lipases e As esterases são biocatalisos versáteis e o tipo mais utilizado de enzimas para fins biotecnológicos. O Ophiostoma Picaae produz uma esterase esterol (OPE) com alta afinidade em triglicerídeos e ésteres esterológicos que é capaz de hidrolisar misturas eficientemente naturais desses compostos de extrativistas de madeira. Devido a essas propriedades, o uso dessa enzima foi proposto para diminuir o problema de deposição de campo em folhas de madeira e pulpação macia. A sequência de proteína madura da OPE foi expressa com sucesso em cepas Mut + e Muts Pichia Pastoris, que diferem em sua capacidade de metabolização de metanol como indutor de expressão, resultando em níveis mais altos de atividade do que os obtidos em culturas de O. Pikeae Erlenmeyer. Além disso, a produção de enzima recombinante (OPE *) foi dimensionada para o biorreator operando em processos em lote e lote de alimentação usando ambas as cepas. Em todas as condições ensaístas, os níveis de atividade foram maiores do que os obtidos no frasco de Erlenmeyer, atingindo a atividade máxima (30 U / ml) com tensão de muts operando em uma estratégia de co-alimentamento de sorbitol durante o cultivo do alimentado.
O cinético A caracterização da proteína recombinante mostrou uma enzima melhorada com maior eficiência catalítica aparente do que a enzima nativa (~ 8 vezes) para todos os substratos ensaísta (P-nitrofenol, glicerol e ésteres de colesterol). Nem o maior nível de n-glicosilação nem a presença de resíduos de metionina oxidados na região de ligação de substrato da OPE * parecem ser responsáveis por essa melhoria. Estudos de dicroismais circulares mostraram alterações em seus espectros, mas a análise de dados (método K2D da Dichroweb) resultou em um conteúdo idêntico de -hélice (0,46) e folha (0,23) para ambas as proteínas, então não foram reveladas alterações na estrutura secundária. A principal diferença foi encontrada na sequência N-terminal da OPE * que continha 6-8 mais resíduos que o OPE. Estes foram derivados do vetor utilizado para a expressão de proteína acoplados com um processamento ineficiente do pré-proponente do fator de acasalamento de Saccharomyces cerevisiae utilizado para secreção. Isso afeta o estado de agregação detectado em OPE * (menor que o relatado na OPE) melhorando sua eficiência catalítica. Novas aplicações biotecnológicas para esta enzima foram estudadas desde: i) é capaz de desacetilato de acetato de polivinilo (PVAC), um dos compostos identificados nas carapes formadas durante a produção de papel reciclada, o que foi confirmado usando espectroscopia de FTIR, análise de espectrometria de massa e Titrimetria. Os resultados obtidos sob as condições ensaios foram comparáveis aos obtidos com o especificamente comercializado para este objetivo Optizyme® 530. II) sintetiza ésteres em mídia orgânica e tem sido usada na síntese de ésteres de fitoterol, como produtos nutracêuticos. Neste caso, a influência do substrato e da concentração da enzima e do efeito de diferentes solventes orgânicos com e sem água nas reações foram estudadas. Os resultados mostraram que as enzimas de O. Pikeae parecem ter uma atividade sintética semelhante, ainda melhor sob algumas condições, para a enzima comercial de C. rugosa usada; Obtendo uma produção geral de ésteres Steryl de 60-80% dentro de 24 horas, dependendo do excesso de substrato molar, fato que foi patenteado. Em relação à sua potencial aplicação industrial, a enzima nativa foi imobilizada com sucesso por meio de grupos epóxi ativados no novo transportador Dilbeads ™. O biocatalisador imobilizado mostrou melhorias significativas em valores elevados de pH e temperaturas do que a enzima solúvel e foi capaz de hidrolisar o oleato colesteryl ao longo de vários dias, quando foi embalado como um biorreator. Finalmente, diferentes experimentos de cristalização foram feitos com enzima nativa. No entanto, seu comportamento de alta agregação não permitiu obter cristais de boa qualidade para difração de raios X.
