Analiza variației intraspecifice a Coronatus Conidiobolus utilizând secvențe RAPD și STS Bolile infecțioase și microbiologia clinică

AISLAMIENTOS usados en el Analisis RAPD.

AISLAMIENTOS usados en el Analisis sale.

AISLAMIENTOS obtenidos en Este estudio.

Las secuencias sa este obtuvieron en este estudio.

Las secuencias sale un obtuvieron del NCBI Genbank.

(100)

34 (70,83)

Ion inițial la 94 ° C pe unmin, urmată de 38 de cicluri de denaturare la 94 ° C timp de 30 s, hibridizare la 35 ° C timp de 30 s, și extensie la 72 ° C timp de 1,5 minute, urmată de o extensie finală la 72 ° C pentru 5 minute. Dimensiunea fragmentelor amplificate a fost estimată utilizând un marker de greutate moleculară de 1kb (Qiagen). În amplificarea fiecărui inițiator, radicanii Zoofthora (izolați din Plutella Xyllostella) și Cercospora Agavicola (izolate din Agave Tequilana) (figura 1), care nu au fost incluse în analiza datelor RAPD. Managementul acestor izolate (creșterea și extracția ADN-ului) este descris în Guzmán-Franco et al.15 și Ayala-Escobar et al.17.

Figura 1.

produse PCR cu inițiatorul RAPD A18 pe gelul de agaroză 1%. Lanes 1 și 10: markeri; Lanes 2-4: Lyco 1, 4 și 5; Lanes 5 și 6: Asef 512 și 1884; Lane 7: ATCC 32865; Lanes 8 și 9 martori (Z. Radicans și C. Agavicola); Lane 11-15: Personalul 4: 004, Personalul 15: 008, Personalul 10: 027, Personalul 1: 037, Personalul 04: 427.

Div>

(0.06MB).

iv id = „43db69a7d7”

benzile au fost considerate ca un caracter independent și au fost analizate vizual din fotografiile gelurilor de agaroză; Prezența a fost înregistrată cu 1 și absența cu 0. Cu aceste rezultate a fost construită o matrice binară în cazul în care polimorfismele au fost găsite de la fiecare dintre inițiatori. Din această matrice de similitudine și coeficientul de împerechere simplă, a fost construit un dendrogram; Pentru a genera și vizualiza relațiile NTSYS 2.0 a fost utilizat. Pentru a obține un dendrogram de o mai mare soliditate, au fost efectuate 1.000 de replici de bootstrap (BS) cu Winboot Inițiatori (5’gggaagtaaAgtcgtaacaaagg) și STS 4 (5’TCCCCCTTTTGATATATATTGC) 18. Amplificările au fost realizate în tuburi eppendorf de 0,5 ml și volumul final al eșantionului prin reacție a fost de 25 pl. Fiecare reacție conținea 2 pl de ADN (80ng / μl), tampon 10x, clorură de magneziu de 2,6 mm, 2,5 mm de fiecare DNTP (alegerea genei), 1,5 U / μl de polimerază Taq, 2 pl din fiecare inițiator (20pmol). Tuburile de martor au conținut apă distilată sterilă în loc de ADN.Programul de amplificare a fost un ciclu inițial de denaturare la 95 ° C timp de 5 minute, apoi 35 de cicluri de naturalizare la 95 ° C timp de 30 s, hibridizare la 50 ° C pe unmin, extensie la 60,3 ° C cu 1,5 minute și o extensie finală la 72 ° C pentru 5min. Dimensiunea fragmentelor amplificate a fost estimată utilizând marcaje de greutate moleculară de 1k și 100 pb.

Pentru a găsi diferențe la nivelul nucleotidelor dintre izolate, produsele PCR-STS au fost trimise pentru curățarea și secvențierea acestuia la Compania Macrogen (Coreea). Sequencingul a fost efectuat în ambele direcții utilizând inițiatorii universali 4 și 518.

Analiza datelor din regiunea sa

Cele 11 secvențe de STI au fost editate manual cu Bioedit și FINCTV 1.3. Alinierea secvenței multiple a fost efectuată cu Clusttal W. Secvențele au fost depozitate în Genbank NCBI (Tabelul 1). Pentru a construi un arbore filogenetic mai fiabil, în plus față de secvențele Coronatus obținute în acest studiu, s-au utilizat 3 secvențe de C. Coronatus și unul din trombooidele CNBI Genbank Conidiobolus (Tabelul 1).

selecția Dintre tromboidele C. ca grup extern a fost realizat dintr-o explozie (NCBI Genbank) cu cele 11 secvențe ale lui C. Coronatus și o analiză parsimonică, ale cărei rezultate au fost strâns legate de C. Coronatus, dar este diferită în regiunea sa.

cu Mega5 Un arbore filogenetic a fost construit cu metode de parsimonie maxime, vecin-îmbinare (NJ) și evoluție minimă; În ultimele 2 a fost utilizat modelul Tamura-NEI. Pentru a evalua încrederea relațiilor filogenetice; Soluția nodurilor a fost estimată de analiza BS cu 2.000 de replici.

