Ensinamento de artigos de pesquisa opcionais
Avaliação de três substratos empregados na imunofluorescência indireta Anticorpos antimitriais de medição de teste para diagnóstico de cirrose biliar primária
Poma Huanca, Patricia1 Sosa Tordya, Luis Fernando1
Correspondência: Patricia Poma
AV. Saavedra 2224 (Edifício de Seladis, Piso 4). Telefone: 2612445
[email protected]
1 Instituto de Serviço de Laboratórios de Diagnóstico e Pesquisa em Saúde (Seladis) -FCFB-UMSA
Primário
A cirrose biliar (CBP) é uma doença hepática inflamatória crônica de etiologia desconhecida caracterizada pela destruição de dutos biliares intra-hepáticos que desencadeiam uma cirrose hepática. No presente estudo, foram avaliados três substratos comumente usados para detectar anticorpos antimitocondriais (AMA) por imunofluorescência indireta (IFI) para o diagnóstico de CBP. Os substratos avaliados foram: corte histológico (rim mouse), células HEP-2 (células epiteliais derivadas do carcinoma laríngeo humano) e células BHK-21 (fibroblastos de rins do hamster dourados da Síria) que foram comparados com os resultados do teste confirmatório comercial que Medidas Anti-Mitocondrial M2 anti-antígenos (ELISA, Biotecnologia da Trindade).
25 Sera foram selecionados com resultados positivos para ELISA (índice 1,10UI / ml ). Os controles negativos foram soros de pacientes que não tinham história de doença hepática e apresentaram resultados negativos para AMA (índice < para 0,90 ui / ml).
Dos três substratos avaliados, a linha celular BHK-21 baseada em utilidade limitada, com valores de eficiência de 56%, sensibilidade de 48%, especificidade de 64% e uma taxa de concordância Kappa de 0,12 (baixa) em relação aos resultados do padrão de teste de ouro (ELISA-AMA). Para o substrato HEP-2, foi encontrada uma concordância moderada (Kappa = 0,6) contra o ouro padrão, foi obtida uma especificidade = 100%, sensibilidade = 60% e 80% de eficiência Os cortes renais de rato histológico mostraram uma sensibilidade, especificidade e eficiência de 92%; Eles também mostraram resultados com maior conformidade com o método ELISA (kappa = 0,84). Dos três métodos de imunofluorescência avaliados, foi determinado que o que usa cortes de rins histológicos é o mais eficiente e, portanto, pode ser uma ferramenta útil como um método de peneira no diagnóstico de CBP.
palavras-chave / p>
Cirrose biliar primária (CBP), anticorpos antimitocondriais (AMA), imunofluorescência indireta (IFI).
abstract
cirrose biliar primária (PBC) é um inflamatório crônico Doença hepática de etiologia desconhecida caracterizada pela destruição dos ductos biliares intra-hepáticos que desencadeiam a cirrose do fígado. No presente estudo avaliamos três substratos comumente usados para anticorpos mitocondriais (AMA) por imunofluorescência indireta (IIF) para o diagnóstico de PBC. Os substratos foram avaliados: histológicos (rins do mouse), células HEP-2 (células epiteliais derivadas do carcinoma humanimarygeal) e BHK-21 (hamster renal fibroblastos dourados sírios) que foram compartilhados com os resultados do teste confirmatório (enzima imunassa) antígenos comerciais Medido M2 Anticorpos Mitocondrial (ELISA, Trinity Biotech).
Selecionamos 25 soros positivos para AMA por ELISA (índice > 1.10 iu / ml). Controles negativos Os soros eram de patentes que não tinham história de doença hepática e tinham resultados negativos para AMA (índice < 0,90 UI / ml).
dos três substratos Testado, o baseado na linha celular BHK -21 mostrou-se a utilidade limitada, valores de eficiência de 56%, sensibilidade 48%, especificidade de 64% e índice de concordância Kappa de 0,12 (baixo) Meade nos resultados do ouro padrão Teste (ELISA -AMA). Para o HEP-2 foi acordo moderado (kappa = 0,6) versus o padrão ouro, obtivemos 100% de especificidade, sensibilidade = 60% e 80% da eficiência. Rim histológico do rato mostrou uma sensibilidade, especificidade e eficiência de 92%, os resultados também mostraram um melhor acordo com o método ELISA (kappa = 0,84). Dos três métodos de imunofluorescência avaliados foi determinado que o rim histológico do rato é o substrato mais eficiente e, portanto, poderia ser útil como um teste de triagem para o diagnóstico de CBP.
palavras-chave
primário Cirrose biliar (PBC), anticorpos anti-mitocondriais (AMA), imunofluorescência indireta (IIF).
