- mitose
- microtubules
Resumo
O fuso mitótico consiste em dois tipos de microtúbulos. Os microtúbulos dinâmicos da CineTocoros Capture Cinetocoros, enquanto os microtúbulos interpolares estáveis servem como uma coluna vertebral estrutural que conecta os dois pólos do fuso. Acredita-se que ambos são indispensáveis para a divisão celular em eucariotas. Aqui mostramos que os microtúbulos interpolares são dispensáveis para a segunda divisão da meiose em levedura de fissão. Mesmo quando os microtúbulos interpolares são interrompidos por um medicamento de despolação de microtúbulos, os pólos do fuso são separados e os cromossomos secretam o pólo na segunda divisão da meiose na maioria dos ciganos, produzindo esporos viáveis. A membrana da Foroso, que encapsula o núcleo na segunda divisão da meiose e é guiada por proteínas de sepção e ponta, é responsável por realizar eventos meióticos na ausência de microtúbulos interpolares. Além disso, durante a segunda divisão fisiológica da meiose sem a perturbação dos microtúbulos, a assembléia da membrana de estruturas de esporos estruturalmente à separação do pólo do fuso e da divisão nuclear, gerando força suficiente para a separação do pólo e eventos subseqüentes Independentemente dos microtúbulos interpolares.
Introdução
MicroTubules têm funções essenciais na divisão celular de eucariotas. O fuso mitótico consiste em dois tipos de microtúbulos: microtúbulos Kinetochore (KTMTS) e microtubules interpolares (IPMTS) 1, 2, 3. O KTMT repetir dinamicamente a polimerização e a deprolimerização dos dímelos de trombulina α / β-tubulina, capturando e puxando os Cinetockers cromossômicos. Pelo contrário, o IPMT estável servir como a rede de troncos estruturais que conecta os dois pólos 4 do fuso.
A necessidade de microtubules de fuso para a segregação de cromossomos foi demonstrada em muitos estudos durante as últimas décadas , o uso de medicamentos ou tratamento com frio para despolimizar microtúbulos, bem como o uso de células mutantes defeituosas na organização de microtúbulos. O requisito KTMTS parece evidente, uma vez que uma falha na união dos microtúbulos de Kinetochore pode causar aneuploidia 5. Sabe-se que a proteína ASE1 / PRC1 associada aos microtubules agrupa o IPMT na zona média do fuso na mitose tardia (Anafase) 6, 7, 8, 9. A disfunção do ASE1 / PRC1 não afeta a União dos microtúbulos de cinetochura na metáfase, mas causa um colapso do fuso na anáfase, que muitas vezes leva à produção de aneploides. A aneuploidia pode levar à instabilidade genômica e, portanto, está intimamente relacionada à tumorigênese 10. Portanto, acredita-se que ambos os tipos de microtúbulos são indispensáveis para a segregação cromossômica correta nos eucariotos. A maior parte desse conhecimento, no entanto, é baseada em estudos de células mitóticas, e é entendido pouco se esta propriedade é compartilhada com células meióticas.
Neste estudo, nós fazemos observações de células vivas nas células. Mitótica Como meiéticos de levedura de fissão esquizoscaromymyces pombe para reavaliar a importância biológica dos microtúbulos na segregação de cromossomos. Adicionamos um medicamento de despolação de microtúbulos, metil-2-benzimidazole-carbamato (MBC), para células do tipo selvagem antes da divisão mitótica ou meiótica e monitorar a progressão do ciclo celular usando microscopia de fluorescência em tempo real (Fig. S1A suplementar. ciclo). Descobrimos que o IPMT é dispensável na segunda divisão da meiose (MII), contra a crença geral de um requisito absoluto de microtúbulos. A separação do pólo do fuso e eventos subseqüentes ocorreram normalmente mesmo na ausência de IPMT em IMA. Além disso, identificamos que a membrana de foreporas, que encapsula o núcleo, é responsável pela geração da força para separar os pólos em vez dos microtubules. Inesperadamente, mesmo quando os microtúbulos estavam intactos, a eliminação da membrana de esporos reduziu a proporção da separação do pólo do fuso. Propomos que a membrana de foreporas é o primeiro material não-microtubular que produz a força para a divisão celular sob condições fisiológicas.
Os microtúbulos interpolares são dispensáveis na IMA.
