introdução
As doenças infecciosas envolvem um dos maiores problemas de saúde, causando grande morbidade e alcançar níveis de milhões de pessoas afetados a cada ano 1. O aumento nas viagens, mudanças demográficas e resistências antimicrobianas contribui significativamente para esse fenômeno. O tratamento de doenças infecciosas é baseado em um primeiro diagnóstico seguido pela administração do medicamento correspondente.
As doenças infecciosas são a consequência de uma complexa rede de interações que podem envolver centenas de milhares de fatores, tanto o patógeno e o host. Para obter uma melhor compreensão dos processos de doenças infecciosas, é essencial realizar estudos translacionais e multidisciplinares, onde a cooperação do pessoal envolvido nas diferentes áreas de trabalho é integrada.
As análises mais exaustivas realizadas Até o momento em que a busca por biomarcadores e novas metas para drogas e vacinas foram feitas de estudos em genômica e transcriptômica. Nas últimas décadas, o número de estudos proteômicos em doenças infecciosas e ao longo do escopo clínico para a busca de biomarcadores e alvos novos para vacinação e drogas aumentou significativamente.
O sequenciamento do genoma microbiano revolucionou o estudo dos patógenos , não apenas no nível da microbiologia básica, mas também no diagnóstico, epidemiologia, fisiopatologia, tratamento de doenças e desenvolvimento de vacinas. Além disso, o sequenciamento do genoma microbiano permitiu o estudo de sua proteína. O primeiro genoma sequenciado foi o vírus Epstein-Barr (1984), 170kbs2 e uma década depois, em 1995, o genoma da bactéria gramado Haemophilus influenzae, de 1,8MB3.
Muitos estudos foram baseados em A análise dos genes expressos em diferentes tipos de células e tecidos em diferentes contextos fisiológicos, principalmente por meio de uma análise de RNA de mensagens (ARNM), sem freqüentemente existindo uma correlação direta entre o conteúdo do ARNm e o conteúdo de proteína. A falta de correlação entre os níveis de proteína de arnm é devido ao fato de que o conjunto de proteínas produzido por uma determinada quantidade de mRNA depende do estado fisiológico da célula4. Um exemplo dessa ausência de correlação entre a transcriptomia (ARNM) e proteômica (proteína) é demonstrada no trabalho de Franco et al.5, onde duas estirpes de helicobacter pylori, carcinogênicas e um pai não carcinogênico são comparados. As análises no ARNm mostraram diferenças entre as duas cepas, enquanto no nível de proteína estas cepas eram diferenciáveis.
Proteomics é considerado o próximo passo no estudo de um sistema biológico, após genômica e transcriptômica. A complexidade dos estudos proteômicos é maior, uma vez que o genoma de um organismo é estático, enquanto o proteoma difere de uma célula para outra e entre estados. O termo proteoma6, definido por Marc Wilkins em 1994, é uma imagem dinâmica de todas as proteínas expressas por um organismo particular, célula ou compartimento subcelular, em um determinado momento e sob certas condições, constituindo o mapa de expressão de proteínas de uma célula, tecido ou dado organismo. Um fator de complexidade adicional são modificações que a estrutura básica ou a sequência da proteína (por exemplo, processamento proteolítico) e modificações pós-translacionais (PTM), que servem para modificar ou modular a atividade, função ou localização de uma proteína em diferentes fisiológicas ou contextos metabólicos. Finalmente, outro fator de complexidade é luar ou multifuncionalidade, no qual a mesma proteína pode executar várias funções7.
Proteômica, um termo também cunhado por Wilkins, é uma nova abordagem no estudo de proteínas que evoluíram em Recentes anos graças à integração de tecnologias como métodos de separação de proteínas de alto desempenho, espectrometria de massa (MS) e, acima de tudo, ferramentas em bioinformática que permitiram a análise de um grande volume de dados. Graças à sua aplicabilidade, a protea�ica permite não apenas identificar proteínas, mas também classificá-las e classificá-las quanto à sua função e interações.
