independente de celule stem embrionare umane 22, 23. Examinarea nivelului său general de retenție a confirmat că IR în timpul neurogenezei timpurii este un fenomen general în diferite modele experimentale (fig.1i și Fig.2F suplimentar). În continuare, examinăm dacă intronii au fost păstrați caracteristici structurale caracteristice care ar putea fi distinse de intronii înclinați și au constatat că setul de 167 de introni reținuți este mai lung și mai conservat decât intronii care nu sunt reținuți din același set de gene (Fig. 2G complementar).

VCP joacă un rol în progresia ciclului celular și un procent mai mare de IR poate rezulta din legătura stabilită între eficiența îmbinării și a ciclului celular 24. Prin urmare, examinăm dacă accelerarea aparentă a programelor din VCP MU este explicată printr-o creștere dependentă de mutația activității ciclului celular. Utilizăm citometria de flux în IPSCS, NPCS și PMN tratați cu agentul fluorescent intercalat și agentul statichiometric cu iodură de propidiu pentru a examina conținutul ADN-ului. Aceste experimente au exclus, de fapt, diferențele dintre ciclul celular între VCP MU și eșantioanele de control (Figura 2H-J Suplimentar). Astfel, în mod colectiv, aceste constatări arată că IR este schimbarea de joncțiune predominantă care afectează stadiile incipiente ale restricției de linii neuronale. Este important să rețineți că IR este produs atât la niveluri ridicate, cât și prematur în culturile VCP MU din stadiul NPC, care nu poate fi explicat prin diferențele dintre activitatea ciclului celular.

IR aberant în. Mn purtând diverse mutații cauzate de ALS

Insigna patologică în > 97% din toate cazurile de ELA (sporadic și familia) este citoplasma nucleară a TDP- 43 25, 26. Cu toate acestea, absența locației slabe a TDP-43 în 3% din cazuri susține că sunt încă descoperite mecanisme patogene comune. Pentru a aborda acest lucru, atunci examinăm impactul mutațiilor care provoacă SOD1 și FUS ALS, care, într-o manieră caracteristică, nu prezintă un semnal de locație eronat de TDP-43. Analizăm seturile de date transcriptorice pentru SOD1 (SOD1 MU) (N = 5, 2 SOD1 A4V derivate de la pacienți și 3 mn s-au purificat cu Facs de control izogenic, unde mutația) 27 a fost corectată și eșantioane FUS (FUS MU) (N = 6; 3 fus R521G derivați de pacienți și 3 controale MN ne-afectate) 28. Confirmăm că IR este modul predominant al joncțiunii în MNS derivat din ambele mutante (Fig.3A complementar), sugerând un fenomen molecular unificator prin diverse fundal genetic al ALS (VCP, SOD1 și FUS). Este important să rețineți că setul nostru ridicat de încredere de 167 de evenimente IR care apar prematur în timpul diferențierii VCP Mn sunt, de asemenea, afectate în general în FUS MU și SOD1 MN (figura 2a); În mod specific, evenimentele 74 și 59 vor arăta o creștere statistic semnificativă a SOD1 MU și respectiv Fus MNS, comparativ cu comenzile (valoarea P < 0, 01; dovada numărului pescarului; Fig. 3b complementar). Extinderea îmbinării pentru acele introni reținută semnificativ atât în SOD1 MU, cât și în FUS MU este arătată într-o hartă de căldură din figura 2b. Acestea formează o rețea de proteine îmbogățite în splicarea și traducerea ARN (fig.2c, d). Acest lucru arată că evenimentele IR identificate în modelul nostru ALS sunt, de asemenea, incluse în MNS care transportă alte mutații cauzate de ALS care nu arată o locație proastă a TDP-43. Cumulativ, aceste constatări confirmă posibilitatea unei generalizări aberante în diferite forme genetice de ALS.

Tranzile implicate în inducția neuronală arată o reținere larg răspândită a intronilor în MN derivate din mutații care cauzează ALS FUS și SOD1. Grafică de casetă care prezintă distribuția procentului de retenție pentru 167 de introni care au avut loc manual în controlul MNS (cutia albă), mutanții MNS Mu Fus (cutie gri) sau mostre SOD1 MN6 (bara albastră) 28, 50. Probele mutante prezintă sistematic o proporție mai mare de a merge comparativ cu comenzile. Diagramele cutiei sunt prezentate în figura 1h. B Heatmap Grouped Ierarhic (Distanța de la Manhattan și Gruparea Ward) a nivelurilor relative de IR în 40 de gene care prezintă o retenție statistic semnificativă în timpul neurogenezei motorului atât în SOD1 MU, cât și în Fus MU MNS.Cercuri albastre = eșantioane sod1 mu, gri cercuri = eșantioane FUS MU și goale Circles = probe de control. C Rețeaua de interacțiuni proteice-proteine pentru gene care expune în timpul neurogenezei motorului la SOD1 MU sau FUS MU MNS. Marginile reprezintă interacțiunile proteice-proteine descrise experimental adnotate în baza de date 51. Nodurile indică proteine, colorate în funcție de condițiile în care emite transcrierea corespunzătoare; Dimensiunile cercurilor sunt proporționale cu numărul de margini din rețea. D grafică de bar care prezintă scoruri de îmbogățire (Testul de Value P Value P) al GOS biologice asociate cu genele care arată în timpul neurogenezei motorului în SOD1 MU și / sau FUS MNS comparativ cu comenzile

Imagine de dimensiune completă

TRANSITORIA TRANSITORII URT 3 ‘în neurogeneza timpurie

Îmbunătățirea și reglarea poliadenilării sunt de obicei interconectate. Pentru a examina dacă lungimea UTR 3 ‘variază de-a lungul diferențierii și modul în care VCP MU afectează acest proces, mai întâi extindem catalogul curent al UTR ENSEMBL 3 utilizând datele noastre ARN-SEQ (vezi metodele); Pentru fiecare genă, analizăm lungimile maxime exprimate în funcție de diferențiere. Ambele probe de control și VCP MU, lungimile medii ale UTR 3 ‘pentru 12, 364 de gene exprimate în continuu creșterea în cursul timpului de diferențiere. Cu toate acestea, în mod excepțional, UTR 3 ‘în probele de control sunt scurtate temporar în timpul stadiului NPC (valoarea P < 0, 01; Fig.3A). Deoarece este de așteptat o alungire de 3 ‘UTR în dezvoltarea embrionară, scurtarea observată în stadiul NPC (comparativ cu IPSC) este surprinzătoare.

divid id = „724AA78C71”>

variația lungimii URT în timpul neurogenezei motor umane. La diagramele de box de distribuție maximă a lungimii UTR exprimate în diferite etape ale diferențierii Mn în probele de control (stânga) și VCP MU (dreapta). Valoarea VAL obținută cu testul Wilcoxon. B bar grafică care prezintă numerele UTR 3 „cu schimbări statistic semnificative între promotorul distal (stânga) și promotorul proximal (dreapta) în diferite etape de diferențiere comparativ cu IPSCS în controlul controlului (barei gri) și probe VCP MU (Bare Magenta). Introducere, grafică circulară reprezentând proporțiile genelor care prezintă utilizarea UTR în alternativă în probele de control și VCP MU (alb), numai probele de control (zona gri) sau numai probele VCP MU (zona Magenta). C Go Enrichment Analiza căilor biologice asociate cu genele care prezintă modificări distal semnificative din punct de vedere statistic în utilizarea locului poli (A) în mm de control comparativ cu controlul IPSC. D și la stânga, vederile browserului genom al profilurilor ARN-SEQ în UTR 3 ‘UTR a genelor GNL1 și TARDBP care prezintă schimbări semnificative statistic în mod proximal la distal în utilizarea site-ului POLI în MMN în comparație cu IPSCS. În dreapta, graficele de bare care prezintă utilizarea distală a UTR de 3 ‘în raport cu UTR proximal 3’. Valorile P obținute cu testul de numărare Fisher. F identică C pentru genele care prezintă modificări proximale semnificative din punct de vedere statistic în utilizarea site-ului Poly (A) în NPC de control comparativ cu controlul IPSC. G, H, la fel ca și pentru genele ZNF254 și DARS care prezintă schimbări distante la proximal semnificativ statistic în utilizarea sitului Poly (A) în NPCS comparativ cu IPSC