Introdução
O CBP, bem como Ahrensy Payne, em 1950, é uma doença hepática progressivamente crônica, caracterizada por inflamação e destruição de linfócitos T de interlobular e septal, que culmina em um insuficiência hepática. Supõe-se que é uma doença auto-imune porque é comumente associada à acidose tubular renal, vitiligo, hashimoto tireoidite, síndrome de sjôgren, fenómeno de Raynaud, síndrome de crista, artrite reumatóide, lúpus lúpus sistêmico e deficiência na função de linfócitos t supressores (Zumueta & Navarrete, 2008).
As principais manifestações clínicas são fadiga, prurido, icterícia, presença de xantomas, xantelosmas e consequências da absorção intestinal, como uma deficiência de vitaminas e osteoporose (CBP1). A CBP afeta mais mulheres entre 30 e 60 anos de idade, a relação de envolvimento do homem feminino é de 9 a 1. Além disso, foi determinado que há associação genética com HLA-DR8. (Idrovo, 2007).
Um marcador sorológico característico da doença é a presença de AMA, sendo a alvo antigénica a proteína M2 da membrana interna da mitocôndria (componente E2 da piruvate desidrogenase), outros Proteínas antigênicas mitocondriais, como M4, M8 e M9, estão envolvidas em menos proporção. As AMAS estão presentes em 90% dos pacientes com PCC, e em 30% dos casos podem ser acompanhados por padrão fluorescente citoplasmático e / ou padrão periférico no teste anticorpo antinuclear. (Bruguera & ichiyanagui, 2008). Ele os ama em uma frequência menor, também pode ser encontrado em doenças hepáticas induzidas por drogas, sífilis, tuberculose e outras doenças autoimunes hepáticas. (O’Brien, Jordan, Guindi, Hans & Dienes, 2009).
O diagnóstico sorológico da CBP é baseado no IFI e na ELISA. O IFI usa como substrato cortes histológicos de fígado, estômago renal ou rato ou rato e a linha celular HEP-2. Os testes de ELISA usam como um substrato de antígeno do complexo de piruvato de desidrogenase obtido do coração bovino ou porcino (Dahnrich, pares, llorenq cavalaria, Wolfgang & probst, 2009).
Um recurso vantagem do teste IFI é que ele permite avaliar ao mesmo tempo vários tipos de proteínas antigênicas no mesmo substrato (exemplos: SP100, GP210, LB2, LKM1, LC1, SLA, M1 – M9) O que faz Teste muito sensível, por outro lado, o teste ELISA usa antígenos purificados para um único marcador de laboratório que lhe dê maior característica. No teste de ELISA, uma amostra contendo anticorpos de alta afinidade em baixa concentração pode apresentar a mesma densidade óptica que uma amostra com anticorpos de baixa afinidade, mas, portanto, com alta concentração, portanto, não fornece informações quantitativas, tal como a técnica IFI, em que é possível determinar Por uma série de diluição, o título de anticorpo máximo presente na amostra de um determinado paciente (cortês & malera, 2009).
entre 2008 e 2009, no Histocompatibilidade e laboratório imunogenético do Instituto de Seladis, foi observado que havia 162 pedidos de determinação de 162, 49 deu reactivo para a AMA. Para fazer um bom diagnóstico e monitoramento desse tipo de doença, métodos diagnósticos comerciais ou otimizados e alta sensibilidade e especificidade de diagnóstico. O conhecimento desses aspectos provoca a garantia em que o diagnóstico laboratorial por um determinado método é eficiente e confiável. Antes mencionados, três substratos são avaliados no trabalho atual (cortes renais de rato histológico, células Hep-2 de linha e linha celular BHK-21 do teste IFI para o diagnóstico de CBP que a Mide ama para determinar qual substrato é o substrato mais sensível , específico, eficiente e que tem um melhor acordo com o teste de ELISA que o Mide ama.