Pentru a analiza în continuare diversitatea genetică a izolatelor, secvențele STI au fost grupate în funcție de substratul sau gazda: 1) insecte, 2) sol , 3) uman și 4) compost; Cu programul Mega5, un număr a fost un număr pentru a determina numărul de situri variabile din interiorul fiecărui grup și între toate grupurile, precum și regiunea în care au fost (Tabelul 3) (Tabelul 3). Pentru aceste 2 evaluări, grupul extern nu a fost luat în considerare.

div>

div id = „2E03E1CB0B”> id = „2E03E1CB0B”> Numărul de izolate

uman 0

RAPD

Inițiatorii selectați au amplificat 48 de benzi cu o variație polimorfă de 22 la 100%; Au fost obținute 34 benzi polimorfe, rezultând 70,83% din polimorfism; Au fost obținute 2 până la 9 benzi pe inițiator (Tabelul 2). Figura 1 prezintă modelele de tavă obținute prin amplificarea cu inițiatorul A18 și diferența genetică dintre izolația evaluată din diferite surse.

dendrogramul construit din analiza modelelor de bande obținute cu 13 inițiatori dezvăluie formarea a 4 grupări principale (A, B, C și D) cu similitudine de 40%. Rezultatele indică un nivel ridicat de diversitate genetică. Stabilitatea grupărilor obținute a fost evaluată cu o analiză BS cu 1.000 de replici (figura 1). Grupul A include 8 izolate împărțite în 2 subgrupuri, I și II; Subgrupul I conține izolatele obținute de la L. Naive Lyco 1, Lyco 4 și Lyco 5 (Lyco 1 și Lyco 4 au similitudine de 100%); Subgrupul II este alcătuit din personalul 4: 004 Izolate de podea, personalul 15: 008, Personalul 1: 037, Personalul 10: 027 și personalul 04: 427 (Personalul 4: 004, Personalul 15: 008 au similitudine de 100%). Grupul B include numai Izolarea ARSAF 1884 preluată de la Mocis Cotipe, cu o asemănare cu 80%. Grupul C include numai izolarea ANRSF 512 de la Nilaparvata Lugens, cu similitudine de 50%. Numai în grupul d este izolarea ATCC 32865 de la rănile umane, cu similitudine de 40%, iar aceasta prezintă cea mai mare distanță genetică față de restul izolatelor (Figura 2).

Dendrogram construit din analiza fragmentelor ADN de 11 izolate din C. coronatus amplificat cu 13 inițiatori RAPD. Numerele din fiecare punct al nodurilor reprezintă valorile de bootstrap.”>

Figura 2.

dendrogram construit din analiza fragmentelor de ADN de 11 izolate din C. Coronatus amplificat cu 13 inițiatori RAPD. Numerele din fiecare punct al nodurilor reprezintă valorile de bootstrap.

(0.1MB).

Analiza regiunii sale

inițiatorii săi utilizați18 au amplificat un fragment de 666 bp (spațiile au fost considerate site-uri informative) corespunzătoare Regiunile ITS1-5.8S RADN-ITS2 în 11 izolație evaluată. Lungimea fiecărei regiuni a fost omogenă în toate izolatele: ITS1 223 BB; 5.8s RADN, 155 bp; ITS2, 288 bp. Alinierea și analiza secvențelor cu programul MEGA5 al ISC-ITS2 al IS-urilor din C. Coronatus (Tabelul 1) prezintă 69 de locații variabile între cele 14 izolate. Dintre acestea, 40 se găsesc în ICE1, făcându-l în regiunea cea mai polimorfă, ambele grupuri și izolatele fiecărui grup. Regiunea 5.8 este cea mai conservată, deoarece are doar 3 site-uri variabile între cele 14 izolate. În interiorul fiecărui grup au existat, de asemenea, diferențe în numărul de site-uri variabile totale, grupul fiind de la insecte cu cel mai mare număr (29) și grupul de oameni cele mai omogene (5) (Tabelul 3).