O campo de estudo da proteômica é muito amplo, mas podemos agrupar em 3 subgrupos: a) proteômica da expressão, cujo objetivo é identificar as proteínas presentes na amostra, bem como obter todas as informações sobre Abundâncias, PTM e localização subcelular; b) Proteomics estruturais, que permite à obtenção da estrutura tridimensional das proteínas funcionais, e c), cuja finalidade é descobrir a função das proteínas e conhecer as interações que podem fazer.
proteomic técnicas que oferecem uma abordagem nova e poderosa para o diagnóstico de patógenos, disparos de surtos, dinâmica patogênico, controle de doenças e desenvolvimento de drogas e vacinas.
A presente revisão é destinada a mostrar a ampla variedade de Técnicas e aplicações disponíveis no campo da proteômica voltados para o estudo de doenças infecciosas.
Metodologias proteômicas
Técnicas proteicas envolvem muitas metodologias experimentais, tais como eletroforese 2-dimensional (2DE), cromatografia líquida (LC e MS. A combinação dessas técnicas com uma análise bioinformática subseqüente é usada para o estudo de proteína de uma ampla variedade de organismos. Essas técnicas são potencialmente valiosas, embora existam complexidades em amostras que possam afetar sua análise e interpretação, como o grau de PTM, a gama dinâmica de expressão (por exemplo, a abundância de albumina nas máscaras de plasma de proteínas minoritárias) e problemas de detecção de proteínas Com a membrana8.
O maior obstáculo para o progresso na área de proteômica é a dificuldade em coleta de patógenos in vivo em abundância suficiente e adequadamente para análises proteômicas. Mesmo estas condições adequadas para estudos de expressão de proteínas em microorganismos patogênicos, há casos em que não pode ser realizado e a cultura axênica (in vitro) torna-se a melhor opção. A multiplicidade de patógenos foi analisada usando técnicas proteômicas sob condições in vitro. Esses estudos permitem conhecer a magnitude da expressão de proteínas e ter uma ideia global de seu proteoma. Baseado apenas no estudo do proteoma sob estas condições pode causar a perda de informação fundamental9-12, uma vez que não permite identificar proteínas envolvidas em infecções, como fatores de virulência, proteínas que permitem a evasão da resposta imune do hospedeiro e Proteína que permite o uso da maquinaria celular do host para se espalhar. Uma simulação experimental de condições de infecção de infecção é a infecção de culturas celulares (simulação in vitro do ambiente de infecção) ou o uso de modelos animais13,14. A desvantagem desses estudos reside na presença de uma grande “contaminação” por proteínas hospedeiras, bem como uma baixa obtenção de biomassa patógena.
completamente, abordagens experimentais in vitro / ex vivo têm implicações significativas em relação à Para a identificação de novas vacinas, metas para drogas, infectividade biomarcadores e progresso da doença.
A maioria das proteínas envolvidas nos primeiros estágios da infecção por host são proteínas de superfície celular. Essas proteínas são a conexão entre a célula e o meio extracelular, então são o principal mediador na infecção. Portanto, são componentes de grande interesse para o desenvolvimento de novas vacinas e para a caracterização de novos alvos para drogas. A informação dessas moléculas está em baixa representação em estudos proteômicos devido à sua baixa abundância, pouca solubilidade e problema em sua fracionamento sem uma contaminação por proteínas citoplasmicas15,16. No caso do estudo das bactérias grampo e fungos, também é importante conhecer a composição de proteína da parede celular e não apenas da membrana plasma17.
Preparação de amostras
Obtenção e preparação das amostras um dos passos mais relevantes em estudos proteicos. É de vital importância que as amostras sejam tomadas e processadas pelo mesmo protocolo para que os resultados obtidos sejam verdadeiros, reprodutíveis e que as diferenças observadas não sejam o resultado do manuseio.
O processamento da amostra em O laboratório difere de acordo com a origem dessa e o propósito do estudo. Em estudos na cultura axênico, o isolamento anterior é necessário para obter a amostra de proteína. Pelo contrário, quando o microrganismo é analisado em um estado infeccioso, a preparação da amostra precisa de um isolamento do microrganismo com relação às células do hospedeiro.Os métodos mais utilizados para a separação são centrifugação, separação imunomagnética (IMS) e a classificação de células por citometria de fluxo (FACs).