Os microtubules foram exibidos com a proteína fluorescente verde (GFP) marcada com α2-tubulina (ATB2), o corpo do poste do fuso (SPB; um centrossomo fúngico equivalente) foi marcado com a proteína fluorescente cianos ( CFP), o componente médio SFI1 SFI1 (SFI1-CFP) (SFI1-CFP) e o Cinetocorus foram marcados com a fábrica MIS6 (MIS6-2MCH) etiquetadas de 2 m. Durante a mitose normal na ausência de MBC, os microtúbulos que nucleam os dois SPB interagiram para formar um fuso bipolar robusto e SPB separado 11, 12 (Fig. 1a). Até a metafase, a região do fuso central mostrou um sinal de GFP-ATB2 relativamente tênue (12 min), refletindo o fato de que vários KTMT curtos estavam localizados perto do SPB, enquanto o IPMT conectou os dois SPB 4 (Fig. S1B adicional) para um esquema). No Anafase B (22 min), o fuso foi alongado através do IPMT interdigitante deslizando na zona média do fuso. Propriedades semelhantes foram observadas para o fuso na meiose i (MI) e em MII (Fig. 1B, Fig. S1C suplementar). Adicionamos MBC e observamos células que acabaram de entraram na mitose. Como esperado, a nucleação dos microtúbulos do SPB foi severamente inibida, e o SPB nunca se separou na presença de MBC (90 min, Fig. 1C e Fig. S1D suplementar), que confirma a importância dos microtúbulos na divisão mitótica. Pelo contrário, quando os MBCs foram adicionados aos cigostos antes do MII (0 min, Fig. 1d), os SPBs poderiam ser separados, embora a microcubulação tenha sido significativamente inibida pelo MBC (Fig. S1e complementar). Um sinal GFP-ATB2 foi detectado apenas em torno dos pólos do fuso, que indica que os IPMts que conectam os dois SPBs foram interrompidos (42 min). Na presença de MBC, apenas microtúbulos curtos associados aos CineSchers foram detectados (fig. 1e), sugerindo que eles poderiam servir como KTMT. Os cinetocores foram igualmente separados aos dois pólos na maioria das células tratadas com MBC (veja abaixo), o que indica que os microtúbulos curtos foram suficientes para a captura e conexão do CineTocoros para SPB. Não só a separação da SPB e a segregação de cromossomos, mas também a divisão nuclear foram realizadas com sucesso na presença de MBC (Fig. 1f).
(a – e) células vívidas imagens de culas vestindo GFP-ATB2 (microtubules, verde), mis6 -2mcry ( MIS6-2MCH, Kinetocores; Vermelho) e SFI1-CFP (SPB, Azul). As imagens de lapso de tempo de células que experimentam a mitose normal (a) e a meiose II (MII) (B) são mostradas. Para as células Mii em B e D, as regiões descarregadas dos cigotes são ampliadas como imagens de lapso de tempo. A forma das células é delineada em curvas de pontos; n = 10. (c) Um fármaco de despolimerização de microtúbio foi adicionado, MBC, a uma célula que entra na mitose (0 min), pouco antes da separação com SPB. A MBC inibiu a formação de microtúbulos e separação do SPB até o final da observação (90 min). (D) MBC foi adicionado a uma célula que entra em MII (n = 14). As dicas de seta indicam que uma separação SPB ocorreu mesmo na ausência de IPMT. (e) Kymógrafos de lapso de tempo dos fusos durante o MII, sem (à esquerda) e com (direita) MBC (n ≥10). As regiões retangulares contendo os eixos são aparadas a partir das imagens do lapso de tempo e alinham-se ao longo do tempo. SPBS e Kinetocores separados mesmo na ausência de IPMTS (direita). O comprimento das setas corresponde a 5 min. (f) A divisão nuclear da MII Cictos sem (à esquerda) e com a MBC (à direita) foi monitorada com o marcador de envoltório nuclear cut11-3mRfp (vermelho), juntamente com GFP-ATB2 (N ≥6). Regiões emolduradas são expandidas como imagens de lapso de tempo abaixo. (G) Cut7-446 Zigotos mutantes submetidos a MII que marcado com GFP-ATB2 (verde), MIS6-2MRFP (vermelho) e SFI1-CFP (azul) (n = 6). Durante o MII, os SPBs foram separados e o fuso bipolar foi formado a temperatura restritiva (32 ° C), na qual as células mitóticas falharam na separação de SPB com o fuso monopolar. Barras de escala, 2 μm.
Por que é possível que o efeito da MBC seja parcial e que continue sendo uma quantidade indetectável de IPMT e podemos levar à separação de Cabo. De SPB e eventos subseqüentes, examine o mutante CUT7 em nosso sistema. O Cut7 é o ortogum de levedura de fissão do BIMC / EG5 / Kinesin-5 Kinesin 12, 13. Cut7 conecta microtubules antiparale emanando de cada SPB e desliza os microtúbulos para fora, separando assim os SPBs. Durante a mitose, os SPBs no corte mutante sensível à temperatura 7-446 não foram separados a temperatura restritiva, que resultou na geração de fusos monopolares 13 (Fig. S2 suplementar).Em contraste, os SPBs foram separados durante o MII em cigrotos de 7 a 446 para temperatura restritiva (Fig. 1g). Isso mostra que a separação do SPB durante o MII não é baseada na interação IPMT mediada por Cut7. Portanto, concluímos que o IPMTS é dispensável ao realizar eventos essenciais da fase, como a separação do SPB, a segregação de cromossomos e a divisão nuclear em MII (Fig. S3 complementar).