Variabilitatea regiunii sale a furnizat informații despre modelele de diversificare C. Coronatus. Un copac filogenetic a fost construit cu metodele statistice de parsimonie maximă, cu vecinătate (NJ) și evoluția minimă și utilizând tromboidele C. ca grup extern. Același rezultat a fost obținut cu cele 3 abordări atât în topologia, cât și în sprijinul ramurilor (valoarea BS); Regiunea sa este clar diferențiată C. Coronatus din C. trombooides (specii strâns legate). Figura 3 prezintă rezultatul arborelui Analizei NJ.

DIV>

Figura 3.

copac filogen pe baza secvenței sale Regiunea C. Coronatus, folosind metoda NJ. C. Tromboidele au fost utilizate ca grup extern. Numerele apropiate de noduri reprezintă valorile de bootstrap exprimate ca procent de 2.000 de repetări.

(0.16mb).

Grupurile A, B și C au fost formate. Grupa A include 10 izolate împărțite în subgrupuri I și II; Subgrupul I conține izolate Lyco 1, Lyco 4 și Lyco 5 (obținute L. naive), FSU 784 (obținute din compostul de ciuperci) și P1 (obținut din insecte). În subgrupul II sunt personalul 4: 004, personalul 15: 008, Personalul 10: 027, Personalul 1: 037 și Personalul 04: 427 (obținut din sol); Valoarea BS a nodului care unește subgrupurile I și II este scăzută (44%), dar valoarea BS a nodului care unește izolatele subgrupului I este de 79%, iar subgrupul II este de 88%. Grupul B include izolatele ASOF 512 și ARSF 1884 (izolate de homoptere și coraoptera insecte, respectiv) și, în final, în grupa C sunt izolatele ATCC 32865 și VPCI-126P (luate din leziuni umane). Acest grup prezintă cea mai mare distanță genetică față de alte izolate și valoarea BS este de 98%. Discuție

Rezultatele acestei lucrări arată variația genetică evidentă între Izolarea Coronatusului evaluat, grupate în funcție de Originea sa în: 1) insectă, 2) compost, 3) sol și 4) uman.

Deși principiile tehnicii cu secvențe STI diferă de cele ale tehnicii RAPD19,20, este respectată Ce indică SOLL21, care pretinde că, pentru rezultatele obținute printr-o metodă care trebuie considerată valabilă, acestea trebuie confirmate cu cel puțin o tehnică diferită. Rezultatele noastre sunt în concordanță cu ambele tehnici bazate pe: 1) există o variație intraspecifică a izolatelor evaluate; 2) izolatele umane prezintă cea mai mare divergență genetică în raport cu restul izolatelor; 3) Distanța genetică mai mare între grupurile de izolație se administrează între cei de la oameni și lycos (izolatele L. naive).

Chiar dacă rezultă ca cele ale lui Ribes et al.5, Valle și colab .3 și Wieloch și colab.4 sugerează că nu toate izolatele sunt agenți patogeni pentru om și că, la rândul său, este o indicație a variației intraspecifice a ciupercii, nu există studii care să o susțină. Această lucrare este prima care este evaluată și demonstrată că există variații intraspecifice la nivelul molecular al Coronatusului legat de sursa din care au fost luate.

Studii similare au evaluat variația altor enomoftatorale cu RAPD și Amplificarea lui22,23. Așa cum rezultatele noastre arată o distanță genetică clară între izolate din diferite surse, Fargues et al.9 și Morton et al.24 au raportat relația dintre variația genetică și gazdă.

Există studii ale complexului Fusarium, că, deși nu este un enomofrim, acționează cu C. Coronatus caracteristica infectării unei game largi de gazde, inclusiv a omului. Zhang et al.25 a căutat o variație intraspecifică fără succes în 471 izolate luate de la oameni, sol, animale, aer din spitale și plante. Motivul pentru acest motiv este faptul că Fusarium este un fungus multi-găzduit26, ceea ce implică faptul că aceeași izolare poate infecta un număr mare de organisme de diferite fiule.

Fiecare microorganism are un set de caracteristici care funcționează ca factori de virulență în gazdele sale; Cu toate acestea, este necunoscut în ce măsură acestea condiționează mecanismele de infectare în diferite grupuri gazdă. O cauză a acestui fapt este absența modelelor care permit analizarea virulenței între grupurile infectate27. Având în vedere diferitele surse în care a fost găsit C. Coronatus și rezultatele noastre care arată în mod clar variația intraspecifică între izolarea, considerăm că C. Coronatus ar putea servi ca model pentru a evalua mecanismele de virulență care o fac specifice pentru fiecare dintre fiecare grup de organisme la care se atacă.