O primeiro método, centrifugação, é recomendado para patógenos com parede celular (plantas, Fungos, algas, arcot e bactérias grampo), lise prévia de células eucarióticas (hospedeiro) por pressão osmótica18,19 ou detergentes, como tritonx-11413.
no segundo método, a técnica do IMS, partículas magnéticas conjugadas com uma imunoglobulina específica (IG) contra o microrganismo de interesse são usadas. Esses microrganismos podem ser facilmente enriquecidos e purificados, gerando proteína praticamente livre de biomassa suficiente do hospedeiro para uma análise de proteoma exaustiva. A vantagem mais importante sobre a centrifugação é obter uma amostra livre de contaminantes do hospedeiro. Pelo contrário, esta técnica requer anticorpos específicos contra estruturas da superfície do patógeno.
No terceiro método, os FACS, anticorpos específicos são utilizados para a rotulagem fluorescente do microrganismo alvo, com o objetivo de facilitar o separação desse respeito a outros microrganismos ou detritos da célula hospedeira. Essa técnica pode separar milhares de partículas por segundo, mas o acúmulo de material patogênico suficiente para a aplicação de técnicas proteômicas requer bastante horas de classificação, tornando-o muito caro.
Todos esses métodos de separação devem ser otimizados Para aumentar a velocidade de processamento da amostra e reduzir o risco de digestão parcial por proteases, além de reduzir a probabilidade de contaminação com proteínas hospedeiras.
Os estudos proteicos podem ser direcionados para o estudo do proteoma total, subproteoma o uma proteína concreta. A seleção de uma população de proteína ou proteína específica deve ser realizada por um fracionamento da amostra. Entre as técnicas usadas para este fim, vale ressaltar a purificação de afinidade em tandem (CO-IP) 21 e o chip de varredura do peptidoma por HLA22,23.
Técnicas proteômicas
técnicas proteicas são divididas em qualitativa e quantitativa. A primeira informar sobre a expressão ou não de uma determinada protéica ou conjunto de proteínas (presença / ausência), enquanto proteômica quantitativa permite determinar e comparar a quantidade de proteína presente na amostra.
nos estudos em proteomic , a amostra é uma mistura complexa de centenas / mil proteínas. Por esse motivo, o uso de uma técnica de separação é essencial. Essas técnicas são agrupadas: em gel e sem gel. As técnicas de gel são aquelas em que um quadro de polímeros é usado para separação. As técnicas livres de gel realizam a separação da amostra de proteína em solução por diferentes tipos de cromatografia líquida (troca iônica, afinidade, fase reversa …). A Tabela 1 mostra as vantagens e desvantagens das diferentes técnicas proteômicas.
resumo de As principais vantagens e desvantagens das técnicas de gel e sem gel sem proteômica
alta resolução
identificação fácil e sequenciamento de biomarcadores
detecção de isoformas de uma proteína
limitação para baixo abundância e proteínas hidrofóbicas
Sobreposição de proteína
Falta de automação, laboronesa e limitação no número de experimentos
Ausência de diferenças de Interensay
Redução da quantidade de proteína
processo automatizado multidimensional
alta sensibilidade e resolução
possibilidade de quantificação
Número ilimitado de experimentos – Redução de custos devido à ausência de marcação de manipulação menor da amostra
ID BAIXO Pouca dificuldade abundante na montagem dos peptídeos tripsinizados
menos precisão em quantificação em marcação
processo multidimensional multidimensional
alta sensibilidade e resolução de alta precisão na quantificação
alto custo de isótopos e sintéticos Ptidos
maior manuseio da amostra
Proteomics qualitativos no gel gel
Separação de proteínas no gel é uma ferramenta que permite a separação destes por propriedades, como o tamanho (MR), o ponto isoelétrico (Pi) e / ou a conformação (géis nativos). A separação do gel pode ser realizada por uma única propriedade (monodimensional) ou por 2 propriedades consecutivas (bidimensionais). Devido à complexidade dos extratos totais de proteína, a separação de amostras em eletroforese bidimensional (2DE) oferece uma resolução maior. Através desta técnica, as proteínas são separadas por IP e subsequentemente pelo MR, obtendo um mapa global do proteoma da amostra.