Segregação normal de cromossomos na ausência de IPMTS in MII
As células mitóticas tratadas com uma dose alta de MBC geralmente resultam em um fenótipo letal “corte”, que mostra uma citocinesia forçada com cromossomos não cozidos 14, 15, 16. Para determinar se a divisão independente do IPMT observada durante a IMA poderia resultar em uma segregação anormal dos cromossomos, os centrômetros do cromossomo II (CEN2) com GFP (o sistema CEN2 – GFP 17) foram rotulados e as células foram filmadas para tornar as quimógrafos . Durante a mitose na ausência de MBC, um único ponto SFI1-CFP foi dividido no início mitótico (Fig. S4a suplementar). Simultaneamente, o CEN2 – GFP nos concentra começou a oscilar entre os dois SPBAS à metáfase. Os pontos CEN2 – GFP foram então separados em relação a cada SPB (AnAfase a), e a distância inter-spb aumentou, refletindo o alongamento do fuso (Anafase B) 17, 18. Uma cinética semelhante foi observada durante o MII (WT MII, -MBC, Fig. 2A). Quando a MBC foi adicionada no início mitótico, os SPBS pararam de dividir e os focos CEN2-GFP deixaram de oscilar (Fig. S4B complementar), que causou uma falha na segregação de cromossomos. Em contraste, 80% dos Cigotes MII tratados com CEN2-GFP de dois pólos segregados MBC (WT MII, + MBC, Fig. 2A, B), que indica novamente que o MII é muito menos sensível ao MBC do que a mitose e o IM .
(a) kymógrafos de As células do tipo selvagem (WT) e mad2 foram submetidas à experiência de MII em ausência (-) ou presença (+) de MBC (n ≥14). Os centrômeros do cromossomo II foram marcados com o GFP (CEN2- GFP), e seu SPB foi controlado com SFI1-CFP (vermelho). A MBC foi adicionada antes da separação do SPB. O comprimento das setas corresponde a 5 min. (b) A precisão da segregação de cromossomos durante o IMS em tipo selvagem e mad2 foi quantificada (estanho não emparelhado, n ≥14). Imagens típicas também são mostradas para a segregação de CEN2-GFP igual e desigual. (c) A duração do MII foi medida ao monitorar os sinais CUT11-3MRFP. Cut11-3mrfp formou projectores no SPB na entrada do Mii e desapareceu no início da anáfase. As linhas no diagrama da caixa e os bigodes de pequeno para baixo são o valor máximo, o percentil 75, a mediana, o percentil 25 e o valor mínimo (N ≥16). Os asteriscos indicam valores atípicos. (d) Localização do MAD2 durante o MII em ausência (esquerda) ou presença (direita) da MBC (n ≥10). MAD2-MCHERRY (MAD2-MCH, RED) foi monitorado com MIS6-2GFP (verde) e SFI1-CFP (azul). O tempo em que os holofotes MAD2 apareceram pela primeira vez no CineSchers é designado como 0 min. A adição de MBC retinha MAD2 no Cinetocoras por mais de 12 minutos, altura em que os focos MAD2 se mudaram para SPB na ausência de MBC. Barras de escala, 2 μm. (e) A duração da localização do MAD2 no Cinetocoros com ou sem MBC foi determinada a partir das observações em d. Tenha em mente que o local MAD2-MCHARRY no SPB, que significa uma liberação de ativação do ponto de controle, não é contada aqui. As linhas no diagrama da caixa e os pequenos bigodes são o valor máximo, o percentil 75, a mediana, o percentil 25 e o valor mínimo (N ≥10). Os asteriscos indicam valores atípicos. (f) A progressão meiótica da cultura síncrona Diplóide Pat1-114 foi monitorada contando o número de núcleos por célula em cada ponto de tempo. A meiose foi induzida pela mudança de temperatura (a 0 h). A MBC foi adicionada quando a população de células binucleadas (pós-MI) estava no máximo (a 3,3 h). (g) A viabilidade dos esporos das células diplicos Pat1-114 tratadas com ou sem MBC como em F foi examinada por análise de tetrade (n > 300).