Imagine de dimensiune completă

Pentru a investiga în continuare dinamica prelucrării UTR în 3 ‘, analizăm siturile Tandem Poly (A) care au fost localizate în același exon de terminale. Folosind numărul de citiri atribuite la terminalul de 300 NT al segmentului din fiecare 3 ‘UTR ca proxy pentru nivelul de expresie izoform, am cuantificat utilizarea site-ului alternativ Pol (A) în diferite etape de dezvoltare comparativ cu IPSC. 822 Gene arată modificări statistic semnificative ale UTR 3 „în control și / sau VCP MU (fig.3b). În 171 de gene, există o utilizare mai mare a site-ului de poli (A) distal atât în control, cât și în VCP MMN (fig.3b), conform unui studiu anterior 29; Aceste gene sunt îmbogățite în condiții de deplasare legate de îmbinarea ARNm (figura 3c). În etapa Mn < 10, genele arată o utilizare semnificativă diferențială a 3 ‘UTR atunci când culturile de control și VCP MU sunt în mod direct comparate, ceea ce confirmă o reglementare a lungimii URT similar În diferențierea terminală dintre control și VCP MU (figura 4a suplimentar).Este demn de remarcat faptul că, în mai multe cazuri, eșantioanele VCP MU au arătat o schimbare semnificativă distală a promotorului într-o etapă relativ mai devreme pentru a controla probele. Aceste exemple includ GNL1 (fig.3d) și TARDBP (figura 3e); Acesta din urmă prezintă, de asemenea, o acumulare de izoforme Long UTR 3 ‘în SOD1 M în comparație cu comenzile, dar nu în FUS MU (Fig.4C, D). Niciuna dintre aceste variații în UTR în 3 „a condus la modificări măsurabile în exprimarea genelor sau a proteinelor (fig.4e, F, G complementar).

din 822 gene, 169 prezintă o schimbare proximală a promotorului Statistic semnificativ în mod specific în NPC de control comparativ cu IPSCS (figura 3b). Diferitele căi biologice, cum ar fi transcripția și reglarea neurotrofinei, sunt reprezentate între transcrieri care prezintă o scurtare UTR de 3 ‘de 3’ (fig.3F). Aproximativ 80% din aceste evenimente sunt absente în VCP MU (fig.3b, g, h); Acest lucru este confirmat în continuare atunci când eșantioanele VCP MU și de control sunt comparate direct la stadiul NPC (figura 4a, b). Aceste date demonstrează că variația de variație a lungimii URT extinsă înainte de a merge și caracteriza tranziția de la IPSC la NPC. Este important de reținut că probele VCP MU nu prezintă niciun proces similar aparent.

Regulamentul de la partea inferioară a factorului de îmbinare se potrivește cu un IR aberant

după identificarea principală Diferențele de îmbinare în probele ELA în comparație cu controlul, apoi a fost încercat să cuprindă dacă fundalul genetic ELA duce la diferențe transcripționale măsurabile în timpul neurogenezei motorului. În mod specific, investigăm modificările expresiei care nu sunt identificate în mod optim prin gruparea ierarhică (figura 1B), care este adesea dominată de un singur program de transcriere. Aplicăm descompunerea unică a valorii (SVD) pe întreaga matrice de expresie (15, 989 de gene în 31 de probe; FIG. 1A) pentru a identifica principalele programe transcripționale și a proceselor biologice asociate care stau la baza neurogenezei motorului 30. Folosind această metodă, constatăm că (1) neurogeneza progresivă, (2) inducția neuronală și modelul tranzitoriu și (3) diferențierea terminalului cu o anumită contribuție la inducția neuronală reprezintă principalele programe de expresie celulară ortogonală care funcționează la cursul de timp de dezvoltare; Primele trei componente captează 69% din variația expresiei genei (figura 4a-c, figura 5a complementară). Analiza activă a îmbogățirii funcționale a grupurilor de gene care au fost asociate pozitiv sau negativ cu aceste componente (figura 4D-F) confirmă în continuare asocierea biologică a fiecărei componente principale. Este important să rețineți că eșantioanele de control și VCP MU se comportă în mod similar în aceste primele trei componente. O analiză liniară multivariată a confirmat că timpul în cultură în loc de mutația VCP este variabila care explică componentele 1, 2 și 3 (figura 5b complementară).

divid id = „724AA78C71”

Reglarea componentelor globale de îmbinare redus meciurile mergând. A-C Analiza de descompunere a valorii singulare a expresiei a 15, 989 de gene în n = 31 de eșantioane. În partea stângă, graficele de linie prezintă profilurile de expresie ale primilor trei vectori singulari \ (\ overrighttarrow v _1 \) prin \ (\ overrighttarrow v _3 \), capturarea a 47%, 15% și 7% din variația expresiei genei , respectiv. Punctele de date gri și magenta indică expresia pentru probele de control și VCP MU. În partea dreaptă, harta căldurii a expresiei standardizate a genelor ale căror profiluri de expresie se corelează pozitiv (indicate de cele trei dreptunghiuri mai întunecate) și negative (indicate de cele trei dreptunghiuri mai clare) cu primele trei vectori singulari din dreapta. Graficele de bare D-F arată scorurile de îmbogățire pentru funcțiile biologice Go de Genele care sunt corelate pozitiv (trei bare inferioare) sau negativ (trei bare inferioare) cu primele trei vectori singulari din dreapta. G Bar Diagrame în partea de sus, care reprezintă numărul de gene reglementate la declinul eșantioanelor MU de VCP comparativ cu controlul în diferite etape ale diferențierii MN. Mai jos, harta termică a funcțiilor biologice Go îmbogățite între genele reglementate la punctele de timp corespunzătoare.H Diagrame de numerar care prezintă distribuțiile modificărilor în Log2 pentru 66 de gene ale factorului de splicare esențial între mutanții și controalele ALS; Cutii albe = VCP MU comparativ cu comenzile, caseta albastră = SOD1 MU comparativ cu comenzile isogene, cutia verde = FUS MU comparativ cu comenzile

Imagine de dimensiune completă

Apoi, realizăm a Analiza diferențială a expresiei genei pentru a evalua dacă genele specifice sunt reglementate diferențial în diferite etape ale dezvoltării neuronale în VCP MU comparativ cu probele de control. Două sute cincizeci și șase de gene au fost reglementate statistic la VCP MU în stadiul NPC în care apare un IR aberant (log2fc > 1.5 și valoarea p < 0,01); Aceste gene sunt foarte îmbogățite în splica ARNm și în funcțiile de procesare a capătului 3 ‘(figura 4g). Trebuie remarcat faptul că 47 dintre aceste gene codifică Rbps (Fig.5d complementar). Au fost mai puține gene reglementate în sus (Fig.5c suplimentar). De asemenea, examinăm nivelurile de expresie de 66 de gene de reglementare cunoscute 31; Există o reglementare clară la nivel mondial în stadiul NPC al probelor VCP MU și în FUS SOD1 MU și independent, coincid cu un IR aberant în fiecare caz (figura 4h).