Materiais e métodos
População em estudo
As amostras utilizadas neste estudo veio de pacientes que participaram do Instituto de Seladis durante abril de 2008 a maio de 2009. As amostras positivas do painel soros vieram de pacientes com diagnóstico clínico da PCA com a sorologia negativa para a hepatite viral e deram resultados da ELISA (Biotecnologia da Trindade) para AMA positiva (Índice de amostra 1,10 ui / ml). As amostras do painel de sera negativas foram soros de pacientes aparentemente saudáveis sem história de doença hepática (resultados da transaminase, fosfatase alcalina e bilirrubina normal, sorologia para vírus da hepatite negativa e resultados de ELISA para a amante negativa (índice < 0,90 ui / ml).Cada um dos painéis séricos foi constituído por 25 amostras. Todos os pacientes que usaram os soros para construir os painéis de soros positivos e negativos deu seu consentimento para tornar sua amostra usada no presente estudo.
Análise de dados
Todos os dados do presente Os estudos foram realizados com a ajuda do banco de dados do Excel 2007, os indicadores estatísticos foram utilizados para validações como o índice Kappa e o teste Mac Nemar (López de Ullibarrri & Cura, 2008) .
Preparação de impressões
Imprints com o substrato de célula BHK-21
Todo este procedimento foi realizado no fluxo capuz laminar (Gelaire) e trabalhou com novos e material estéril.
Uma alíquota de células armazenadas em nitrogênio líquido e foi transferida para um tubo de 15 ml de falcão e 3 ml de RPMI 1640 foi então centrifugado a 2500 rpm por 5 min, desta vez foi eliminado pelo sobrenadante e o pellet foi ressuspenso em 1 ml de RPMI 1640 S Oppem (10% de soro fetal Bobino (SFB) suplementado, antibióticos (gentamicina e estreptomicina), depois transferidos para uma caixa de cultura de células de 25 cm2 e incubadas durante uma semana a 37 ° C, 5% C02 e 90% de umidade.
Uma vez que a placa estivesse em confluência por 10 min a 37 ° C para todas as células as células aderidas na base da caixa de cultura, a hora das células retirou 15 ml de tubo Falcon foi colocado e centrifugado a 1500 rpm por 5 min. O sobrenadante foi removido, o pellet foi ressuspenso em 1 ml de RPMI1640 suplementado e a concentração de células foi ajustada em células 2.5×106 / ml. Em 12-poços deslizantes (MP Biomedicals, EUA), as impressões foram preparadas colocando 8 ul das células ajustadas a cada poço. As impressões foram centrifugadas a 1000 rpm por 3 min e as impressões foram enroladas com parafluma (3m), para a conservação deles foram levadas a 4 ° C durante 30 min e depois preservadas a -20 ° C até o uso.
Imprints com o substrato rato histológico rim rins
rins de 25 camundongos (albinos suíços) de 28 semanas foram extraídos com peso médio de 20 g +/- 2 g, que foram doados pelo bioterio da faculdade de ciências farmacêuticas e bioquímicas. Os rins foram lavados com tampão salino de fosfatos (PBS) constituídos de fosfato de sódio 112,5 mmol / l, 30mmol / l fosfato de potássio, cloreto de sódio 1.15 mol / L, azida de sódio 0,95 g / l pH 7,5 Então, os rins foram colocados em um prato de petri contendo carboximetilcelulose de sódio (Sigma Aldrich) e estava congelando a -20 ° C até o momento de uso. Para executar os cortes de cristal, os tacos foram preparados com os rins embalados em 4% de carboximetil celulose de sódio. Os cortes foram realizados para congelar usando um cristal (Leyca) a -27 ° C, quatro cortes renais foram colocados para cada folha de slide. Os cortes feitos tiveram diâmetro médio de 5 mm e 5 de espessura de um.
Preparação do conjugado fluorescente
para determinar o título ideal do conjugado fluorescente (IgG anti-gammaglobulina e IgM marcados Com as diluições de fluoresceína (1/100, 1/150, 1/200 e 1/300) foram preparadas com DIL | U.YE do conjugado (50 ul de Evans Blue 0,4% em 3,5 ml de PBS).
