Aumento no fator de nécera do tumor de interleucina-1, interferon gama e alfa no soro e cérebro de camundongos infectados com o vírus da encefalite eqüina venezuelana.
nereida Valero 1, Ernesto Bonilla 2,3, Marina Light Espina 1, Mery Maldonado 1,
Elsa Montero 4, Florencio Añez 1, Levy Alegry 1, John Bermudez 1, Eddy Meleán 1 e
Anais Nery 1.
1 Seção de virologia,
seção de neuroquímica, instituto de pesquisa clínica “Dr. Américo Negrette “, Faculdade de Medicina, Universidade de Zulia,
3 Instituto Venezuelano da Pesquisa Científica (Ivic-Zulia) e
4 hospital” Dr. Adolfo Pons “, Maracaibo, Venezuela.
autor de correspondência: Nereida Valero. Seção de virologia, instituto de pesquisa clínica “Dr. Américo Negrette “, Seção Postal 23. Faculdade de Medicina, Universidade de Zulia. Maracaibo Venezuela. Tel. (0261) 3279847, fax: (0261) 7597247, cel: (0414) 3624181. E-mail: [email protected].
Vários esforços foram direcionados para esclarecer os principais mecanismos de proteção e recuperação em Infecções virais e o papel possível das citocinas envolvidas na resposta imune primária induzida por uma cepa epizoótica do vírus da encefalite equina venezuelana (EEV). No presente estudo, as concentrações de TH1 interleucina-2 (IL-2) e interleucina-4 (IL-G), proinflamatória (IL-1B) e fator de necrose são determinadas neste estudo. Tumor -Alfa (TNF-A) em soro e cérebro de camundongos infectados com o vírus do EEV para diferentes períodos de infecção. NMRI albinos ratos infectados com uma suspensão (10 DL50) da cepa de guajira do vírus do EEV, e um grupo controle (sem infecção) foram utilizados. Nos dias 1, 3 e 5 pós-infecção, o sangue completo foi extraído de camundongos para obter whey e cerebral prévio de perfusão, para obter homogeneato cerebral. Em ambas as amostras, IL-2, IFN-G, IL-4, IL-1B e TNF-A pela técnica ELISA foram determinadas. Um aumento significativo foi observado (p < 0,01) no soro cerebral e homogeneizado para 1º, 3º e 5º dia de pós-infecção nas concentrações de IL-1B, IFN-G e TNF- A, quando comparado com o grupo controle. A quantificação de IL-2 e IL-4, não mostrou diferenças estatisticamente significantes quando comparadas aos controles. Estes resultados sugerem que IL-1B, IFN-G e TNF-A podem estar envolvidos na resposta imune antecipada ao vírus EEV durante a infecção primária.
Palavras-chave: Venezuelano eqüino Encefalite, citocinas, sistema nervoso central, soro.
Aumento da interleucina-1 beta, interferon gama e fator de necrose do tumor alfa em soro e cérebro de camundongos infectados com o vírus da encefalite equina venezuelana.
Abstract
Os esforços consideráveis foram direcionados para esclarecer os principais mecanismos de proteção e de recuperação em infecções virais agudas E, o possível papel das citocinas, indolda na resposta imunológica primária induzida por uma cepa epizoótica do vírus da encefalite eqüina venezuelana (Vee). Este estudo examinou os níveis de Th1 Cytokines Interleucinnin-2 (IL-2) e interferon-gama (IFN-G), Th2 Cytokines Interleucinnin-4 (IL-4) e citocinas proinflamatórias (IL-1B, TNF-A) no soro e cérebro de camundongos infectados com o vee vírus jantando diferentes períodos de infecção pós-infecção. NMRI albino murganhos masculinos infectados com uma suspensão (10 DL50) da tensão de guajira do vírus Vee, e um grupo controle (sem infecção) foram utilizados. Em um, 3 e 5 dias pós-infecção, sangue total e cérebros foram extraídos para obter sera e homogenatos cerebrais, respectivamente. IL-2, IFN-G, IL-4, IL-1B e TNF-A foram determinados pela ELISA. Um incremento significativo nos níveis de IL-1B, IFN-G e TNF-A foi observado (p < 0,01) em homogenatos séricos e cérebros a 1, 3 e 5 pós-infecção , quando compartilhado com o grupo controle. Os níveis de IL-2 e IL-4 não mostraram diferença estatística significante quando comparado aos controles. Estes resultados sugerem que IL-1B, IFN-G e TNF-A, poderiam estar envolvidos na resposta imunitária antecipada ao vírus Vee durante a infecção primária.
palavras-chave : Encefalite equina venezuelana, citocinas, sistema nervoso central, soro.