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Na mitose e im, o ponto de controle do conjunto do fuso (SAC) opera para monitorar a conexão dos microtúbulos para o Cinetocorus. Os componentes do SAC, incluindo MAD2, reconhecem CineTockers United e inibem a ativação do complexo de promotor de anáfase / ciclosoma, para que as células possam esperar na metáfase até que a União melhore 19. Durante a mitose, a MBC causa defeitos no fuso e do saco ativo 15, 20. É possível que a atividade sac seja necessária para IPMT independente IMI causada pela MBC.Desta forma, monitoramos o comportamento CEN2-GFP no mutante de remoção MAD2 (MAD2 δ). Na ausência de MBC, os Zigotos Mad2 sofreram uma segregação cromossômica normal como nos cigrotas do tipo selvagem (MAD2 Δ MII, -MBC, Fig. 2a, B). Quando a MBC foi adicionada no início do MII, ~ 60% das zigotes de exposição MAD2 apresentaram uma segregação desigual da CEN2-GFP, que foi significativamente maior do que a segregação desigual ~ 20% que ocorreram em ciglote do tipo selvagem (Figura 2B). Os cigrotos do tipo selvagem tratados com MBC durante o Mii mostraram um atraso no início do Anafase II (Fig. 2C). Isso foi cancelado eliminando o MAD2, que indica que o atraso foi devido à ativação do saco (Fig. 2C). De acordo com isso, Mad2-Mcherry mostrou uma localização prolongada de CineTocoros em cigarros do tipo selvagem na presença de MBC (Fig. 2D, E). Estes resultados indicam que, durante o MII na presença de MBC, o MAD2-SAC garante a ligação correta dos microtúbulos aos CineTockers, sugerindo que os restantes microtúbulos curtos que sobreviveram após a adição do MBC realmente servem como ktmts e que o seu adequado O apego a Kinetocores desativa a vigilância mad2-sac (fig. s3e, f) suplementar. Esses resultados também indicam que é improvável que a divisão independente do IPMT seja uma incompatibilidade desregulamentada que leva a uma segregação aleatória de cromossomos e ao desapego do núcleo inadequadamente, como mutações letais.
Avaliar se o tratamento com MBC durante o MII pode afetar a viabilidade dos esporos. O mutante Pat1-114 foi utilizado para induzir a meose síncronizada 21, 22, 23. A MBC foi adicionada em 3,3 h após a indução da meiose, quando a população celular com dois núcleos (ou seja, pós-mi) estava em um máximo (~ 90%, Fig. 2f). A MBC causou uma redução na viabilidade dos esporos a 50% da das células tratadas simuladas (Fig. 2G). Este valor pode refletir a fidelidade da segregação cromossômica: a frequência da segregação fiel do CEN2-GFP nas células MCI tratadas com MBC foi de 80% (Fig. 2b), o que implica que a frequência estimada da mesma segregação dos três cromossomos seria 51% (0,8) 3 = 0,512), que é comparável à viabilidade dos esporos observados na presença de MBC.
A membrana forespora é responsável pelo MII sem IPMTs.
Como o IPMT foi dispensável para os eventos MII, nos perguntamos o que poderia servir como o pilar estrutural para separar os SPBs e manter a estrutura bipolar, independentemente do IPMT. Como Mii é acoplado à esporulação (o evento terminal na meiose correspondente à gametogênese nos eucariotos superiores), suspeitamos que algum sistema citoosquelético relacionado à esporulação poderia estar envolvido nos eventos independentes do IPMT. Um candidato poderia ser a membrana de esporos, que é um precursor da membrana plasmática do esporo em torno dos núcleos durante o MII 24. A membrana dos esporos foi exibida com a proteína T-Snare marcada com GFP PSY1 / SYNTAXIN 1 (GFP-PSY1) 25. Como relatado anteriormente, a membrana das forésperas começou a reunir em torno dos SPBs na forma de meia-lua depois que foram separados por IPMT (15 min, Fig. 3A). A membrana gradualmente encapsulou os núcleos como a Anafase II progrediu (36 min e 72 min). No entanto, nos Cvotos tratados com MBC, a separação do SPB sem IPMT ocorreu simultaneamente com o início do crescimento da membrana de esporos (30-35 min, Fig. 3a). A membrana de esporos continuou a crescer e finalmente cercou os dois núcleos, o que resultou em sua divisão (100 min). Isso nos levou à hipótese de que, na ausência de IPMTS, a membrana da Foroso pode servir como esqueleto estrutural, cujo crescimento para o exterior poderia gerar uma força que separa os SPBs e restringe o núcleo.