Las Lipasas Y Esterasas Filho Biocatalizadores Versátilis Y El Tipo Más Utilizado de Enzimas Pará Biotecnológicos. EL HONGO OPHIOSTOMA PICEEE PRODUCE UN ESTEROL ESTERRASA (OPE) Con Alta Afinidad Sobrechicéridos Y Ésteres de Esterol Siendo Capaz de Hidrolizar EficaZmente MezClas Naturales de Estos Compuestos Um Partir de Extrostos de Madera. Debido A Estas Propiedades, SE HA PROPUESTO El USO DE ESTA ENZIMA PARA DISMINUIR El Problema de la Deposición de La Fabricante de Madera Procedente de Coníferas y Frondosas. La Secuencia de la Proteína Madura de la Ope Se Ha Expresado Con ÉXITO en Cepas Mut + Y Muts de Pichia Pastoris, Que Difieren en Capacidad de Metabolizar Metanol Como Indutor de La Expresión, Dando Como Resultado Niveles Más Altos de Actividades Que Los Obtenidos PT Cultivos en erlenmeyer de O. picaae.Além disso, a produção da enzima recombinante (OPE *) foi dimensionada para o biorreator operando em cepas descontínuas descontínuas usando ambas as cepas. Em todas as condições testadas, os níveis de atividade foram maiores do que os anteriormente obtidos no frasco de Erlenmeyer, atingindo a atividade máxima (30 U / ml) com a estirpe de muts operando em uma estratégia com sorbitol como co-substrato durante a cultura descontínua alimentada. A caracterização cinética da proteína recombinante mostrou uma enzima reforçada com uma maior eficiência catalítica aparente do que a enzima nativa (~ 8 vezes) para todos os substratos testados (ésteres de p-nitrofenol, glicerol e colesterol). Nem o nível mais alto de N-glicosilação nem a presença de resíduos de metionina oxidados na região de ligação ao substrato OPE * parecem ser responsáveis por esta melhoria. Estudos de dicroismais circulares mostraram mudanças em seus espectros, mas a análise de dados (método K2D do Dichroweb) resultou em um conteúdo idêntico em hélices α (0,46) e folhas β (0,23) para ambas as proteínas indicando ausência de mudanças na sua estrutura secundária. No entanto, a principal diferença neles foi encontrada na sequência N-terminal da OPE * contendo 6-8 resíduos em vez de OPE. Estes resíduos vieram do vetor utilizado para a expressão da proteína e o processamento ineficiente do fator α de Saccharomyces cerevisiae utilizado para secreção. Isso afeta o estado de agregação detectado na OPE * (menor do que o descrito na OPE), que melhora sua eficiência catalítica. Diante de seu potencial, novas aplicações biotecnológicas foram estudadas para esta enzima: i) Desaotate de acetato de polivinilo (PVAC), Um dos compostos identificados nos stickies formados durante a produção de papel reciclado. A capacidade da enzima para realizar essa reação foi confirmada pela espectroscopia FTIR, análise de espectrometria de massa e titulação; Assim, os resultados obtidos, nos termos das condições de teste, mostram uma atividade semelhante à da enzima Optizyme® 530 comercializada para essa finalidade. ii) Síntese de ésteres em mídia orgânica, especificamente ésteres de fitoresterol, como produtos nutracêuticos. Neste caso, a influência da concentração de enzima e substrato e o efeito de diferentes solventes orgânicos, juntamente com a presença e ausência de água nas reações foram estudadas. Os resultados obtidos permitiram patentear o emprego da enzima para esse fim por serem semelhantes aos alcançados com a enzima comercial de C. rugosa empregado em comparação e ainda melhor em algumas circunstâncias. Uma produção total de ésteres de esterol de 60% em 24 horas foi observada quando uma pequena substância foi utilizada aumentando 80% com excessos mais antigos. Pensando em seu possível uso industrial, a enzima nativa foi imobilizada com sucesso por meio de grupos epóxi ativados em um novo suporte chamado Dilbeads ™. O biocatalisador imobilizado provou ser significativamente mais estável em valores elevados de pH e temperatura do que a enzima solúvel e retinha a capacidade de hidrolisar o oleato de colesteril por vários dias em que foi embalado como um biorreator. Finalmente, diferentes experimentos de cristalização foram realizados com a enzima nativa. No entanto, a alta tendência mostrando para formar agregados impediu a obtenção de cristais de boa qualidade para estudos de difração de raios X.