În rezumat, noi a constatat că programele de transcriere și de prelucrare a ARN reflectă calea de dezvoltare MN, deoarece căile specifice sunt activate de etape. În ciuda defectelor post-transcripționale, programul transcripțional primar nu este întrerupt în timpul diferențierii MN prin mutația VCP. Cu toate acestea, o reglementare globală în scădere în exprimarea componentelor de îmbinare apare concomitent cu un iris aberant în diferite mutații care cauzează transcrieri citoplasmice IR și pierderea nucleară a proteinei SFPQ

Gena SFPQ, membră a familiei de comportament Drosophila, îmbinare umană (DBHS), codifică o proteină care efectuează funcții cheie în transcripție, îmbinare, prelucrarea finală 3 ‘și viabilitatea axelor 32, 33, 34, 35. Aici, Intron 9/9 din 9 KB în gena SFPQ prezintă cel mai proeminent eveniment IR identificat în timpul neurogenezei motorului în probele NPC VPC MU comparativ cu omologii de control. Este important de reținut faptul că SFPQ IR aberant are loc, de asemenea, în SOD1 MU și MU MN comparativ cu comenzile (figura 5a, c). Validați SFPQ IR și dereglementarea acestuia în VCP MU comparativ cu eșantioanele de control prin intermediul analizei QPCR a mai multor linii IPSC independente (trei clone de trei comenzi sănătoase și patru clone de doi pacienți cu mutații VCP; FIG. 5B și FIG. 6A suplimentar). În plus, am validat două regulatoare comune Gus și DDX39, care sunt la fel de puternic afectate în NPC VCP MU și în SOD1 MU și MU MN (Fig.6B-G suplimentar).

DIV ID = „724AA78C71″ ” >

duminică a intronului SFPQ în diferite forme genetice de ALS și interacțiunea cu proteina SFPQ . În stânga, vizualizările browserului genom al profilurilor ARN-SEQ pentru gena de reținere a intrigăi SFPQ în probele de control și VCP MU în etapele IPSC, NPC și PMN. Intronul de 9 kb 9/9 de interese este indicat de o cutie galbenă. În dreapta, graficele de bare care cuantifică procentajul de a merge pe parcursul timpului în controlul controlului și VCP MU (Mean ± SD; Testul numărului Fisher). B Bar Grafică care prezintă niveluri SFPQ IR măsurate de QPCR; Baruri albe = controale, bare negre = VCP MU. Nivelurile de a merge la fiecare moment de timp au fost comparate cu cele ale etapei IPSC a aceluiași grup. N = 3 linii de control și linii N = 4 VCP (media + sd * p < 0.05, ** p iv id = „200d958f0f” 0.01, anova mod cu corecția DUNNET pentru mai multe comparații). C Bar Graphics Afișarea procentului de SFPQ IR pentru FUS MU sau SOD1 MN în control (Mediu ± SD, Testul numărului de pescuit). D graficele de bare reprezintă nivelul de îmbogățire în legarea RBP la intronul reținut comparativ cu intronii care nu sunt reținuți în aceeași genă; Barble BLUE = gena SFPQ, bare verde = Gen Fus. E – V Vezi browserul genom al evenimentelor de reticulare ECLIP SFPQ de-a lungul adnotărilor de transcriere ale SFPQ și FUS. Picturile gri evidențiază locația intronalelor reținute. G Bar Graphics Afișarea nivelului de localizare nucleară și citoplastică a transcrierilor măsurate prin QPCR.Nivelurile de desfășurare a fiecărei fracții au fost comparate cu cele ale fracției nucleare a controlului IPSC. N = 3 linii de control și n = 4 linii VCP, Media + Valoare SD P ANOVA cu două căi cu corecția takey pentru mai multe comparații. H SPFQ Localizarea subcelară determinată de imunocitochimie în IPSCS, NPC și PMN. Proporția intensității medii a colorării SFPQ în miezul (N) față de citoplasma (C) a fost determinată automat în celulele MU Ctrl și VCP. Datele afișate sunt raportul N / C (± SD) pe câmp de viziune a patru linii de control și patru linii MU VCP. Valoarea testului T nu este asociată cu corecția lui Welch. A se vedea și fig. și Fus 36, 37. Clasificarea acestor RBP-uri datorită proporției evenimentelor de reticulare în cadrul intronării în comparație cu intronii care nu sunt reținute în aceeași genă a arătat că SFPQ și HNRNPM sunt cele mai îmbogățite RBP-uri (Fig.5d-F și Fig.7A suplimentar). Acest lucru indică faptul că proteina SFPQ este direct atașată la intronele SFPQ și Fus reținute.

La descoperirea dovezilor de interacțiuni dintre proteina SFPQ și intronul 9/9 din SFPQ, încercăm să înțelegem natura acestei interferențe . Schimbările în IR nu sunt însoțite de o diferență semnificativă statistic în nivelurile de expresie ale genelor sau proteinelor dintre VCP MU și eșantioanele de control (fig.7b, c). În schimb, folosim fracționarea citoplasmatică nucleară și identificăm o abundență statistic mai mare a izoformei de retenție INTRON SFPQ în citoplasmul MU VCP în comparație cu culturile de control (Figura 5 g). Aceste constatări au condus la investigarea distribuției subcelulare a proteinei SFPQ. Noi găsim o pierdere nucleară modestă, dar statistic semnificativă a proteinei SFPQ în culturile VCP MU (figura 5H).

În rezumat, cea mai semnificativă creștere a trecerii prin VCP, FUS și SOD1 este văzută în transcriere de SFPQ. Această secvență intronă este larg legată de proteina SFPQ și ambii membri ai acestui complex (adică proteina și transcrierea de reținere introni) prezintă o distribuție a celulelor aberante.

pierderea nucleară a SFPQ prin familia ELA și sporadicul

Având o scădere a abundenței nucleare a proteinei SFPQ în diferențierea culturilor IPSC, sa încercat să testeze generalizarea acestei constatări prin intermediul modelelor transgenice al paginii in vivo și țesutul uman post mortem de cazuri sporadice ELA. În acest scop, am examinat mai întâi două modele transgenice de ALS de șoarece, inclusiv SOD1 G93A și VCP A232E. Folosind această abordare, demonstrăm pierderea nucleară a proteinei SFPQ a măduvei spinării cu ambele mutații genetice legate de ALS (figura 6a). Prin urmare, pierderea nucleară a proteinei apare în diferite forme genetice ale ELA, care se știe că prezintă proteinopatie TDP43 (VCP MU) și cei care nu (SOD1 MU). Menționând că 90% din cazurile ELA nu sunt familiare, examinăm apoi țesutul post-mortem al măduvei spinării din cazurile ELA ale oamenilor sporadice. De fapt, demonstrăm o pierdere nucleară surprinzătoare a proteinei SFPQ în epoca sporadică umană, comparativ cu țesuturile normale de control, care subliniază relevanța mai largă a acestei constatări (figura 6b). Din aceste rezultate, ajungem la concluzia că pierderea nucleară a proteinei SFPQ este o etanșare distinctivă prin diferite modele in vitro și in vivo care reprezintă AL-uri familiare și sporadice.

DIV ID = „724AA78C71”>iv id = „5C7400AD75”

Debugging nuclear de la SFPQ este un sigiliu molecular al AL genetic și sporadice. Analiza locației subcelulare a SFPQ în Mn în măduva ventrală a șoarecilor de tip sălbatic, VCP A232E și SOD1 G93A. Citoplasma MN a fost identificată prin colorarea de chat, nucleele au fost contrastează cu DAPI. Datele prezentate sunt proporția nucleară / citoplasmică (N / C) (media ± SD) pe celulă de trei șoareci SOD1 G93A și 3 VCP A232E de tip sălbatic. Scala bar: 20 μm. P- Welch t valori de testare pe o parte. Celulele individuale de animale din fiecare condiție au fost grupate după excluderea efectului șoarecilor individuali prin compararea modelelor liniare complete (boală și factorul individual) cu modele liniare reduse (numai bolii) utilizând criteriile de informare ale lui Akaike. B Analiza localizării subcelulare a SFPQ în Mn în măduva spinării ventrale de controale sănătoase și pacienți cu Sporadic ELA (Salls).Citoplasma MN a fost identificată prin colorarea de chat, nucleele au fost contrastează cu DAPI. Numai MN cu un nucleu vizibil au fost luate în considerare pentru analiză. Scala bar 50 μm. Datele afișate sunt un raport N / C (media ± SD) pe celulă de trei cazuri pe grup