(a) Imagens celulares vívidas de cighotos mii que portan gfp-psy1 (membrana de esporos, verde) e CFP-ATB2 (vermelho) na ausência de MBC (acima) (n = 18). MBC foi adicionado antes da aparência de MII (inferior) (n = 18). A separação do SPB ocorreu concomitantemente com o início da montagem da membrana de esporos. (B) MII foi filmado por células transportadas SPO15 carregando GFP-ATB2, Miss6-2MCherry (Miss6-2MCH) e SFI1-CFP na presença de MBC (n = 10). Os SPBs não foram separados no final da observação (94 min). (c) o duplo mutante SPO15 Δ Cut7-446 que carrega GFP-ATB2, Miss6-2Mcry e SFI1-CFP é submetido a MII a temperatura restritiva.O duplo mutante exibiu o fenótipo do fuso monopolar (n = 8), indicando que a membrana do foresporama tem um papel crucial na formação de fuso bipolar durante o MII em células Cut7-446. (d) Padrões de segregação de cromatizações de Irmãs durante o MII em cigarros do tipo selvagem e Meu14 Δ SPN6 monitorado monitorado pelo CEN2-GFP com SFI1-CFP (teste T-Tails de duas caudas, N ≥14). Imagens típicas também são mostradas para a segregação de CEN2-GFP igual e desigual. (e) a divisão nuclear durante a MII de cigrotos do tipo selvagem e Meu14 Δ SPN6 Δ foi monitorada por Cut11-MCherry (Cut11-MCH); As células foram classificadas como submetidas à divisão normal, divisão anormal ou sem divisão (n ≥18). Imagens típicas de cada categoria também são mostradas. (f) O anel de borda anterior formado no núcleo foi exibido com Meu14-MCherry (Meu14-MCH) (N ≥ 24). (Para cima, à esquerda) na ausência de MBC, a borda de ataque se formou após a separação do SPB. (Para a direita) na presença de MBC, os anéis de borda anterior formados de cada SPB foram contatados entre si, que foi mantido durante a separação do SPB (indicado por um marcador SPB, Cut12-CFP) e crescimento da membrana de esporos (exibidos com GFP). -Psy1). Os desenhos esquemáticos dos núcleos (laranja) e os anéis da borda de ataque (vermelho) também são mostrados. (Parte inferior) O complexo de septenta foi exibido com SPN6-MCherry (n ≥ 8). (Para a esquerda) na ausência de MBC. (Para a direita) na presença de MBC. Os desenhos também são mostrados para núcleos (laranja) e o complexo de septento (vermelho). Barras de escala, 2 μm.
Se a membrana das forespias dirige a separação do SPB na ausência de IPMT, a inibição simultânea da membrana de foresporas e a formação de microtubules vai dificultar. Para testar essa possibilidade, usamos o mutante SPO15 Δ, no qual os SPBs não são modificados corretamente e a membrana do foresporama não é montada nelas 27. A separação do SPB nunca foi observada nas células tratadas tratadas com MBC (94 min, Fig. 3B), que mostra que, na verdade, foi a membrana da Forosa que impulsionou a separação da SPB na ausência de IPMT. Além disso, não foi observada segregação de cromossomos ou divisão nuclear. Da mesma forma, a separação do SPB que ocorreu durante o MII no CUT7-446, foi bloqueada pela remoção do SPO15 (Fig. 3c). Portanto, a membrana da Forespora compõe os defeitos estruturais do fuso bipolar causado por uma perda ou falha do IPMT no deslizamento dos microtúbulos antiparale. Ambas as células tratadas do SPO15 tratadas com células MBC (Fig. 3B), tais como células CUT7-446 SPO15 7 (Fig. 3c) não conseguiram separar SPBs, segregar os cromossomos e dividir o núcleo, embora essas células tivessem microtubules remanescentes em torno do SPB. Essas observações mostram que esses eventos meióticos independentes do IPMT são controlados apenas pela membrana do esporo, mas não pelo KTMT restante.
o anel de ponta e o complexo de septina.
o crescimento A borda da membrana de fita é limitada pela estrutura da borda de ataque, que contém proteínas como Meu14 (Refs 28, 29) e é suportada pelo Complexo de Septina 30 (SPN2, SPN5, SPN6 e SPN7). Tanto a estrutura de ponta quanto o complexo de septenta são necessárias para navegar pelo crescimento da membrana de esporos na direção correta 30. Nós bloqueamos a função de ambas as estruturas usando duplos MUTANT MEU14 Δ SPN6 sobre para desorientar o crescimento da membrana do esporo. As células tratadas com MEU14 Δ SPN6 tratadas com o MBC poderiam separar SPB durante a MII até certo ponto, provavelmente porque a membrana da forespora poderia ser montada inicialmente sem septinas e Meu14. Essas células, no entanto, muitas vezes falharam na segregação de cromátides de irmãs igualmente e na execução da divisão nuclear (Fig. 3D, e).