recebido: 07-07-2006. Aceito: 27-03-2008.
imunidade específica em infecções virais é mediada por uma combinação de mecanismos imunológicos humorais e celulares . Os anticorpos são produzidos e eficazes contra vírus apenas durante o estágio extracelular da vida desses microrganismos. Os vírus podem ser extracelular no início do curso da infecção antes de entrar na célula hospedeira ou no caso de vírus citopáticos, uma vez libertados das células infectadas lisadas, assim no seu estádio intracelular, esses vírus não são detectados pelos anticorpos. Sua destruição é mediada pela ativação de mecanismos que desencadeiam uma resposta celular (t linfócitos) controlando a infecção ou replicação até a aparência de uma resposta humoral (linfócitos B) que favoreça a síntese de anticorpos específicos para o agente infectante; No entanto, eles são capazes de fugir dos mecanismos imunes de defesa, contribuindo assim para a patogênese, ao sofrer variações antigênicas, inibindo a apresentação antigênica através da supressão dos genes da principal classe de histocompatibilidade (CMH) classe I e inativar células imunocompetentes, entre outras (1).
No sistema nervoso central (SNC), o controle de infecções virais é um trabalho complexo que é cumprido através de mecanismos que controlam e regulam os processos de desenvolvimento de inflamatórios locais que incluem Barreira hemato-encefálica (BHE), com capacidade limitada para a apresentação de antígenos e a modulação funcional de reações imunológicas por gangliosídeos e astrócitos. Normalmente, as células dentro do SNC não expressam antígenos de classe I ou Classe II do CMH. As células T ativadas na periferia, insira o SNC em forma antígeno não específica como parte da rotina imunológica de vigilância. Apenas células T específicas para um antígeno presente no cérebro e na medula espinhal são retidos dentro do SNC (2).
Alguns autores relataram tal infiltração de linfócitos T, como Na encefalite de Rasmussen (RE), uma síndrome auto-imune que freqüentemente segue um episódio infeccioso, que é manifestado por ataques epilépticos que são refratários para as drogas e requer a eliminação cirúrgica das regiões cerebrais afetadas. A tabela histológica das referidas regiões é dominada por linfócitos T infiltrantes CD8 + que são freqüentemente posicionados em contato direto com os neurônios. Os linfócitos t citotóxicos infiltrantes mostram o uso parcial de receptores indicativos de um processo de antígeno específico e atualmente representa o mais provável re. A similaridade histomorfológica à encefalite viral foi amplamente discutida especulação. Com o tempo, os vírus enterovírus, epstein-barr, herpes i e também citomegalovírus foram detectados em tecidos cerebrais afetados. Na fase final, a causa infecciosa desaparece como para todas as outras doenças autoimunes com uma suspeita de patogênese viral (3).
Isso contribuiu para a consideração de que o SNC e o sistema imunológico interagem de uma forma particular (4); Daí a importância de conhecer os mecanismos relacionados à defesa primária e específica do hospedeiro antes de uma infecção viral.
Além disso, os processos inflamatórios do SNC, como a encefalite, são caracterizados por apresentar um aumento local na concentração de citocinas, particularmente da interleucina 1-beta ( IL-1B) e fator de necrose do tumor-alfa (TNF-A), que podem ativar as células endoteliais, e desta forma, promover a migração de neutrófilos no local inflamado. A cascata de eventos começa com a ativação de linfócitos T, que inclui a liberação de citocinas poderosas (IFN-Gamma, IL-2, TNF) e mobilização de macrófagos que não só atacam o vírus, mas também para o host, causando danos graves em tecidos e vasos sanguíneos (5).
Por outro lado, a encefalite eqüina venezuelana (EEV) é uma infecção causada por um vírus altamente neurotrópico pertencente ao gênero Alfavírus da família Togaviridae (6, 7) . A infecção viral pela EEV, é transmitida pelos mosquitos Aedes Aegypti, Taenianchus (8), por membros da família Culicidae e por nematocherapia Dígareans da família Simulidae; Roedores, burros, cavalos, gado, morcegos, possivelmente pássaros e cães, são considerados reservatórios do vírus EEV (9).
Estudos da resposta imune à infecção do vírus EEV foram focados principalmente para a geração de vacinas ou cepas atenuadas na produção de anticorpos neutralizantes com o objetivo de eliminar o vírus no host. No entanto, a imunidade mediada por anticorpos, não é necessariamente o único mecanismo de proteção contra a infecção por este vírus. Investigações em que os ratos que foram tratados com sobrenadante imunizado da cultura do esplenócito sugerem que a proteção contra um ataque letal pelo vírus EEV pode ser mediada por IL-1 e IL-2 (10).