Imagine de dimensiune completă

Discuție

Obiectivele acestui lucru Studiul a fost dublu: (i) rezolvarea evenimentelor alternative de prelucrare a ARN care stau în diferite etape ale restricției MN și (II) a mecanismelor patogene primare între formele divergente patologice ale ELA (adică, cu sau fără proteinopatie TDP43). Pentru a realiza acest lucru, vom integra diferențierea direcționată a IPSCS specifice pacientului în Mn. Espineles cu secvențiere ARN și examinare bioinformatică completă. Arătăm că un program de joncțiune solidă stă la baza dezvoltării MN, așa cum este rezumată în figura 6a. Prin rezolvarea naturii precise a programelor post-transcripționale secvențiale care stau la baza diferitelor etape ale diferențierii MN, ne dezvăluim că timpul acestor evenimente moleculare coregrafice cu atenție este deranjat de mutația VCP cauzată de ALS. Atunci când analizați mostrele MN legate de ALS suplimentare, arătăm, de asemenea, că istoria genelor ALS, cum ar fi SOD1 și FUS, afectează structura de transcriere a regulatoarelor de îmbinare a ARN-ului într-o manieră similară cu obiectivele programului de îmbinare aberant în probele VCP. În plus, arătăm că un regulament la declinul global al componentelor de îmbinare coincide cu defecte de îmbinare. Această „slăbire” a mașinilor de îmbinare oferă o explicație plauzibilă pentru IR aberant pe care îl găsim în ALS legat de mutația VCP, SOD1 și FUS. Transcrierea SFPQ prezintă intronul reținut mai semnificativ, la care este atașată avid proteina SFPQ, oferind dovezi de interacțiune directă între proteină și transcripția care păstrează intronul. De asemenea, arătăm că transcrierea de reținere intronică SFPQ este exportată în citoplasmă. Acest lucru se întâmplă într-o mai mare măsură în mutația VCP care coincide cu programul Aberant IR. Acest lucru ne-a determinat să examinăm locația celulară a proteinei SFPQ, care a descoperit pierderea nucleară în ALS. SFPQ codifică un regulator cheie de localizare și dezvoltare axonală a ARNm 38. Împreună, aceste rezultate prezintă ideea că structura de transcriere dereglementată poate juca un rol-cheie în degenerarea axonală în timpul dezvoltării ELA. De fapt, SFPQ se dezvoltă ca un regulator cheie al neurodegenerării mai larg 34, 38, 39, 40.

Schimbări dinamice AS au fost informate anterior în forelebrainul de rozătoare între diferite etape de dezvoltare 41, 42 . Aici am identificat modificări care nu au fost recunoscute anterior în structura de transcripție genică care reglementează prelucrarea ARN și îmbinarea în stadiile inițiale ale restricției de linii umane MN (Figura 7A). Arătăm că o remodelare maximă a lui 3 ‘UTR, inclusiv scurtarea lui 3’ UTR, precede să meargă. În mod specific, există o variație statistic semnificativă de 3 „care afectează structurile transcrise, deoarece celulele au ieșit din pluripotenență în timpul inducției neuronale. Acest lucru precede vârful acumulării de transcriere de reținere intronică care este produsă în modelul neuronal al măduvei spinării ventrale. După aceasta, prelungirea progresivă progresivă în 3 ‘, includerea exonelor de casete și a îmbinării în intron caracterizează fazele rămase ale diferențierii terminalelor față de MNS așa cum este prezentat anterior 1, 6.

iv id = „5C7400AD75”

Schema schematică a modelului propus. O caricatură care rezumă cursul temporar al evenimentelor post-transcripționale care stau la baza neurogenezei motorii umane în probele de control și VCP MU. Rezultatele noastre sugerează că evenimentele predominante de prelucrare a ARN într-un stadiu incipient al diferențierii neuronale sunt IR și remodelarea 3 ‘UTR. Aceste evenimente încep prematur în probele VCP MU, dar nu afectează principalele programe de transcripție care stau la baza diferențierii MN umane. Caricatura B care rezumă consecința funcțională a unui IR aberant în gena SFPQ prin diferite forme genetice și sporadice de ALS. Intron 9/9 din 9 KB în SFPQ este păstrat în toate fondurile Mutant ale ALS, ceea ce duce la o abundență citoplasmică mai mare a transcrierilor afectate. Proteina SFPQ este atașată pe scară largă la intratrul reținut. Proteina SFPQ în sine este relocată din nucleu la citoplasmă în toate fondurile mutante ale ALS, precum și în probele post-mortem de pacienți sporadici cu ELA.

Imagine cu dimensiune completă

UTR în funcții de redare de 3 „în reglarea expresiei genetice post-transcripționale și MRNA exprimate în țesuturile cerebrale au în general URT în 3” mai mult în comparație cu Alte țesuturi 12, 13. De fapt, se observă o prelungire progresivă a UTR de 3 ‘pe parcursul dezvoltării embrionare a șoarecelui 29. Aici observăm o variație extinsă a lungimii URT în timpul inducției neuronale a IPSCS umană. În mod neașteptat, găsim o scurtare tranzitorie de 3 ‘UTR care precede alungirea progresivă a 3’ UTR raportate anterior în timpul diferențierii terminale. Funcția moleculară a acestei scurbări rămâne neclară, deși alte studii raportează un rol potențial al UTR 3 „în formarea paraziților și a producției de pluripotență 43, 44. Natura extrem de tranzitorie a acestui proces de reglementare poate explica de ce a evitat detectarea experimentală până în prezent. Designul nostru experimental rezolvat în timp a permis identificarea programelor transversale secvențiale care stau la baza neurogenezei motorii umane.

Going devine un nou mecanism post-transcripțional care reglează expresia genei. Tipurile de celule neuronale și imune au proporții mai mari de intronse reținute comparativ cu alte țesuturi 7. Studiile anterioare au arătat progresivi în timpul diferențierii terminale a neuronilor mouse-ului și relevanța transcrierilor care păstrează intronul în reglarea genelor specifice de neuroni legați funcțional în modelele de șoarece 6, 7. Aici oferim dovezi ale unei creșteri tranzitorii în transcrierile de reținere intronale în etapa PMN care este direcționată către o rețea de reglementări de protecție. Prin recunoașterea interacțiunii dintre evenimentele IR și paraștele nucleare, aceasta ridică posibilitatea ca aceste transcrieri să contribuie la stabilizarea paraspeților sau care sunt dinamate dinamic în structurile nucleare menționate pentru a-și inhiba funcția. Experimentele viitoare vor determina stabilitatea și locația unor astfel de transcrieri cu o variație de lungime de 3 ‘UTR. Interesant este faptul că regulatoarele cheie de îmbinare a ARN selectate de programul de joncțiune Aberrante din probele VCP MU au arătat, de asemenea, un IR larg în MN care port mutații în alte gene care cauzează ELA, inclusiv SOD1 și FUS. În special, am observat o expresie redusă a componentelor cheie ale îmbinării, coincide cu un IR aberant în VCP, SOD1 și FUS. Acest lucru este în concordanță cu un studiu recent care arată asocierea dintre IR și recrutarea redusă a factorilor de îmbinare 45. Deși programul comun aberant din probele VCP MU ar putea fi legat de degenerarea neuronală, lipsa modificărilor în programele transcripționale asociate cu neurogeneza motorii indică faptul că disfuncțiile din procesarea IR și sfârșitul 3 „nu afectează dezvoltarea fundamentală neuronală. Aceste constatări ridică împreună ipoteza că IR aberant reprezintă demonstrații subtile ale unui mod derogat de a dezvolta neuroni, care în cele din urmă contribuie la vulnerabilitatea mai mare a MNA mature.