Significativamente, os anéis de borda anterior formados a partir de ambos os SPB Mantido contato físico uns com os outros quando os SPBs se separaram na ausência de IPMT (Fig. 3F). O complexo de septenta exibido pela SPN6-Mcherry também apareceu simultaneamente com a aparência de anéis de borda de ataque para alinhar a membrana do esporo (Fig. 3F). Estes resultados juntos fornecem evidências genéticas e visuais de que a membrana forponta orientada corretamente pelo anel da borda de ataque gera uma tensão interpolada, que de fato leva a uma constante separação de SPBs, a segregação de cromossomos e constrição nuclear. O anel da borda de ataque contendo Meu14 é apoiado com F-Actin 31.Quando a polimerização da actina foi inibida com a latrunculina A na presença de MBC, o anel da borda de ataque não se contraiu e falhou na segregação de cromossomos e na divisão nuclear, embora uma separação de SPB (Fig. S5 complementar) ocorreu. . Este fenótipo é semelhante ao de Meu14 Δ SPN6, validando a proporção funcional do anel de borda de ataque e Actin.
Contribuição de membrana forponta para o MII fisiológico.
Todos os resultados acima sugerem que a membrana de esporos funciona como um dispositivo estrutural que ajuda o fuso. Para testar se as máquinas mediadas a membrana dos esporos também contribui para o MII fisiológico, em que os microtúbulos não são perturbados, usamos o spo15 mutante, o que não forma a membrana do esporo. Embora o SPO15 não seja essencial para a progressão do MII 27, nos concentramos particularmente na fidelidade da separação do SPB, monitorando um componente do complexo de poros nucleares, CUT11-3MRFP. Esta proteína está localizada nos SPBS quando incorporada no envelope nuclear no início da fase M 32 (Fig. 4a) e já não estão associados a eles no início da anáfase. Para cada núcleo, registramos o tempo de separação do SPB, conforme indicado pela divisão de abordagem única Cut11-3mRfp. Surpreendentemente, o SPO15 durante as células durante MII ocasionalmente mostrou o desaparecimento de um único ponto de corte, sem separação, o que sugere que a separação do SPB não ocorreu em MII (Fig. 4a e Tabela 1). Nenhuma falha foi observada na separação de SPB durante a mitose e mi em células SPO15 Δ (Fig. 4a e Tabela 1). Portanto, a membrana de esporos, pelo menos em parte, contribui para a separação eficiente da SPB durante o MII fisiológico.
(a) O comportamento de Cut11-3mrfp foi filmado em tipo selvagem e SPO15 em células no início da mitose e MII (N ≥ 26 ). Em células tipo selvagem (WT), a Cut11-3mrfp foi constitutivamente localizada no envelope nuclear e formou focos adicionais em SPBs na entrada MITICIC / MII; Este local continuou através da separação do SPB (visível como dois holofotes) e desapareceu no início da anáfase. No entanto, nas células SPO15 Δ na entrada MII, os focos Cut11-3mrfp ocasionalmente desapareceram sem serem divididos, indicando uma falha na separação do SPB no início da anáfase (26-29 min). (b) Kymógrafos de lapso de tempo mostrando a cinética do fuso durante o MII em células do tipo selvagem, SPN6 Δ e Meu14 Δ SPN6 (n ≥8). Um dos dois pontos CORT12-CFP (SPB) em cada ponto de tempo alinhado Na parte inferior da imagem para enxaguar um aumento na distância inter-spb. A duração das setas corresponde a 5 min. Barras de escala, 2 μm. (c) A cinética da SPB foi representada graficly em tipo selvagem, SPN6 δ e Meu14 Δ SPN6 observou células observadas observadas em b. Cada linha representa a cinética para um único núcleo (n ≥8).
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Tabela Tabela
investigar mais completamente se o crescimento da membrana do esporo contribui para a separação do SPB durante o MII fisiológico, monitoramos a cinética da distância inter-spb (marcada pela Cut12-CFP). A distância inter-spb aumentou uma maneira gradual durante o MII em células do tipo selvagem, como aconteceu durante a mitose (FIG. 4b, c). Em contraste, o crescimento desorientado da membrana dos esporos no MEU14 Δ SPN6 foi freqüentemente associado a uma flutuação na distância entre a Inter-SPB (Fig. 4B, C). Uma flutuação semelhante, mas menos perceptível foi observada no SPN6 Mutante Único (Fig. 4B, C), que indica que Meu14 e SPN6 operam no guia da membrana de esporos em uma rota paralela 30 (Fig. 5a para um esquema). O A taxa de separação do SPB no MEU14 Δ SPN6 pode ser transitoriamente mais rápida do que a das células do tipo selvagem (Fig. 4c), provavelmente porque o crescimento desorientado da membrana forresporase forçou uma rápida separação de SPBS. Esses resultados mostram que a dinâmica da membrana do esporo contribui efetivamente para a cinética da separação do SPB durante o MII sob condições fisiológicas. Além disso, Meu14 Δ SPN6 mostrou células mostraram uma divisão anormal de 20% dos núcleos de MII, sugerindo a importância da organização adequada de A membrana do esporo para uma constrição precisa do núcleo.