Efeitos antivirais diretos que são parcialmente mediados por TNF-B ou lymphoxina (LT), que é produzido por linfócitos T e outras células, Sendo um 30% homólogo para o TNF derivado de macrófagos e cumpre muitas das mesmas funções. Os efeitos biológicos da LT são os mesmos que os do TNF, consistindo de sua união para os mesmos destinatários. No entanto, porque a quantidade de lt sintetizada pelos linfócitos T estimulados pelos antígenos é muito menor do que os montantes de TNF produzidos pelos fagócitos mononucleares estimulados pela LPS, o LT não é bem detectado em circulação. Portanto, o LT é uma citocina local e não um mediador insulto sistêmico (1).
IL-2 é um fator de crescimento automático e de parácrina que secretam linfócitos T ativados e é essencial para a proliferação clonal da célula T. Células T que são estimuladas Por IL-2, eles mostram um aumento na citotoxicidade e produzem IFN-G YBY TNF-B, bem como fatores de crescimento celular B como IL-4 e IL-6. A IL-2 estimula as células NK que aumentaram a atividade citolítica (11).
Estudos da resposta imune à vacina TC-83 em camundongos identificados uma resposta imune mediada pelo padrão TH1, com a ativação local das células TCD4 + e CD8 +, Com as células T CD4, o tipo de células prevalecendo após a linfoblastose específica de vírus e que a ativação destes também foi associada a uma elevação de IL-2 (12).
IFN-G (tipo II) tem alguma atividade antiviral. É secretado por quase todas as células T CD8 e por alguns CD4 ts particularmente os do subgrupo TH1. É o ativador de macrófagos mais poderoso que é conhecido. A exposição à IFN-G aumenta consideravelmente a atividade antimicrobiana de macrófagos e induz-las a secretar citocinas como IL-1, 6, 8 e TNF-A; Além disso, aumenta a atividade de TH1 (11).
Em relação à IL-4, sua principal fonte de célula é os linfócitos T CD4 + da subpopulação TH2, bem como células mastóides ativadas e basófilos. Suas ações biológicas incluem a estimulação de reações mediadas por eosinófilos, células mastóides, estimulação de células B para a produção de IgE e supressão de reações dependentes de macrófagos. Anticorpos IgE desempenham um papel em defesa mediada por eosinófilos contra helminths e infecções artropodes. A IL-4 promove o desenvolvimento de células TH2 na defesa do hospedeiro sendo responsável pela indução e expansão dessa subpopulação. Esta antagoniza citocina os efeitos da ativação de macrófagos da IFN-G, desta forma inibe a resposta imune mediada por células (1).
é conhecido relativamente pouco sobre os mecanismos patogênicos de muitas infecções virais; Assim, no presente trabalho, considerou estudar, para diferentes etapas, a resposta imune mediada por algumas citocinas th1, th2 e pró-inflamatórias que realizam a quantificação deles tanto no soro quanto no homogeneato cerebral de camundongos experimentalmente infectados com o vírus EEV.
Métodos e métodos
Dois grupos de nmri mice albinos masculinos, 1-2 meses foram utilizados a idade com um posto de peso de 25-30 gramas, obtido da bioterio do Instituto Venezuelano de Pesquisa Científica (Ivic); que foram alimentados “ad libitum” em um ambiente de temperatura constante de 25 ° C. Cada animal no grupo experimental, foi intraperitonealmente infectado com 0,05 ml de suspensão viral contendo 10 doses letais 50 (10 DL50) do vírus, suspenso em solução salina de borato com 0,4%, albumina bovina estéril (13).
A cepa de guajira do vírus EEV foi utilizada. O estoque do vírus foi preparado em células vero (células renais do macaco verde africano), para uma multiplicidade de infecção de 1,0 UFP / CEL. O título de infectividade da tensão inoculada foi de 6,8×107 UFP / ml.
para 1, 3 e 5 dias após a infecção, o sangue completo foi extraído por bunning do seio orbital de ratos (n = 5 / grupo × 5 ensaios) O que foi centrifugado a 10.000 g x10 minutos para obter o soro, dividido em alíquotas e armazenado a -70 ° C para a determinação das citocinas. Posteriormente, os animais foram sacrificados pela luxação cervical para obter seus cérebros, após a perfusão. Os homogeneizados cerebrais foram preparados em 20% de suspensões em tampão tris-HCl de 50 mm, de acordo com o peso dele. Estas suspensões foram centrifugadas a 10.000 g × 5 minutos a 4 ° C, dos quais os sobrenadantes foram obtidos para a quantificação de citocinas.