Titulação do conjugado fluorescente para o “IFI que usa como um substrato cortes histológicos de células renais de mouse e linha BHK-21.
Para a titulação do conjugado fluorescente foi usado positivo e negativo Controles para o amor da casa comercial de Organtec, Alemanha.
As impressões com ACetone Pa (-20 ° C) foram fixadas por 8 min, hidratadas por 10 min em um jarro KOPLIN contendo PBS (10x) pH 7,2 . Diluções (1/10.1 / 20 e 1/40) dos soros de controle positivo e negativo foram realizadas. Então, 40 ul de diluições de soros foram semeadas , 30 min foi incubado à temperatura ambiente (T ° a) e numa câmara úmida para evitar a secagem de cortes histológicos ou células fixas. As impressões foram lavadas por 10 min em PBS e agitação contínua. As impressões foram secas com papel absorvente e foram colocadas novamente em uma câmara molhada. 25 UL foi colocado de diluições a serem avaliadas a partir do conjugado fluorescente (1/100.1 / 150, 1/200 e 1/300). Foi incubado na escuridão por 30 min a uma. Após esse período, o processo de lavagem e secagem descrito acima foi realizado. A solução de montagem (12% Mowiol, glicerol, 30% de glicerol, Tris 20 mmol / L, 0,95 g / L Azida de sódio) e uma cobertura foi colocada em cada slide para evitar a secagem das impressões. Finalmente, as placas de microscópio UV com aumento de 40x foram lidas.
Indireta imunofluorescência (IFI)
O teste IFI com células HEP-2, foi realizado de acordo com as instruções do fabricante do kit Comercial (o local de ligação, no Reino Unido).Resumidamente: 1/40 e 80 e 1/160 diluições foram realizadas dos soros e painéis de soros de controle.
30 minutos foram incubados para t ° A. As placas correspondentes foram lavadas durante 10 min e secas, conjugadas e incubadas em escuridão por 30 minutos, então as impressões foram lavadas e secas novamente e os meios de montagem foi colocado. Placas de microscópio UV com aumento de 40x.
Para a realização de testes IFI com células BHK-21 e cortes histológicos foi seguido o protocolo descrito na titulação conjugada, com a exceção que foi utilizada o título ideal do conjunto do conjugado para cada substrato. Com todos os substratos avaliados, foi utilizado um controle positivo e negativo (Orgentec) simultaneamente. O controle positivo da AMA deve produzir um padrão citoplasmático da cor da Apple verde com intensidade (++) da diluição de 1/40. O controle negativo não deve emitir fluorescência para 1/10 de diluição em células renais ou 1/40 em linhas celulares. (Site de ligação, 2011).
Para interpretação dos resultados do teste IFI, as amostras negativas foram consideradas quando houve ausência de fluorescência da Apple verde no citoplasma. Uma amostra foi considerada positiva se a coloração do citoplasma fosse maior que o controle negativo. (Fig. 1).
Para a finalidade do estudo, o kit ELISA que mede anticorpos contra o antígeno da trindade da marca M2 Mitocondrial, foi considerado como um padrão de ouro, que relata uma sensibilidade 91% e especificidade de 100% (Jones & MetCalf, 2008).
Ao fazer a análise anterior dos pacientes que participaram do serviço de laboratório foi determinado que de todos os testes solicitados para a detecção de doenças autoimunes durante dois arranjos (2008 e 2009), a determinação de AMA (ELISA) foi solicitada por 7% dos casos, sendo 69 pedidos de 2008 e 93 em 2009, tendo um total de 162 Casos presunçados de cirrose biliar primária nos dois arranjos. Das 162 amostras 49 foram feitas como reativas para AMA. Observou-se que a maioria dos pacientes diagnosticada como reagentes de amor eram mulheres (80%). Soros de 20 mulheres e 5 homens foram contemplados no painel positivo de sera. A idade média dos pacientes cujas amostras foram incluídas no presente estudo foi de 46 anos, com valores extremos de 22 e 77 anos.