Técnica 2 só pode ser aplicado satisfatoriamente se houver um mínimo de 108 células isoladas. Esta técnica permite separar entre 3.000-5.000 proteínas únicas24, geralmente diferenciadas em um único ponto. No entanto, a mesma proteína pode ser identificada em diferentes manchas, indicando que essa proteína tem várias isoformas que diferem em PI e / ou mr. Essas isoformas podem informar sobre os possíveis PTMs de uma determinada proteína. Os PTMs mais frequentes são fosforilamentos, glicosilamentos ou proteólise limitada25. Outro fenômeno menos comum é a identificação de duas proteínas no mesmo local, devido ao seu PI igual e Sr.
A preparação da amostra para a eletroforese bidimensional é crucial para obter resultados ideais, sendo necessário Processos de solubilização, desintegração, desintegração e redução de proteínas26.
Uma possibilidade oferecida por gel 2D é a sua combinação com técnicas de rotulagem de proteínas, permitindo a comparação de proteína no mesmo gel, evitando nessa forma variações do Interensay (entre géis / experimentos). Esta técnica é conhecida como gel bidimensional diferencial (2D-dige). A rotulagem por fluorófos pode ser aplicada ao estudo comparativo de 2 proteomas, permitindo uma quantificação relativa das amostras. Esta marcação pode ser direcionada a conjuntos de proteínas específicos; Por exemplo, o estudo de proteínas com regiões expostas ao meio extracelular. A aplicabilidade desta técnica permitiu ao estudo do surfade27 evitando a fracionamento de proteínas superficiais, que são geralmente longas e caras.
2D-dige géis podem ser aplicados à busca por alvos terapêuticos, analisando o in vitro Proteome contra o proteoma do patógeno em uma situação de infecção, obtendo no mesmo gel o comparativo do proteoma em ambas as situações. Devido à dificuldade em obter uma amostra suficiente de patógeno em uma situação de infecção, estudos foram realizados em que a proteoma do microrganismo in vitro é comparada em diferentes fases de crescimento. No trabalho de Hayashi et al.28, as proteínas expressas por Legionella Pneumophila foram estudadas em 2 fases de crescimento: exponencial e pós-legitencial, observando uma alta expressão de fatores de virulência na fase pós-legital. Graças a este estudo, pode ser estabelecido em trabalhos futuros no proteoma fase pós-legital como uma aproximação do proteoma em infecção.
Uma desvantagem significativa da 2ª técnica é a limitação na capacidade de foco de proteína de abundância média a baixa devido à ampla gama de níveis de expressão de proteína. As proteínas mais afetadas pela referida limitação são proteínas da membrana e proteínas de baixo peso molecular, que são sub-representadas na proteína total. Essas proteínas podem ser melhor detectadas por outras técnicas proteômicas29.
Técnicas livres de gel
A técnica livre de gel requer uma primeira separação das proteínas presentes na amostra por cromatografia líquida por propriedades diferentes, definidas de acordo com a coluna usado. Existem diferentes tipos de colunas no mercado, sendo a mais utilizada a fase inversa, troca iônica, afinidade e exclusão molecular. Posteriormente, uma análise é realizada por MS para a identificação das proteínas (LC-MS / MS).
As técnicas de separação sem gel são aconselháveis quando a quantidade de amostra é escassa, como é o caso de Experimentos em infecção na qual um baixo número de microrganismos é obtido. Nestes casos, as técnicas de MS sem gel são adequadas para oferecer uma melhor sensibilidade, uma vez que permite que as proteínas 500-600 sejam monitoradas de apenas 106 células14 (uma quantidade 100 vezes menor que em géis 2D). Essa técnica permite a detecção de proteínas difíceis separáveis em 2DE, como proteínas muito hidrofóbicas, proteínas de membrana e proteínas de PI-ends, como proteínas ribossômicas com PI30-32 básico. Um exemplo claro em que esta maior sensibilidade é demonstrada é o trabalho realizado em genitalium micoplasma, um modelo genoma e um proteoma mínimo, no qual a fração rica em proteínas de membrana foi estudada pela Tritton Fracionion114. A análise desta fração foi realizada por 2 e por LC-MS, obtendo uma diferença clara em termos de número identificado de proteínas. Por meio de 29, 49 proteínas foram identificadas, enquanto 242 proteínas foram identificadas33 por LC-MS.
Proteomics quantitativa
Proteomics quantitativa é uma ferramenta útil para análises proteômicas por LC-MS / MS34. Os métodos de quantificação podem ser classificados em quantificação relativa / absoluta ou sem rotulagem.