A determinação das proteínas em homogenatos cerebrais foi realizada pelo método Lowry (14).
IL-1B, IL-4, IL-2, TNF-A e IFN-G
Os níveis de citocina foram determinados no soro cerebral e homogeneizados quantitativamente através da técnica de fase sólida ELISA, alta sensibilidade e especificidade (Biosource International, Inc.) expressando os resultados em PG / ml.
Os dados foram analisados aplicando o programa estatístico GraphPad 4.0 usando a análise de variância ( ANOVA), seguido pelo pós-teste de Bonferroni, considerando significativo para os valores de p < 0,05.
Um aumento significativo no IL-1 B foi observado (p < 0,001) a 1, 3º e 5º dia pós-infecção no homogenato cerebral de animais infectados com EEV (dia 1 pc = 622 ± 83,03 pg / ml; dia 3 pi = 872,4 ± 96,8 pg / ml; 5º PI = 720 ± 90,2 pg / ml), quando comparado com o resto dos grupos (Fig. 1).
fig. 1. Concentrações de IL-1B em soro cerebral e homogenato de camundongos infectados com o vírus da encefalite eqüina venezuelana.
Os resultados obtidos para as concentrações de TNF-A derramam um aumento significativo (p < 0,001) no soro (dia 1º = 365 ± 66,91 pg / ml; dia 3 pi = 392,7 ± 84,14 pg / ml; dia 5 pi = 408,3 ± 76,95 pg / ml), e homogeneizado cerebral (Dia 1, 960.52 ± 52,1 pg / ml; dia 3º = 880 ± 49,3 pg / ml; dia 5º pi = 1334,9 ± 60,1 pg / ml), no grupo de camundongos infectados em todos os períodos PI (Fig. 2), observando diferenças entre a resposta local e sistêmica.
FIG. 2. Concentrações de TNF-A no soro cerebral e homogenato de camundongos infectados com o vírus da encefalite eqüina venezuelana.
Concentrações de IFN-G em camundongos infectados com o vírus EEV , tanto no soro (dia 1, 2930.0 ± 212,6 pg / ml; dia 3 pi = 1931,0 ± 233,2 pg / ml; dia 5 pi = 2422,0 ± 347,9 pg / ml) como no homogenato cerebral (dia 1º = 2924,0 ± 190,9 pg / ml; dia 3º = 2050,0 ± 320,2 pg / ml; dia 5º pi = 2706,0 ± 496,5 pg / ml) mostrou um aumento significativo (p < 0,001) quando comparado com seus respectivos controlos. Essa diferença é mantida em todos os períodos estudados, evitando que não havia diferença na produção local desta citocina em relação à concentração sistêmica (Fig. 3).
fig. 3. Concentrações de interferon-g no soro cerebral e homogenato de camundongos infectados com o vírus da encefalite eqüina venezuelana.
em relação a IL-2, foram observadas diferenças (p < 0.05) Ao comparar o grupo de homogeneidade animal animal não infectado em relação ao soro animal infectado e não infectado com o vírus EEV para 1, 3 e 5 dias Pi (1º dia Pi = 80.70 ± 15,54 pg / ml; 3º dia pi = 57,954 ± 10,89 pg / ml; 5o dia pi = 54,33 ± 6,88 pg / ml). Similarmente, foram observadas diferenças significativas (p < 0,05) de homogeneização cerebral de animais infectados com EEV (1º dia pi = 52,43 ± 11,46 pg / ml; 3º dia pi = 73,03 ± 28,86 pg / ml; 5º dia PI = 57,66 ± 26,36 pg / ml) em relação ao soro e soro não infectados de animais infectados com EEV em todos os períodos estudados (Fig. 4).
FIG. 4. Concentrações de IL-2 no soro e homogenato cerebral de camundongos infectados com o vírus da encefalite equina venezuelana.
IL-4 não demonstrou diferenças estatisticamente significantes durante os dias estudado (fig.5).
FIG. 5.Soro e concentrações cerebrais homogeneizadas de IL-4 em camundongos infectados com o vírus da encefalite eqüina venezuelana.
discussão
Os resultados da presente investigação mostram que a infecção do vírus EEV desencadeia um processo inflamatório no SNC de camundongos infectados com este agente viral caracterizado pelo aumento da produção de citocinas proinflamatórias, como IL-1B e TNF -A, tanto no soro e no cérebro. homogeneizado. Assim como a síntese crescente do IFN-G também foi demonstrada associada a essa infecção, encontrando-a consistente com o que é relatado por Greider et al. (15) Em camundongos infectados com o vírus EEV, em que observaram que a expressão genética dessa citocina, é aumentada em relação ao seu controle.