(a) Ilustração esquemática da função de septinas e proteínas de ponta (LEP) na montagem da membrana de esporos.Septins e LEPs têm um papel importante na orientação da membrana de esporos. No tipo selvagem (WT), a borda de crescimento da membrana florestal é limitada pela LEPS que incluem Meu14 para orientar adequadamente e construle a membrana da Foroso. O Meiotic Septine Complex (SPN2, SPN5, SPN6 e SPN7) orienta a direção do crescimento da borda. As septas e o LEPS controlam cooperativamente a gestão do crescimento da membrana forponta. O fenótipo de espórteria pobre é mais proeminente quando o SPN6 combinado é combinado com Meu14; Portanto, o duplo muitante Meu14 Δ SPN6 foi usado neste estudo como uma tensão que não tem septina e LEP. Nas células SPN6 de MEU14 Δ, a membrana de esporos não pode encapsular adequadamente o núcleo, levando à produção de esporos defeituosos. (b) Este estudo propõe um novo papel para septinas e LEPS na segregação de cromossomos e divisão nuclear durante o MII. Na ausência de IPMTS (WT + MBC), a membrana forespora, que começa a montar de SPBS, divide os SPBS. A membrana de esporos é então guiada por estruturas contendo septina e LEP para cercar o núcleo. Quando a MBC é adicionada a células Meu14 Δ SPN6 ((MEU14 SPN6 Δ + MBC), a montagem da membrana de forespora é desorientada e a segregação de cromossomos ou divisão nuclear não é produzida. Como o SPB emanando dos microtubules é conectado à membrana de esporos , sua montagem descoordenada pode afetar a eficiência e a fidelidade da União Kinetochore MicroTubules. Além disso, septinas e LEP restringem o núcleo livre do IPMT gerando uma força que normalmente é usada para encapsular o núcleo após a divisão nuclear mediada por IPMT no tipo selvagem. .
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discussão
Nós demonstramos a função sem precedentes da membrana de esporos na separação do SPB, a segregação de cromossomos e Divisão nuclear durante o IIM. Propomos que, no estágio inicial do MII, a membrana florestal em desenvolvimento gera uma força de separação do SPB de SPBs correspondidos HA. Está fora ao longo da membrana nuclear e, em seguida, suporta fuso bipolar para uma segregação eficiente de cromossomos. Na ausência de IPMT, as estruturas de borda progressos se desenvolveram a partir dos dois colidores SPB, e sua força de repulsão gera uma tensão física entre os SPBS (Fig. 5). O aparelho de divisão mediado pela membrana de esporos, reforçado pela estrutura da borda do ataque e septina, pode facilitar a segregação igualmente dos cromossomos e a constrição do envelope nuclear, mesmo na ausência de IPMT. Curiosamente, o MAD2-SAC foi obrigado a garantir o momento adequado da segregação de cromossomos na ausência de IPMT, o que implica que a constrição nuclear mediada pela membrana do esporo poderia ser regulada pelo complexo do promotor da anáfase / ciclosoma. Com base na capacidade da membrana do esporo para compensar a ausência de IPMT durante a IAS, acreditamos que as funções cruciais do IPMT são as seguintes: ancorar os pólos do fuso para o envelope nuclear para garantir a força da segregação dos cromossomos e dividir o núcleo em anaphase.
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A divisão celular sem o homólogo do tubulin FTSZ é produzida em cepas de bactérias de subtilis Bacillus que estão com defeito na organização da parede celular 33. Recentemente, foi relatado que uma divisão nuclear independente dos microtúbulos (fissão nuclear) ocorre na mitose de S. Pombe quando a citocinesia (formação da parede celular na saída mitótica) é artificialmente inibida, embora não seja claro como é gera força. Neste estudo, esclarecemos mecânicos para gerar a força necessária para a divisão nuclear sem IPMT durante o MII: O contato físico das bordas da membrana do esporo é o pivô. Em contraste com os estudos anteriores para a mitose, a força mediada pela membrana do esporo aparentemente contribui para o MII fisiológico.