Métodos relativos de quantificação (ICAT, ITRAQ, IPTL ou SILAC) são utilizados para comparação de abundâncias proteicas ou peptídicas entre as amostras. Por outro lado, através do uso de péptidos sintéticos marcados isotopicamente, é obtida uma quantificação absoluta dos peptídeos alvo.
proteômica quantitativa marcando
Técnicas quantitativas por rotulagem de compostos isotópicos para uma análise subsequente por MS, obtendo uma quantificação relativa. A rotulagem de proteínas pode ser realizada durante o crescimento das células ou uma vez que a extração destes foi realizada. As amostras a serem comparadas são diferenciadas por rotulagem isotópica. De acordo com a técnica de marcação, nós diferenciamos: ICAT (tag de afinidade de código isótopo: marcação de afinidade com codificação isotópica) 35, ITRAQ (multiplexed isobárica química de tag: rotulagem isobárica de multiplexação química) 36 E IPTL (rotulagem de terminal de peptídeo isobárico: União terminal isobárica do Péptido) 37.
A quantificação relativa, marcando permite a comparação de 2 populações de acordo com o crescimento de células por Silac (rotulagem isotópica estável por / com amininos na cultura de células: aminoácidos isotópicos estáveis em cultura celular) . Nesta técnica, os marcadores isotópicos não radioativos são incorporados durante o crescimento celular às proteínas sintetizadas não-Novo38-41.
Técnicas de quantificação significativa têm certas limitações, assim como o aumento da complexidade na preparação da amostra ( pelo tratamento independente da amostra), a necessidade de uma grande concentração disso, os altos custos dos reagentes, marcas incompletas que distorcem o resultado e a necessidade de software específico para quantificação.
Proteomics Quantitative Free Marcação
Estratégias de marcação livre podem ser usadas para quantificação de parentes e absolutos. Essas técnicas atingem maior velocidade, resultados mais limpos e uma simples análise dos resultados. Por esta razão, eles são promissores na quantificação de proteínas incontáveis devido à sua alta sensibilidade, embora sejam aplicadas certos critérios devem ser levados em conta: a) É necessário ter espectrômetros em massa com altas precisão e instrumentos de HPLC com um tempo seguro de retenção; b) Material suficiente deve ser aplicado para determinar a concentração de proteína antes da medição por MS com o objetivo de aplicar quantidades equivalentes de péptidos, e c) o número de peptídeos da célula hospedeira deve ser minimizado para evitar falsos positivos.
A quantificação das proteínas por este método é geralmente baseada em 2 categorias: a) Medição das mudanças de intensidade dos íons, seja por picos ou pela altura destes em espectrometria e B) Contagem de espectros de proteínas identificadas após análise MS / MS42-53.
Uma melhora em proteômica quantitativa sem a rotulagem é a incorporação de péptidos sintéticos marcados isotopicamente como padrões internos. Esses peptídeos permitem uma quantificação absoluta (aqua: quantificação absoluta) dos peptídeos de interesse54.
Instrumentos para análise e identificação de proteínas por espectrometria de massa
A identificação de proteínas é realizada mais através de espectrômetros de massa. Esses instrumentos permitem obter íons de moléculas orgânicas, separando-as e detectando-as dependendo da massa / carga (m / z). Os espectrômetros de massa consistem em 3 componentes: fonte de ionização, analisador de massa e detector. Existem diferentes tipos de espectrômetros de massa de acordo com a combinação dos diferentes elementos. O mais comumente usado são:
- •
Maldia-TOF (dessorção a laser assistida por matriz / ionização do voo: deleção / ionização por laser assistida pela matriz, “tempo de voo”) : Comumente usado para a identificação de proteínas por meio de uma pegada peptídica e o estudo de perfis de proteína de uma amostra e interações proteicas. Vale ressaltar o desenvolvimento da técnica “Imaging”, que permite uma visualização tridimensional da distribuição de metais, metabólitos, lipídios de superfície, péptidos e proteínas, diretamente em tecidos sem ter uma pré-extração ou extração .55,56.
- •
seldi-tof (superfície aprimorada de ionização do voo do voo: dessorção / ionização por laser de superfície aprimorada, “Tempo de voo”): Este instrumento utiliza a mesma tecnologia que O MALDI-TOF incorporando a funcionalização da placa (troca de íons, fase reversa, anticorpos, DNA, outras proteínas, etc.) em que a amostra é carregada. A comparação de proteínas retidas na placa entre diferentes amostras pode ser usada para a busca por biomarkers57.