transcrierea de reținere a intronului mai semnificativ prin modelele VCP MU semnificative prin modelele VCP MU , SOD1 MU și FUS MU IPSC a fost SFPQ, care codifică o proteină care efectuează funcții cheie în căile de ieșire legate de ELA, inclusiv transcrierea ARN, splicing, prelucrarea finală 3 „și viabilitatea axonului 32, 33, 34. Experimentele ulterioare au arătat că transcrierea de reținere intră este mai abundentă în citoplasma VCP MU comparativ cu omologii de control și coincide cu scăderea nucleară a proteinei SFPQ. De asemenea, constatăm că proteina SFPQ este atașată pe scară largă la intratrul reținut. Autoreglementarea dintre proteinele de legare a ARN (RBPS) (de exemplu, TDP43) este recunoscută și, prin urmare, această constatare este în concordanță cu literatura anterioară 46, 47. Într-un mod crucial, găsim pierderea nucleară a proteinei SFPQ pe ambele modele transgenice de SOD1 și VCP mouse-ului și în cablul sporadic sporadic post mortem, sugerând că aceasta reprezintă o etanșare moleculară a ALS. Prin urmare, propunem ca interacțiunea dintre proteina SFPQ și transcripția acestuia care să păstreze intronul impune co-locația aberantă în citoplasmă (figura 7b).Abundența redusă a proteinei nucleare SFPQ poate afecta îmbinarea înainte de ARNm, ceea ce ar putea contribui la defectele post-transcripționale pe care noi și altele le-am identificat în ALS 48, 49. Luate împreună, constatăm că IR în transcrierea SFPQ și pierderea nucleară a proteinei SFPQ sunt caracteristici moleculare comune în diferite forme genetice și sporadice de ALS.

Declarația de etică

Consimțământul informat a fost obținut de la toți pacienții și controalele sănătoase din acest studiu. Toate protocoalele experimentale au fost efectuate în conformitate cu regulile și liniile directoare aprobate de Comitetul Național de Etică de Cercetare a Spitalului Național de Neurologie și Neurochirurgie al UCLL și Institutul de Neurologie al UCL (09/0272).

Derivarea fibroblastelor umane și IPSC

Fibroblastele dermale au fost cultivate în Optimem + FCS la 10%. Următoarele plasmide episomale au fost transfectate pentru generarea IPSC: PCXLE HOCT4 SHP53, PCXLE HSK și PCXLE HUL (ADGENE), așa cum a fost raportat anterior. Detaliile liniilor utilizate în acest studiu sunt furnizate în tabelul suplimentar 1. Două dintre liniile de control utilizate (controlul 2 și controlul 3) sunt disponibile în comerț și achiziționate de la Corell (ND41866 * C de catalog) și TermoFisher Scientific (Cat nr . Numărul A18945), respectiv.

Cultura celulară

PSC indus au fost menținute în Geltrex (Tehnologii Life) cu un mediu esențial (tehnologii de viață) și au trecut utilizând EDTA (Tehnologii Life , 0, 5 mm). Toate culturile celulare au fost menținute la 37 ° C și 5% dioxid de carbon.

diferențierea neuronului motor

Diferențierea Mn a fost efectuată utilizând o versiune adaptată a unui protocol 19 publicat anterior. Pe scurt, IPSC-urile diferă pentru prima dată în Neurepiteliu prin placare la 100% confluență în mediu definit chimic constând din DMEM / F12 Glutamax, neurobasal, L-glutamină, N2 supliment, aminoacizi neesențiali, supliment de b27, β- mercaptoetanol (toate tehnologiile vieții) și insulina (Sigma). Tratamentul cu molecule mici din ziua 0 la 7 a fost după cum urmează: dorsomorfină 1 μm (millipore), sb431542 2 pm (bioscience torris) și Chi99021 3, 3 μm (Miltenyi Biotec). În ziua 8, stratul neurepitelial a fost dizolvat enzimatic utilizând dispusul (Gibco, 1 mg ML-1), a fost plasat în foi acoperite cu laminină și apoi modelate timp de 7 zile cu acid retinoic 0, 5 pm și 1 pm purmorfamină. În ziua 14, precursorii măduvei spinării MN au fost tratate cu purmorfamină 0, 1 μm timp de 4 zile mai mult înainte de diferențiate terminale în timpul

10 zile în compusul E 0, 1 μm (Enzo Life Științe) pentru a promova ieșirea ciclului celular. La punctele de timp relevante, celulele au fost colectate pentru extracția ARN sau au fost fixate în paraformaldehidă 4% pentru imunomarcaje.

extracția ARN și secvențiere

Kitul celulelor RNA simple din Promega Maxwell RSC care include tratamentul cu Adnasa, împreună cu instrumentul Maxwell RSC, a fost utilizat pentru extracțiile ARN. Pentru validările QPCR, ARN-ul a fost extras cu Kitul Rneasy Plus Mini (Qiagen). Nanodrop a fost utilizat pentru a evalua concentrația ARN și raportul de 260/280, iar bioanalizerul agilent a fost utilizat pentru a evalua calitatea. Scorurile integrității ARN (RIN) au fost > 8 pentru toate probele utilizate în această lucrare. Bibliotecile RnASEQ au fost preparate utilizând kitul ARNm împletit cu 1 μg cu 1 μg de intrare din ARN poli (A) +. Apoi, produsele au fost purificate și îmbogățite cu amplificare PCR pentru a crea bibliotecile finale de cADN. Bibliotecile au fost trimise pentru o secvențiere de înaltă performanță, au fost executate pentru 75 de cicluri într-o celulă de curgere rapidă, în instalarea centrală a NGS de la Institutul de Neurologie folosind HISEQ2500. Pentru analiza transcrierilor nucleare și citoplasmatice, s-a utilizat setul de purificare a ARN citoplasmic și nuclear (NORGEN BIOTEK CORP) de 50 bp din cinci etape, altele decât diferențierea MN a probelor de control și VCP MU (IPSC și Zilele 7, 14, 21 și 35); Probele sunt enumerate în datele suplimentare 1. Numărul de acces al expresiei genei omnibus (GEO) pentru bibliotecile ARN-SEQ este GSE98290.De asemenea, am obținut secvențierea ARN cu un singur și pereche, derivată din două studii independente privind diferențierea neuronală in vitro a HESCS (GSE20301 22 și GSE86985 23); Două studii independente privind formele familiale de ALS, fie cauzate de SOD1A (N = 5, 2 probe derivate din pacient derivate din pacient, în care mutația a fost corectată; HB9 FACS purificat MNS, GSE54409 27 sau FUS (n = 6; 3 Fus R521G Fus R521G și 3 Sibling Health Controls MNS, GSE77702 28; Două date ARN-SEQ de la ESM umane împărtășite de MIHA Modic; Două spmn fetale (E-MTAB-3871, NIH Foodmap Epigenomics Consortium de mapare) și spmn adult (laser -Prmtured spmn; GSE76514 53) eșantioane.

Date de exprimare Pre-procesare

Citește unică și pereche pentru fiecare studiu au fost aliniate inițial la secvențele de ARN ribozomale pentru a filtra citirile care pot proveni din contaminarea RNN ribozomală folosind Bowtie2 (-V 0) 57. Citirile rămase au fost aliniate la genomul uman (H19) folosind Ailgerul de îmbinare Aware2 58 cu parametrii impliciți. Toate bibliotecile generate în acest studiu au avut < 1% RRNA, 90% Stranceaness și > 70% exon IC citește.

Cuantificarea genei și caracterizarea nesupravegheată a setului de date

Cuantificarea absolută a genelor a fost efectuată utilizând numărul HTSEQ 59. Analiza ulterioară a fost efectuată cu pachetul statistic R versiunea 3.3.1 (2016) și bibliotecile Bioconductor Versiunea 3.3 (echipa de bază. R: o limbă și un mediu pentru calculul statistic. Viena, Austria: R Fundația pentru computere statistice; 2013).