Especulamos que a referida maquinaria mediada por máquinas pode ter sido desenvolvida como um sistema de backup para a segregação de cromossomos durante o MII, em que a estrutura do fuso pode não ser tão robusta quanto durante a mitose ou im. O eixo meiótico é construído primeiro durante o primeiro e depois desmantel, seguido pela reconstrução durante o MII. Em particular, a MII é uma “meiose virtualmente aberta” na qual as proteínas nucleares são dispersas fora do núcleo durante a Anafase 34, 35. Essas situações podem envolver que a organização do fuso pode ser menos eficiente em ima do que na mitose.Por outro lado, Mii deve ser acoplado com o encapsulamento dos núcleos dos irmãos pela membrana de esporos. Portanto, a membrana forespora pode ter necessária a capacidade de gerar uma força que ajuda as funções do fuso. A estrutura da membrana que envolve proteínas de ponta e septina adquiriu uma dupla função: o encapsulamento do núcleo e a assistência da segregação de cromossomos. É interessante observar as semelhanças e diferenças entre essa estrutura e a matriz de string, que deve manter a estrutura do fuso em eucariotas mais altas, como esqueleto feito de materiais que não são microtubules 36. Uma organização membranosa que inclui a folha B foi recentemente mostrada que funciona como uma matriz do fuso que envolve todo o fuso da prometafase para manter sua estrutura 37, 38, 39. No entanto, além de ser um andaime estrutural, a membrana forespora pode gerar uma força para a separação de SPB e divisão nuclear. Eucariotos superiores podem ter desenvolvido uma maquinaria dependente de microtúbulos como o dispositivo vantajoso do gerador de força, e a matriz do fuso membranial pode ter diferenciado como uma estrutura de suporte.
Castas de levedura e procedimentos genéticos.
As cepas utilizadas neste estudo estão listadas na tabela complementar S1. Os métodos padrão baseados no PCR para a orientação do gene 4, 40 foram utilizados para construir geradores de genes e cepas marcadas com proteas fluorescentes com marcadores de seleção Cassetes genéticos, exceto a tensão GFP-PSY1 26, que foi construída pela integração de um plasmídeo contendo GFP-PSY1 construção de fusão (um presente de T. nakamura). A. Yamamoto 17 forneceu a cepa CEN2 – GFP. Resumidamente, as sequências de Lachco repetitivas foram inseridas perto da região de Centromera do cromossomo II (CEN2), reconhecida por uma proteína de fusão de localização de fusão de localização de laço de gfp nuclear-gfp. Para a indução da meiose, as células HOTÓTELIC H 90 foram observadas no meio de águas de esporulação para todos os experimentos, exceto para o teste de viabilidade de esporos mostrado na Fig. 2F, G (veja abaixo).
Sincronização da meiose e Teste de viabilidade de esporos.
Para o teste de viabilidade do esporo (Fig. 2F, g), usamos um sistema para induzir a meiose sincronizada usando o diplóide (H – / H -) Pat1-114 + Pat1-114 + PC tensão 41, determinando assim quando a população binuclada estava no seu pico (e, portanto, ao adicionar MBC). Para controlar a progressão meiótica com o número de núcleos, as células foram manchadas com 4 ‘, 6-diamino-2-fenilindol após a fixação de 50% de metanol. A viabilidade dos esporos foi examinada pela análise de tetrade. Os esporos foram germinados no meio rico em extrato de levedura. A viabilidade é a média de três experiências independentes.
Microscopia
para obter imagens de células mitóticas de células ao vivo, células de crescimento logarítmico cultivadas em meio definido sintético rico em tiamina a 30 ° C durante ≥ 13 h. Para obter imagens de células vivas em meiose, Cvotos foram usados localizados no meio de águas de esporulação a 25 ° C durante ≥8 h. As células vivas foram observadas no meio mínimo de Edimburgo com ou sem uma fonte de nitrogênio para analisar o ciclo ou a meose mitótica, respectivamente. As imagens das células vivas foram realizadas como descrito 4 em um sistema Deltavision-Softworx (precisão aplicado) usando um microscópio (IX71, Olimpo) equipado com filtros de fluoresceína isotiocianato, mcherry e CFP (tecnologia Chroma), APO N × 60 (NA, 1,42 ) ou um óleo de uplagem de óleo Sapo × 100 (NA, 1,40) óleo (Olympus), uma câmera HQ2 CoolSnap (fotométrica) e um controlador de temperatura (controle de precisão) a 25 ° C, exceto figs 1g e 3c e suplementares figs s2 e s3e , FO (32 ° C foram utilizados para o mutante sensível à temperatura Cut7-446 e NUF2-1). A seção Z foi realizada em intervalos de 0,4 ou 0, 5 μm, e as imagens foram tomadas a cada 1 a 5 min. As imagens foram descoadadas e uma projeção de pilha Z foi criada com a soma ou método máximo. A mudança de temperatura para mutantes sensíveis à temperatura foi realizada pelo menos 1 h antes da observação.
tratamento de drogas
em imagens celulares vivas, imagens pela primeira vez que foram tiradas sem MBC. Então MBC (Sigma-Aldrich) foi adicionado numa concentração final de 50 μg ml -1 em todos os experimentos. Latrunculina A (Invitrogen) foi adicionado a uma concentração final de 50 μm pelo menos 1 h antes de obter imagens de células vivas.
estatísticas
um teste T não foi usado filas não tratadas para análises estatísticas .