- •
esi (electrospray ionização: ionização por electrospray): Este dispositivo é especialmente útil Para sequenciamento peptídico, uma vez que permite a ionização das macromoléculas, fragmentando-as pelas ligações peptídicas (sindicatos mais fracos), obtendo assim a sequência de aminoácidos56.58.
bioinformática
proteom Análises geram uma grande quantidade de dados a serem analisados. O desenvolvimento de ferramentas bioinformáticas, como a introdução de novos algoritmos, tem sido fundamental para manipular os referidos conjuntos de dados. Este campo permite e facilita a manipulação de dados em larga escala, desenvolvendo programas e ferramentas de pesquisa apropriadas. Estas ferramentas foram aplicadas com grande sucesso no processamento de dados do MS, tanto em análise peptídica (identificação de proteína), pegada de fragmentação peptídica (identificação da sequência peptídica) e sequenciação de Novo.
Existem uma infinidade de programas que permitem a identificação em sílica de proteínas. Em estudos proteicos em doenças infecciosas, há programas que permitem a identificação e caracterização de epítopos do patógeno que interagem com o sistema imunológico do hospedeiro, imunoma. As interações de hospedeiro não são conhecidas em profundidade em muitas das doenças infecciosas, para que estudos bioinformáticos possam direcionar o estudo dessas interações.
AplicativosPrazo de microorganismos
Estudos do total de proteoma de microorganismos patogênicos são muito valiosos em termos de informação obtida da expressão de proteína em uma determinada condição. Em outros estudos, é mais interessante obter informações de certos subprotos, como proteínas expostas na membrana, ou saber quais proteínas desencadeiam a resposta imune no hospedeiro. Vale ressaltar o papel dos PTMs na interação entre o patógeno e o hospedeiro, por isso o seu estudo em microorganismos patogênicos deve ser levado em consideração.
membrana, superfície e secretada
O subproteoma da membrana constitui um conjunto de proteínas relacionadas à infecção. Existem técnicas para a detecção das proteínas expostas na superfície da célula (surfoma), assim como a rotulagem específica por fluoróforos no 2D-Dige e a barbear da célula. A técnica de barbear foi usada satisfatoriamente em vários patógenos humanos do Grampotive como em Streptococcus59 ou Staphylococcus aureus60, embora a sua aplicabilidade em bactérias Gram-negativas ainda não seja conhecida.Essas bactérias têm um envoltório celular menos rígido e menos resistentes do que as grampopositivas, de modo que o “raspado” compromete a integridade da membrana e faz com que a lise celular. Como alternativa a essas técnicas, os protocolos de extração de proteína de membrana existentes foram melhorados por diferentes detergentes ou isolamento membrana61, como é o caso do uso do tampão de carbonato para a eliminação de proteínas solúveis em contaminação nas amostras.
Proteínas secretas constituem um subprotama importante e podem desencadear a lise das células hospedeiras por toxinas, que podem influenciar a adesão, a colonização e a invasão, bem como o desvio da resposta imune do host62-66. Este importante grupo de proteínas é perdido durante o processamento de bactérias intactas67.68. Proteínas de vesículas de membrana externas (OMV) são um subprotama muito importante em patógenos, uma vez que desencadeiam potentes reações imunogênicas quando liberadas pelo microorganismo para o meio extracelular. As vesículas produzidas pela Neisseria Meningitidis foram usadas pelo seu efeito imunotrotivo contra este patogênico69.70.