Înainte de analiza de grupare nesupravegheată a celor 31 de probe de diferențiere MN, am identificat gene exprimate în mod fiabil pentru fiecare condiție (VCP MU sau control în zilele 0, 7, 14, 21 și 35). Pentru un eșantion dat, histograma numărătoarei genei Log2 este, în general, Bimodal, cu modurile corespunzătoare genelor ne-exprimate și exprimate. Genele exprimate în mod fiabil au fost identificate prin montarea unui amestec Gaussian cu două componente la datele de gene estimate de numărare a Log2 cu pachetul R cu pachetul R. O genă a fost considerată a fi exprimată în mod fiabil într-o anumită condiție dacă probabilitatea de a aparține clasei necompresate a fost sub 1% în fiecare probă aparținând condiției. 15, 989 de gene au fost selectate pe baza expresiei lor detectate în cel puțin una dintre cele 10 condiții (adică cinci timpi diferite de restricție a liniei de control și VCP MU). Apoi, n-am normalizat cuantile coloanele matricea de numărare a genei cu pachetul R Lima 61. Clusterizarea ierarhică nesupravegheată a matricei de gene filtrate și normalizate a fost efectuată cu corelație de rang Spearman ca o măsură de distanță și algoritm de clustering complet.

Am efectuat SVD-ul expresiei celor 15, 989 de gene în cele cinci etape distincte de diferențiere MN de la controalele sănătoase și VCP MU. Apoi, am selectat componentele de captare maximă a varianței în expresia genică. Pentru a vizualiza vectorii singulari drepți \ (\ stânga \ {{\ anverryarrow v {{\ dreapta \} \), am reprezentat expresia pe axa verticală ca funcție a timpului corespunzător fiecărui probă de pe axa orizontală și de colorat toate Eșantioane corespunzătoare controlelor sănătoase gri și cele corespunzătoare VCPMU în Magenta. Apoi am identificat genele ale căror profiluri de expresie au fost corelate (corelația Pearson între profilul individual de expresie a genei și vectorii singulari singulari) și au contribuit (proiecția fiecărui profil de expresie a genei individuale pe vectori singuri singulari) cel mai puternic (fie pozitiv sau negativ) cu profilul de expresie al vectori singulari. Pentru a identifica genele reprezentative pentru fiecare vector singular, genele au fost clasate în funcție de scorurile de proiecție și corelație. Cele mai mari (cele mai multe scoruri pozitive atât în proiecție și corelație) și cele mai scăzute (cele mai negative scoruri în ambele gene de corelație și proiecție) au fost selectate pentru fiecare vector singular folosind grupul K-mediu pentru analiza îmbogățirii Go în aval.

Analiza analizei. APA din APA din ARN-SEQ

Pentru identificarea identificării URT alternative de la ARN-SEQ, acoperirea catenei nucleotide a fost obținută pentru fiecare dintre cele 31 de probe care utilizează Genomecov din suita de pace 62. Următoarele regiuni transcrise continuu au fost identificate utilizând o fereastră glisantă în genomul care necesită o acoperire minimă de șapte citește în mai mult de 80 de poziții pe fereastră de 100 bp; Regiunile învecinate separate de regiuni reduse, au fost fuzionate după cum s-a descris anterior 13. Fragmentele exprimate au fost apoi asociate cu suprapunerea 3 ‘UTR utilizând cele mai recente versiuni HG19 ENSEMBL V75 63.Regiunile exprimate izolate care nu au suprapus cu nicio caracteristică au fost asociate în continuare cu cel mai apropiat 3 ‘UTR dacă (1) cea mai apropiată caracteristică adnotată nu a fost altceva decât un 3’ UTR, (2) dacă firul regiunii exprimate a fost în concordanță cu Strandul celui mai apropiat 3 ‘UTR și (3) dacă distanța față de UTR 3 „a fost mai mică de 10’000 kB, care este intervalul de distanță intragenică. UTR-urile 3 „extinse rezultate au fost supuse unei filtrări extinse pentru a exclude transcripția potențială intragenică, transcrierile suprapuse și intronele reținute, așa cum s-a descris anterior 13. În cele din urmă, am intersetat cel mai lung segment UTR cel mai lung cu datele ARN-SEQ cu o adnotare a site-ului Poly (A) construită ca urmare a bibliotecilor de secvențiere de 3’-capăt în probele umane 64 pentru a obține Poly (A) putativ în cel mai lung segment 3 ‘UTR din fiecare transcriere.

Am folosit apoi numărul de citiri mapate în regiunea terminală de -300 NT a fiecărei izoforme UTR 3 ‘ca un proxy pentru nivelul de expresie de izoform de 3’ UTR pentru a identifica modificările utilizării proximale și site-urile de poli (A) distal. Densitatea citirilor mapate în regiunea terminală de -300 NT a izoformei 3 ‘UTR este bimodală, cu un vârf de densitate redusă, probabil, corespunzător transcripției de fundal, adică 3’ uTR izoforme de abundență scăzută sau 3 ‘uTR izoforme la care au fost cartografiate spuiri, și un vârf de înaltă densitate care corespunde unei izoforme UTR exprimate 3 ‘. Pentru a identifica izoforme UTR exprimate în mod fiabil în studiu, un amestec Gaussian cu două componente a fost montat pe date utilizând pachetul R MCLUST 60; O izoformă a fost numită în mod fiabil dacă în ambele replici au avut șansa mai mică de 1% de a aparține categoriei de fundal.

Pentru a identifica transcrierile care prezintă o schimbare marcată în utilizarea site-ului Pol (A) între condiții , am marcat diferențele în utilizarea site-ului Poly (A) proximal-la-distal utilizând următoarele două scoruri:

\ (S_1 = {\ Mathrm {log}} _ 2 \ Stânga ({Fracc {{{ I {\ Mathrm} {{} {\ Mathrm {distal}}}}} \ dreapta) _ {\ Mathrm {COND1}} – {\ Mathrm {log}} _ 2 \ stânga ({\ frac { {I \ {\ Mathrm {proximal}}}} {}}}} {distal}}}}} \ dreapta) _ {\ MATHRM {COND2}} \)

\ (s_2 = \ frac {{_ {\ Mathrm {proximal}}} {{i _ {\ Mathrm {proxim}} {} {\ Mathrm {distal} {{{{}} {\ Mathrm {COND1}} – \ frac {{i _ {\ Mathrm {PROXIMAL}}} {{i _ {\ Mathrm {proximal}} + i} {\ Mathrm {distal}}} _ {\ Mathrm {COND2}} \ in \ stânga \)

Statistica Semnificația modificărilor în raportul situsului proxim-la-distal între două condiții a fost evaluat prin testul exact al numărătorului Fisher utilizând numerele de citere brute SumMard-up de promotor-proximal versu s promotor-distal 3 ‘uTR izoforme originare oricăreia condiții. Am ajustat controlul P -Value pentru rata de descoperire falsă (FDR) de 0,01. Ne-am restricționat analiza pe transcrierile ENSEMBL care conțin cel puțin două ferme 3 „generate de poliadenilarea tandem exprimată în condiții de interes. Schimbările proximale au fost apoi selectate atunci când \ (S_1 \ LE – 1 \), \ (S_2 \ LE – 15 \% \) și FDR < 0.01; Schimbarea distală a fost selectată când este selectată când \ (S_1 \ GE 1 \), \ (S_2 \ GE 15 \% \) și FDR < 0.01.