Diluções foram realizadas: 1/10, 1/20 e 1/40 de controles positivos e negativos. O título ideal foi avaliado ao qual o conjugado poderia ser usado. As diluições foram avaliadas 1/100, 1/150, 1/200 e 1/300. Este experimento foi feito em triplicado e, como resultado, observou-se que a diluição de 1/150 foi obtida, verdadeira positiva (VP) e verdadeiros resultados negativos (vn) de sera de controle comercial,
Avaliação dos resultados do teste de diagnóstico nos três substratos avaliados
Ao avaliar a sensibilidade, a especificidade, os valores preditivos positivos e negativos e a eficiência dos três substratos avaliados, observou-se que a linha celular BHK-21 é o substrato menos eficiente, o substrato de célula HEP-2 mostrou menos especificidade, menor sensibilidade e, portanto, menos eficiência do que os cortes histológicos do substrato. Os resultados mostram claramente que o substrato cortes histológicos é o método mais eficiente para o diagnóstico por IFI para CBP.
determinação de Concordâncias de diferentes substratos empregados para resultados frontais AMA IFI encontrados por ELISA
Os testes de concordância utilizados foram: Kappa Index e o MC Test Nemar para dois testes relacionados (correspondentes). Os resultados dos diferentes testes de concordância (P < 0,05) para os diferentes substratos versus o método ELISA que mede anticorpos antigénio anti-mitocondrial (padrão ouro). O valor crítico esperado no teste MC Nemar foi de 3,84 (p < 0,05).
Os cortes histológicos mostraram um índice Kappa de 0, 84 que de acordo com a escala do índice corresponde a uma concordância muito boa com os resultados obtidos pelo método ELISA. O teste MC Nemar apresentou resultado de 0,25.
A linha celularBHK-21 apresentou um índice Kappa de 0,12 (concordância deficiente) com os resultados obtidos pelo método ELISA. O teste de chuveiro Mc Nemar mostrou um valor de 1,13.
A linha celular HEP-2 apresentou um índice Kappa de 0,6 (concordância moderada) versus os resultados obtidos pelo método ELISA. O valor do MC Nemar foi 12.1.
Porque os cortes histológicos mostraram ser o método IFI mais eficiente para o diagnóstico de CBP Por IFI, os resultados foram comparados com um método comercial IFI para AMA.O índice Kappa encontrado foi de 0,66 (uma concordância muito boa). O teste MC Nemar apresentou um valor de 1,33.
discussão
Ao analisar casos positivos para o CBP em nosso laboratório, determinamos que 80% dos casos afeta as mulheres, sendo as mulheres de relacionamento / Homem 4: 1 Esses achados são semelhantes aos relatados por: Abarca, Peña Herrera & Garces (2006), onde determinam a etiologia, sobrevivência, complicações e mortalidade na cirrose hepática no Equador evidenciando uma proporção de mulher / homem de 2,4: 1; Também cedeño & medina (2008) determine que 90% das mulheres são afetadas por esta doença. Das 25 amostras positivas que foram usadas neste estudo 20 vieram de mulheres. Valera, smok & poniachik (2007) no estudo realizado no hospital clínico da Universidade do Chile e na clínica Las Condes de Chile em 115 pacientes, mostrou que 110 eram mulheres O que equivale a 96%, encontrando uma proporção de envolvimento de mulher / homem de 9: 1, sabe-se que os fatores hormonais são um dos fatores predispondo doenças autoimunes. (Rojas, 2007, p.324).
No presente estudo, determinamos que a idade em que os casos da CPP são apresentados é de 45 anos. Dados semelhantes foram relatados por Dávalal, Román & Bustios (2007) em um estudo de hepatite autoimune em que eles incluíram a CBP mais suas formas clínicas e fatores relacionados à resposta ao tratamento exibindo de idades de afetação de 48 a 59 anos, uma possível explicação para este fenômeno é que nesta idade o timo perdou em grande parte a sua capacidade de destruir linfócitos T de auto-reactor por seleção negativa, que é um fator predisposição à doença autoimune.