biofilmes
biofilmes são formados por um robusto biocap de microrganismos e matriz extracelular. Essa estrutura permite as células que compõem a ligação a superfícies artificiais ou bióticas, dificultando a eliminação dos microrganismos que compõem a IT71. Biofilmes bacterianos representam uma antiga estratégia de sobrevivência procariótica. Donlan72 definiu o biofilme como uma comunidade microbiana sesiliar, caracterizada por células que são irreversivelmente aderidas a um substrato ou interface, ou alguns com outros, incorporados numa matriz de substâncias poliméricas extracelulares que produziram exibindo um fenótipo alterado em relação à taxa alterada Transcrição de crescimento e gene. O Biofilm fornece bactérias incorporadas nele vantagens significativas contra as flutuações ambientais de umidade, temperatura e reserva de pH e nutrientes e nutrientes. Por esta razão, as diferenças na abundância de proteínas entre as células cultivadas em células de biofilme e células vegetais foram estudadas através da 2ª técnica com coloração de prata em Candida Albicans. Como resultado dessa comparação, observou-se que as células cultivadas em biofilme tiveram uma menor capacidade anti-oxidativa, além de ter a proteína PIL1P, proteína sensível ao tratamento com um determinado tipo de antifúngica74. Este resultado permitiu encontrar alvo eficaz e tratamento contra o estado mais resistente dessas leveduras.
Identificação de microorganismos e sensibilidade ao antimicrobiano
A identificação de microorganismos que causam infecção deve ser alcançada no mínimo tempo possível. Portanto, um amplo campo de pesquisa é a busca por técnicas de identificação alternativas para fenotípico / metabólico, que exigem, além do isolamento do microrganismo, entre 18-24h mais para a identificação disso. Uma opção para a identificação rápida de microorganismos é a otimização do MS. Na revisão de Jordana-Lluch et al.75, o uso desta técnica e os avanços obtidos até agora são explicados em detalhes.
A aplicação do MS na identificação de microorganismos requer apenas o isolamento e uma média de 5min; No entanto, nesse processo, os dados sobre sensibilidade antimicrobiana não são obtidos. Para obter essas informações, a realização de testes de sensibilidade do microorganismo é necessária, mas os referidos testes exigem um tempo adicional. Estudos foram conduzidos usando o MS para detectar a presença de betalactações, diferenciar entre S.Aureus sensível e resistente à meticilina, e até detectar fatores de patogenicidade76-79.
busca por biomarcadores em fluidos corporais
Biomarkers facilitam o desenvolvimento de ferramentas diagnósticas específicas, monitorar a resposta à terapia ou progresso da doença80. Quando analisamos amostras biológicas (de proveniência humana ou animal), a dificuldade está na criação de grupos homogêneos para garantir uma boa correlação de resultados. Por esta razão, a padronização da classificação das amostras é essencial.
A comparação de fluidos entre pacientes e controles pode permitir a identificação de proteínas diferenciais. Essas proteínas podem ser usadas mais tarde como um método de diagnóstico rápido. Um estudo desse tipo foi realizado com o vírus Hepatitise (HEV), no qual o plasma e a urina de pacientes infectados foram analisados por amostras de controle de 2D. Foi demonstrado que mais de 30 proteínas foram expressas diferencialmente em pacientes com HEV agudo em relação ao controlo81.Estes resultados demonstram o potencial de proteômica na busca por biomarcadores.
As proteínas diferenciais obtidas em comparação entre pacientes com diferentes graus da doença podem ser usadas para determinar o prognóstico do paciente.
imunoma
A imunoproteomia é uma ferramenta potencialmente útil no campo de busca por biomarcadores para doenças infecciosas, especialmente em situações em que o patógeno é difícil de cultivar in vitro82-85. A tecnologia Seldi foi aplicada muito recentemente na identificação de biomarcadores para discernir cepas de pylori helicobacter associada a diferentes estados de doença86. Deste modo, “assinaturas” de anticorpos em seroum83.84 são identificados.
A identificação e caracterização das proteínas antigênicas é um requisito para o desenvolvimento de vacinas, uma vez que têm grande interesse como alternativa terapêutica ao tratamento. Para a investigação da imunorreatividade dos anticorpos humanos ou anticorpos de modelos animais contra proteínas microbianas, a combinação de 2DE e imunoblotting representa o método de escolha. Os extractos totais de proteína do microorganismo patogênico são separados pela 2ª e as proteínas imunorreativas são detectadas por imunoblotes 2D com soro de pacientes infectados, em comparação com o padrão obtido com o Sera Control87. As proteínas que geram sinal diferencial entre os dois grupos são identificadas por pegada peptídica.