Splicing Analiza

Identificarea tuturor claselor de evenimente în diferențierea MN a fost efectuată cu ajutorul conductelor Vast-Instrumente de conducte ARN-SEQ 21. Pentru ca un eveniment să fie considerat reglementat diferențial între două condiții, am solicitat o medie minimă Δpsi (între replozele asociate) de cel puțin 10% și că transcrierea vizată de evenimentul de îmbinare în cauză este exprimat în mod fiabil în toate probele din toate probele Condiții comparate, adică acoperire suficientă citire în toate eșantioanele de interes. Apoi, am efectuat curația manuală a Genomics Integrative (IGV) pentru a elimina acoperirea scăzută IR obținând 167 de evenimente IR de înaltă încredere. Analiza focalizată IR a fost efectuată în continuare pe aceste 167 de evenimente IR pentru care un procent de IR a fost calculat pe măsură ce fracțiunea de cartografiere intron citește la numărul mediu de cartografiere la exonii adiacenți 5 ‘și 3’ normalizați la lungimea respectiv intron și exoni. Un test de numărare Fisher a fost obținut atunci când a fost obținută atunci când testarea pentru diferențe IR între condiții.

análisis diferencial de la expresión génica.

Pentru analiza expresiei genei diferențiale am fugit Kallisto 54 și am făcut-o 55 Kallisto a fost folosit pentru (1) construi un indice de transcriere din versiunea ENSEMBL GRC38 85 Homo sapiens transcriptome (-k 31), (2) Pseudo-alinign ARN-SEQ citește la transcriptome și (3) cuantificarea abundențelor de transcriere (-b 100-Single-L 275 -s 50-RF-blocat). Apoi, am identificat gene exprimate diferențial cu Sleuth. Analiza ulterioară a fost efectuată cu pachetul statistic R versiunea 3.3.1 (2016) și bibliotecile Bioconductor versiunea 3.3 (echipa de bază. R: o limbă și un mediu pentru computere statistice. Viena, Austria: R Fundația pentru computere statistice; 2013). Înainte de a selecta gene exprimate diferențial, am identificat gene exprimate în mod fiabil.Kallisto rezultă abundența de transcriere și, astfel, am calculat abundența genelor prin însumarea numărului brutal estimat al izoformelor constitutive pentru a obține o singură valoare pe genă. Pentru un eșantion dat, histograma numărului de gene / transcriere a log2 este, în general, Bimodal, cu modurile corespunzătoare genelor ne-exprimate și exprimate. Genele / transcripturile exprimate în mod fiabil au fost identificate în continuare prin montarea unui amestec Gaussian cu două componente la tripsul estimat al numărării log2 și a datelor genei R cu pachetul MClust 60; A fost adăugată o pseudocount de 1 înainte de transformarea log2. O genă a fost considerată a fi exprimată în mod fiabil într-o anumită condiție dacă probabilitatea de a fi aparținând clasei exprimate a fost de peste 0,1 în fiecare probă aparținând condiției. În cele din urmă, genele care au arătat o expresie diferențială dublă logică și un P -Value < 0,05 și care au fost exprimate în mod fiabil în mutant VCP sau în stare de control au fost considerate ca schimbări semnificative.

Analiza îmbogățirii

Go Enrichment

GO ANALIZAREA ENCHIMENT-ului a fost efectuată utilizând testul Clasic Fisher cu pachetul Bioconductor Topo 65. Au fost luate în considerare numai termenii care conțin cel puțin 10 gene adnotate. A -Value de 0,05 a fost folosit ca nivel de semnificație. Pe cifre, termeni importanți de top au fost selectați manual prin eliminarea termenilor și termenilor redundanți care conțin mai puțin de cinci gene semnificative.

análisis de roșu

Informații despre interacțiunea experimentală proteinei proteinei S-a preluat din baza de date a șirului 66 și vizualizată în CytSosape 67, 68.

Maparea datelor ECLIP

Datele brevete de eclips au fost descărcate de la cododul 36, 37. Înainte de aliniere, îndepărtarea adaptorului în două etape a fost efectuată utilizând CUTADADAPT în conformitate cu procedura de operare standard ECLIP ECLIP. O abordare în două etape a fost utilizată și pentru aliniere. În primul rând, Bowtie2 a fost folosit pentru a elimina Citirile de aliniere la RRNA sau TRNA. Apoi, steaua a fost folosită pentru a alinia restul citește la GRCH38, cu doar cartografiere unică reținută. Duplicatele PCR au fost prăbușite pe baza identificatorilor moleculari unici și a locațiilor de cartografiere. Poziția transversală a nucleotidelor a fost calculată ca coordonate imediat precedentă evenimentului de trunchiere inversă Kitul de sinteză al cADN (ThermoFisher Scientific) utilizând 1 μg de ARN total și hexameri aleatorii. QPCR a fost efectuat utilizând PowerUP Sybr Green Master Mix (ThermoFisher Scientific) și sistemul AGILENT MX3000P QPCR sau sistemul PCR PCR Quantstudio 6 Flex (aplicate biosisteme). Grundurile utilizate sunt enumerate în tabelul suplimentar 2. Amplificarea specifică a fost determinată prin analiza curbei topiturii și electroforeza gelului de agaroză a produselor PCR. Au fost utilizate perechi de primeri cu o eficiență de 90-110%. Pentru fiecare validare IR la ecran au fost utilizate trei perechi de primeri: (1) pereche de primeri F1 R1 (Intron spanging, peste exon-exon joncțiune) au fost utilizate pentru a analiza nivelurile de expresie genetice; (2) pereche de primeri F2 R2 (un primer pe un exon care flanking intronul care urmează să fie analizat, celălalt pe intron) a fost utilizat pentru a evalua nivelurile de IR; și (3) pereche de primeri F3 R2 (ambii primeri de la exoni care flanking intronul de interes, dacă este posibil, proiectați în timpul joncțiunii exon-exon), au fost folosite pentru a măsura nivelurile transcrierii splice. Eșantioanele RT-minus au fost utilizate ca controale negative. Nivelurile de IR (perechea de primer F2R2) au fost normalizate peste nivelul de expresie al fiecărei gene individuale (pereche de primeri F1R1). Nivelurile de exprimare a genei au fost măsurate utilizând metoda DDCT utilizând trei gene de menaj (GAPDH, POL2B și UBE2D3).

Analiza ciclului celular a fost efectuată prin citometrie de flux în funcție de protocoale standard. Pe scurt, celulele au fost disociate utilizând fie accuza sau tripsină (tehnologii de viață), spălate și fixate în suspensie utilizând etanol rece 70%. Celulele au fost colorate folosind iodură de propidiu (PI, 50 pg ML -1, Sigma Aldrich) în prezența Rnaza A (10 μg / ml, Sigma Aldrich). Celulele au fost analizate utilizând un calibur BD FACS (BD Bioscience). Umpletele au fost excluse din analiză și 10 000 de evenimente au fost colectate în poarta unică pe eșantion. Datele ciclului celular au fost analizate utilizând modulul multiciclu al FCS Express 6 (software-ul de novo).

Animale, modele transgenice și prelucrare a țesutului

Toate experimentele animale descrise în acest studiu au fost efectuate În conformitate cu licența din partea Oficiului Home din Marea Britanie și au fost aprobate de comisia de revizuire etică a Institutului de Neurologie. Au fost utilizate următoarele linii de șoarece transgenice: (1) șoareci de SOD1 G93A (B6SJL-TG (SOD1 * G93A) 1Gur / J, Jackson Laboratories) (2) VCPA232E umane care exprimă în exces au fost generate de J. Paul Taylor și colab., St, St Spitalul de Cercetare pentru Copiii Jude, Memphis, TN, SUA și sunt descrise în Custer et al, 2010 69 și crescute la fundalul C57 Black 6 (C57 / B6).Fundal mixt de tip C56BL / 6-SJL (Jackson Laboratories) au fost utilizate ca control. Pentru colectarea țesuturilor, animalele au fost injectate cu anestezie terminală (pentobarbital sodiu, Euthatal) și au fost perfuzate transcardial cu paraformaldehidă 4%. Regiunea lombară a măduvei spinării a fost îndepărtată și fixată după 4% paraformaldehidă și crioproted peste noapte cu o zaharoză 30%; 10 sau 20 μm cryosecții transversale seriale au fost tăiate pentru colorarea imunofluorescenței.