Faça um bom diagnóstico clínico e laboratório para este e outro tipo de doenças autoimunes é vital, principalmente devido ao caráter invalidador no paciente ou no fato de que eles podem colocar em risco a vida do paciente em outros casos. Neste último aspecto, Jones & MetCalf (2008) determinou que os pacientes com CBP na doença III / IVDE possuem maior mortalidade (43,6%) do que a população normal. Portanto, no caso de um diagnóstico laboratorial de CBP, um teste de eficiência maior deve estar disponível. Em nossa experiência, observamos que o uso de substratos se, linhas celulares (BHK-21, HEP-2) ou cortes de cristal de tecido (fígado ou rato de mouse) pode ser evidenciado no nível de citoplasma celular que está diretamente relacionado a doenças hepáticas tipo imunológico, Infecções virais ou outra autoimune extra que tenho naturezas, etc. (Almeida et al., 2008).
dos três substratos avaliados, determinamos que aqueles com base nas linhas celulares têm utilidade limitada, especialmente aquelas usadas pela linha celular BHK-21 que têm uma eficiência de 56% Sensibilidade de 48% e especificidade de 64%. Enquanto este substrato é considerado bom para determinar anticorpos antinucleares. (Sosa & sánchez, 2007) não é para o diagnóstico de CBP, pois tem uma baixa concordância com o teste de ouro padrão avaliado (ELISA-AMA). Não há relatos sobre a bibliografia sobre a presença ou ausência desses antígenos mitocondriais na linha celular BHK-21.
Uma descoberta interessante era descobrir que, com a linha celular HEP-2, apesar de ter uma concordância moderada (De acordo com o índice Kappa) versus teste de ELISA, mostrou ter uma especificidade de 100%, vale a pena que, se este substrato foi utilizado, nenhuma fluorescência foi observada no nível do citoplasma celular, poderia ser dito que o paciente não apresenta A doença, mas ainda assim, é necessário usar um teste mais eficiente para confirmar o acima mencionado. Em relação à sensibilidade desse substrato, nenhuma diferença significativa é observada com células BHK-21.
Os cortes criostáticos renais do mouse mostraram ser os mais eficientes com sensibilidade e especificidade de 92% de 92%, respectivamente. Eles também mostraram resultados mais amplos com o método ELISA-AMA (Kappa 0,84). Em geral, sabe-se que a sensibilidade e especificidade dos métodos IFI para AMA são 95% (Valera, Smok & Pônia-Chik, 2007). Esses resultados nos mostram que o método IFI otimizado no histocompatibilidade e laboratório imunogenético do Instituto Seladis é tão bom quanto os métodos semelhantes oferecidos por diferentes casas comerciais.Embora existam diferenças no nível de sensibilidade e na especificidade com o método ELISA (método definitivo para diagnosticar o CBP), a única ou talvez a vantagem mais importante do método IFI versus o método ELISA é que ele não é apenas limitado a detectar o O antígeno mitocondrial M-2, mas pode dar resultados positivos contra os antígenos M1 para M9. Orientando o médico dessa maneira para o diagnóstico de doenças hepáticas autoimunes, tipo I, II, III ou outra autoimune não-fígado e até casos de infecções virais. (Meléndez & Dujarric, 2008). Outra vantagem não é menos importante é que o método otimizado torne o teste para os pacientes mais acessíveis porque o custo do reagente por teste é BS. 13 contra BS. 45 do kit de imunofluorescência e BS. 31,50 do kit de ELISA O método otimizado também mostra desvantagens, o primeiro é o consumo de tempo (sacrifique o mouse, extração e conservação dos RI-ñones, as diluições seriais de amostras de controle, as lavagens, leitura no microscópio de fluorescência). Para a experiência própria, descobrimos que é investido uma hora a uma hora e meia mais processando as amostras por Ifi do que por ELISA. Também é importante enfatizar que os profissionais são necessários para a leitura e interpretação dos padrões fluorescentes. Outra descoberta importante encontrada foi que diferentes padrões citoplasmáticos fluorescentes poderiam ser evidenciados em um determinado substrato. Com os resultados obtidos deste estudo, foi possível determinar o dos três substratos avaliados, os cortes renais histológicos do rato são o substrato mais eficiente e é o substrato que tem melhor concordância com os resultados do teste ELISA para o diagnóstico de CBP. Por outro lado, foi determinado que há uma concordância muito boa com o IFI resulta de um kit comercial de características semelhantes. O teste de diagnóstico usado nos permitiu validar o teste IFI que usa cortes histológicos como uma tela de teste para o diagnóstico de CBP.
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