A expressão de proteína varia de acordo com o estado e condição de crescimento de microorganismos. Por esta razão, é aconselhável realizar as imunoblottings com extrato de proteína de microrganismos cultivados in vivo, para evitar variações transcricionais, translacionais e pós-gerais encontradas entre vitro vs em culturas vivos.
imunoproteomics é útil para fornecer propostas gerais diagnóstico ou para a seleção de biomarcadores83. Além disso, esta metodologia pode ser facilmente aplicada a múltiplas infecções humanas e veterinárias de grande importância devido à sua incidência e severidade88-96.
Vacinas e drogas
A seleção de alvos para drogas e / ou vacinas é essencial para a obtenção de um resultado ideal no controle e / ou tratamento de uma doença infecciosa. Os critérios a serem levados em conta para selecionar um alvo são: a) que é essencial para a infectividade e proliferação do patógeno no hospedeiro; b) que tem uma baixa redundância no patógeno, embora tenha alta redundância nas faixas do hospedeiro, desde que os efeitos tóxicos possam ser mitigados; c) que é amplamente e consistentemente expressa nos tecidos de infecção e nos diferentes pacientes da população, e D) que é terapeuticamente tratável usando pequenas moléculas, como sirna, anticorpos ou outras modalidades farmacêuticas.
A vacina reversa é uma técnica usada na busca de novos alvos. Essa abordagem permite uma triagem em favor de proteínas com potencial imunogênico. Os dados obtidos a partir do proteoma durante a infecção podem ser explorados como base para o desenvolvimento de novas quimioterapias antimicrobianas e vacinas. Uma baixa proporção dessas proteínas pode ser usada como alvo para quimioterapia antimicrobiana97 ou como antígeno para vacinas de proteção98. Alguns patógenos em que o estudo do imunoma foi realizado: Chlamydia Pneumoniae, Haemophilus Gripe, Neisseria Meningitidis, Helicobacter pylori, Bacillus Anthracis, Streptococcus Agalactiae, Mycobacterium tuberculose e Mycobacterium Bovis98-111.
Conclusão
La Proteomics É uma ferramenta verdadeiramente útil no estudo de doenças infecciosas, proporcionando uma visão global. Análises proteômicas permitem a realização de um estudo básico da doença, facilitando a busca por marcadores de infecção ou virulência. Posteriormente, os resultados obtidos têm uma aplicabilidade de translação destinados ao diagnóstico e prognóstico da doença, bem como permitindo ao desenvolvimento de novas terapias antimicrobianas e adiantamento na vacina.
técnicas proteicas não só permitem apenas a identificação de Novos marcadores, mas podem ser implantados como técnicas de diagnóstico rápido, sendo capazes de dirigir o tratamento com maior velocidade, evitando culturas in vitro, que exigem longos tempos de incubação, atrasando o diagnóstico, além de gerar falsos negativos naqueles microorganismos viáveis, mas não cultivados.
Esta revisão mostra como a proteômica é uma ferramenta de pesquisa poderosa. Até hoje, muitos especialistas consideram as técnicas em proteômica útil na descoberta de proteínas de interesse clínico, como biomarcadores, mas sua capacidade de assistência é baixa.O resultado obtido em trabalhos de pesquisa com base em proteômica é adaptado a técnicas convencionais, como ELISA, mas não são mantidas como ferramentas diagnósticas. Esta revisão visa mostrar os especialistas das novas técnicas de campo clínicas disponíveis para resolver as dificuldades que ocorrem dia após dia.
Atualmente, a proteômica é uma área avaliada por sua utilidade clara, embora ainda haja muito de trabalho que executa em áreas como doenças infecciosas. Para melhorar sua utilidade no futuro, devemos conscientizar entre todos os funcionários envolvidos no campo de saúde de sua importância, bem como integrar os resultados dos estudos de todos “omica”. Este último aspecto é de grande importância, uma vez que, por exemplo, o conhecimento do genoma de um microorganismo é de importância vital para a interpretação dos resultados proteômicos.
Outro aspecto limitante na microbiologia clínica é o isolamento do microorganismo para identificação posterior. Eliminar esta etapa, tanto a genômica quanto a proteômica melhorariam sua aplicabilidade na identificação do patógeno em uma infecção. Portanto, essas melhorias possibilitariam a aceitação de técnicas proteômicas no ambiente de cuidados para a detecção e diagnóstico em doenças infecciosas, reduzindo o tempo e os custos.
Conflito de Interesse
Os autores declaram não ter nenhum conflito de interesse.