țesut post-mortem uman

secțiuni de țesut congelate derivate derivate din corzile spinării lombare de trei vârstă și sex Pacienții sporadici ai ALS, Durata bolii 1, 2 și 2 ani, respectiv trei subiecte de control asociate cu vârsta de vârstă și sex, fără antecedente de boală neurologică (n = 3 pacienți și 9 secțiuni; mijloace de vârstă: 68 + 6,55 și 69,5 + 2,12 ani ; a se vedea tabelul suplimentar 3). Moartea la timpul de întârziere a înghețului de înghețare au fost, de asemenea, comparabile între grupuri (întârzierea: 25 + 5,29 și 29,33 + 9,29 ore, pentru pacienții cu control și sali, respectiv). Probele de măduvă spinării au fost obținute din banca de țesut Neuroresource, UCL Institutul de Neurologie, Londra, Marea Britanie. Eșantioanele au fost donate băncii de țesuturi cu donator scris cu țesuturi scrise în urma revizuirii etice de către Comitetul NRS NRES din Londra – Central și depozitat în cadrul unei licențe din sectorul cercetării din partea Autorității de Țesut Umane din Marea Britanie (HTA).

H2> Immunolabeling și Imaging

Pentru imunocitochimie și imunohistochimie, eșantioanele au fost blocate în ser normal de capră normală (NGS) sau 10% serii normală de măgar (ND), după caz și permeabilizat în 0,3% Triton X-100 (Sigma-Aldrich; în PBS) la temperatura camerei (RT) timp de 1 oră. Immunolabeluirea a fost efectuată cu anticorpi primari în NGS (5%) și Triton X-100 (0,1% în PBS) la 4 ° C peste noapte, urmată de anticorpi secundari specifici specifici timp de 1 oră la RT și DAPI Counter-ul nuclear (100 ng / ml) timp de 10 minute la RT. Pentru fixarea probelor post-mortem umane și permeabilizarea în metanol rece (-20 ° C, 20 min) a fost efectuată înainte de imunostinanță. Anticorpii primari au fost diluați după cum urmează: Rabbit anti-olig2 (Millipore, AB9610) 1: 200; Mouse Anti SMI32 (Bioscience Cambridge, SMI-32R-500) 1: 1000; Goat Anti Chat (Millipore, AB144P) 1: 100; Rabbit anti pax6 (BiolEgend, 901301) 1: 300; Mouse și iepure Anti SFPQ (ABCAM, AB11825 și AB38148, respectiv) 1: 100; Mouse și iepure anti-beta-tubulinei (BiolEgend, 801201), anti-limi de șoarece (DSHB, 67.4E12) 1:50; Pui anti NKX2.2 (DSHB, 74,5A5) 1:50. Imaginile au fost achiziționate utilizând fie un microscop de scanare cu laser de 710 (Zeiss), fie sistemul de screening de înaltă conținut de operă (Perkin Elmer). Pentru analiza imaginilor, Fiji sau sistemul de analiză a imaginilor Columbus (Perkin Elmer) au fost utilizate.

Western blotting

Western blotting a fost efectuat conform protocoalelor standard (Biorad). Lizatele de celule întregi au fost obținute din pelete de celule înghețate folosind tamponul de liză fără lysis-M complet (Roche). Concentrația proteinelor a fost determinată de testul Pierce BCA (ThermoFisher Scientific) și utilizat pentru a maximiza încărcărea egală pe geluri (~ 9 μg per bandă). Electroforeza a fost executată pe un gel de proteină de 4-12% XT BIS-TRIS (Biorad) la o tensiune constantă (200 V, o oră) și urmată de transferul de proteine la o membrană de nitroceluloză (Biorad). Blocarea a fost efectuată în PBS, 0,1% Tween, praf de lapte uscat de 5% (minut) la temperatura camerei timp de o oră urmată de incubarea anticorpului primar peste noapte la 4 ° C. Anticorpii primari au fost diluați în PBS, 0,1% Tween, praf de lapte uscat 5% după cum urmează: Mouse Anti SFPQ (ABCAM, AB11825) 1: 250; Rabbit anti TLS / FUS (ABCAM, AB84078) 1: 500; Rabbit anti DDX39 (Sigma Aldrich, SAB2700315) 1: 500, Rabbit Anti DARRS (ABCAM, AB182157) 1: 1000; mouse-ul anti-GNN1 (anticorpi-on-line, aa 1-373) 1: 1000; Rabbit anti TDP-43 (ABCAM, AB133547) 1:10, 000; Mouse Anti Gapdh (Tehnologii Life 6C5, AM43000) 1: 5000. Pentru membranele de detectare au fost incubate cu anticorpi fluorescenți în apropierea speciilor (irdye, licor) timp de o oră la temperatura camerei și imaginea utilizând un sistem de imagistică Odyssey FC (Licor).

Disponibilidad de Datos

Numărul de aderare Geo pentru bibliotecile ARN-SEQ generate nou este GSE98290 (//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE98290). De asemenea, am obținut secvențierea ARN cu un singur și pereche, derivată din două studii independente privind diferențierea neuronală in vitro a HESCS (GSE20301 22 și GSE86985 23); Două studii independente privind formele familiale de ALS, fie cauzate de SOD1A (N = 5, 2 probe derivate din pacient derivate din pacient, în care mutația a fost corectată; HB9 FACS purificat MNS, GSE54409 27 sau FUS (n = 6; 3 Fus R521G Fus R521G și 3 Sibling SIBLING CONTROLS MNS, GSE77702 28; Două date ARN-SEQ de la ESC uman împărțite de MIHA Modic; două spmne fetale (E-MTAB-3871 Expresie Omnibus; NIH Foaia de parcurs epigenomică consorțiu; // www .ebi.ac.Marea Britanie / ArrayExpress / Experimente / E-MTAB-3871 /) și SpMMN adult (spmn capturat laser; GSE76514 52, 53) eșantioane. Informațiile și cererile suplimentare de resurse și reactivi ar trebui să fie direcționate și vor fi îndeplinite de contactul cu plumb, Rickie Patani ().

Expresiones de Gratitud

Autorii doresc să mulțumească pacienților pentru donații fibroblaste. Îi mulțumim, de asemenea, Miha Modic pentru partajarea datelor ARN-SEQ HEEC, Martina Hallegger și Roberto Simone pentru contribuția lor privind proiectarea primerilor, Anob M Chakrabarti pentru partajarea fișierelor de pat de date de eclipsă aliniate. Îi mulțumim lui Benjamin Clarke, Mhoriam Ahmed și membrilor laboratoarelor Schiavo și Greensmith pentru un suport tehnic valoros. Îi mulțumim lui Selina Wray pentru a oferi acces la liniile IPSC mutante VCP. Această lucrare a fost susținută de Institutul Francis Crick, care primește finanțarea centrală de la Cancer Research UK (FC010110), Consiliul Regatului Unit de Cercetare Medicală (FC010110) și Wellcome Trust (FC010110). Recunosc finanțarea Wellcome Trust la RP, la NML și JU, un premiu de infrastructură Medicală Medicală MRC EMEDLAB la NML (MR / L016311 / 1), UCL Grand Challenges Premiul (CEH), un Marie Curie Post-doctoral Fellowship (657749- Neuroutr) și o bursă avansată de mobilitate postdoc de la Fundația Națională de Științe Elvețiene (P300PA_174461) la RLNML este un lider al grupului Winton, ca recunoaștere a sprijinului Fundației Charitable Winton către înființarea Institutului Francis Crick. Recunoaștem platforma DPUK / MRC pentru furnizarea de Opera Phenix pentru analiza IPSC de mare viteză și suport generos de la Institutul Național de Cercetare a Sănătății University College din Londra Centrul de Cercetare Biomedical.

Material Supplemenario Electronico.

1. Información Suplementaria

2. Descripción De Arhivos Supramentarios Adicionales

3. DatOS suplemenarios 1