Chiar dacă rezultatele noastre arată o diferență clară la un nivel molecular între izolatele C. Coronatus din surse umane și alte surse, în această lucrare nu sunt prezentate rezultate morfologice sau fiziologice izolatele pentru a verifica dacă diferențele genetice sunt traduse în diferențe fenotipice; Cu toate acestea, există observațiile noastre (numai cu unele izolate) și alți autori care ne ajută să o deducem, în plus față de creșterea posibilității ca exista o izolare care nu este agent patogen uman. Hall et al.28 consideră că abilitatea de a se dezvolta la 37 ° C este un criteriu de evaluare a potențialului de ciuperci ca agenți patogeni umani; Mier et al.29 a lucrat într-o tulpină de la om și sa dezvoltat la 37 ° C, în timp ce Papierok et al.2 a studiat 10 tulpini, dintre care doar una de origine umană și un Hanseniella Izolate Miriapodo Unguiculata a crescut la 37 ° C; Restul a venit din insecte din diferite ordine. În cazul nostru, a fost observat efectul temperaturii asupra izolatelor Lyco 1, 4 și 5, constatând că nu există nici o dezvoltare la 37 ° C (datele nu sunt prezentate). În plus, am observat că izolarea ATCC 32865 (luată de la om) a durat aproape 4 zile pentru a umple un vas Petri de 85 mm Petri în ceea ce privește cele obținute din insecte (datele neredicate) și au avut un bumbac, o rugozitate scăzută și tonalități grise caracteristicile care nu au fost prezentate în cealaltă izolație evaluată. Aceste caracteristici susțin, de asemenea, diferențele dintre izolarea oamenilor și a restului, care ar putea fi atribuite sursei de care a fost obținută și sugerează că acest lucru poate fi un factor care generează distanțe genetice. Rezultatele lui López-Martínez et al.30 sugerează, de asemenea, o variație intraspecifică și că nu toate izolatele sunt agenți patogeni ai mamiferelor; Ei au efectuat teste la șoareci, hamsteri și cobaii cu o tulpină de Coronatus luată din Aenolamia Postica și, deși a existat o invazie inițială la toate animalele, a dispărut la 15 zile după inoculare, ceea ce indică faptul că ciuperca nu a putut să stabilească fiecare infectează-le. Cele de mai sus evidențiază absența patogenității acestei tulpini speciale la mamifere.

În acest mod, rezultatele noastre pe distanța genetică cu STS și RAPD între izolarea ATCC 32865 (umană) și cele luate de insecte, împreună cu Caracteristicile fiziologice și morfologice ale izolatelor Lycos descrise mai sus, sugerează că aceștia nu sunt agenți patogeni pentru om; Acesta ar putea fi motivul pentru care, în ciuda faptului că lucrătorii sunt în contact cu ciuperca, nu există rapoarte de vătămare umană de către C. Coronatus în plantele producătoare de ciuperci.

Rezultatele noastre nu sunt concludente pentru a sugera utilizarea C.Coronatus în controlul biologic al insectelor; Cercetările sunt necesare pentru a le determina, așa cum sa întâmplat cu tulpina 251 a lilacinului de purpleociliu de ciuperci, care este utilizat în prezent pentru controlul biologic al nematozi, chiar dacă ciuperca este raportată ca un agent patogen al oamenilor și animalelor. Această tulpină este singura care nu produce Pahecilotoxin, care este agentul cauzal al rănirii la om31. Este de remarcat faptul că pentru C. Coronatus, Coronatin-1 metabolitul a fost deja identificat în larvele Galleria Mellonella și, deși este necesar să se determine modul de acțiune, ar fi interesant să investigăm dacă acest metabolit este capabil să provoace modificări În Humans4.

Dimensiunea eșantionului și numărul de gazde / substraturi ale acestei lucrări au fost limitate, ceea ce ar fi putut afecta analiza diversității genetice și a numărului de ramuri formate în copaci filogenetici. Se recomandă efectuarea de teste cu un număr mai mare de izolate și includ studii de morfologie și fiziologie. În ciuda acestor limitări, rezultatele noastre cu tehnicile RAPD și STS furnizează informații privind diversitatea intraspecifică a C. Coronatus legată de gazdă / substrat.

Conflictul de interese

Autorii declară că nu există niciun conflict de interese.