Embora os arbovírus sejam a causa mais comum de encefalite, o papel exato do BHE é escassamente conhecido; No entanto, o aumento da permeabilidade aparece como um componente vital da patologia encefalítica viral (16)
fisiopatológicos que ocorrem com a ruptura do BHE, são provavelmente comuns muitas formas de encefalite viral. Isso sugere que mudanças semelhantes podem ocorrer em humanos infectados com vírus de encefalite de famílias flavivírus e togavírus, como vírus Ocidental ou EEV Virus (16).
Na última década, Paul et al. (17), referiram-se a alta regulamentação natural da resposta imune no SNC como “privilégio imunológico”, que se refere a um controlo ativo da resposta imune no cérebro. No contexto do parênquima cerebral, as células do apresentador de antígenos; Bem como outras células da glia e dos neurônios, modulam as respostas das células T, orientadas para uma função neuroprotetora e em menor grau para uma função destrutiva. Além disso, os neurônios são considerados que possuem suas próprias estratégias para limitar a replicação e disseminação de vírus citopáticos. Essas estratégias favorecem a eliminação não-citolítica de vírus ou promovem o estabelecimento de uma infecção não-citolítica persistente. A IFN-G é considerada como um contribuinte importante para a eliminação de uma maneira não citolítica, embora ainda seja necessário determinar como atos (17). Hausmann et al. (18), também foram demonstrados, em modelos experimentais, que a IFN-G desempenha um papel importante na força do hospedeiro contra infecções do CNS produzido pelo vírus cerebral. Além disso, eles sugerem que a IFN-G poderia funcionar como um fator neuroprotetor que provavelmente limitaria a perda de neurônios no decorrer da resposta imune antiviral no cérebro.
Concentrações IFN-G altas e sustentadas no soro cerebral e homogenato observadas no presente estudo sugerem a preservação da integridade neuronal dos modelos transparentes infectados com o vírus da EEV, Inibir a disseminação do vírus no SNC por eliminação ou liberação e apoiar a hipótese de que a IFN-G desempenha um papel crítico na proteção contra essa infecção.
em relação a isso, Parra et al. (19) demonstraram o papel potencial da IFN-G como mediador para controlar a replicação viral em oligodendroglias de secreção deficientes de ratos da dita citocina e infectados com vírus da hepatite, jhm (JHMV). Esses ratos exibiram maior sintomatologia clínica e mortalidade associados à persistência do vírus, demonstrando incapacidade de controlar a replicação viral.
Outros autores estudaram o papel de IFN-G, como demonstrado por Rodríguez et al. (20), que avaliou o papel da IFN-G em proteção neuronal pela infecção por SNC após danos induzidos por vírus em ratos IFN-G – / – e IFN-G + / + com HAPlotype H-2B do complexo principal de histocompatibilidade (HMC ) e infectados intracerebralmente com o vírus do teiler da encefalite face. IFN-G – / – Os ratos desenvolvem persistência viral nas células gliais de matéria branca e exibiram a desmielinação associada à medula espinhal, que causou morte e deficiências neurológicas graves aos 16 dias de infecção quando comparadas aos controles, e exercer que o IFN -g exerce efeito neuroprotetor.
da mesma forma, a produção de TNF-A tem sido associada a efeitos benéficos e prejudiciais.Em relação a isso, foi relatado por alguns autores como benéficos porque a passagem de TNF-para o soro através da barreira da medula espinhal, após um insulto na misma, permite um perfil ideal de citocina, específico do tempo e região, bloqueando efeitos deletérios, ao reforçar os efeitos benéficos, o que poderia facilitar o seu restabelecimento funcional (21).
No entanto, para outros autores, pode ser prejudicial como descrito por Schoneboom et al. (22), que obtiveram altos níveis de TNF-A em culturas infectadas às astrócitos com o vírus EEV. Em outro estudo, conduzido por esses pesquisadores (23), um aumento na produção de múltiplos genes proinflamatórios entre eles foi evidenciado, então sugerem que a resposta inflamatória induzida por ela, poderia contribuir para a neurodageneração na infecção pelo EEV.
No presente estudo, foi observada uma elevação nas concentrações séricas de TNF-A, que aumentaram como os dias pós-infecção haviam passado; No cérebro homogeneizou essas concentrações foram ainda maiores, o que indicaria um dano potencialmente maior no SNC provavelmente causando danos neurológicos por citotoxicidade celular, alteração na permeabilidade vascular e, consequentemente, uma elevação na taxa de mortalidade de ratos infectados.
IL-1B é uma citocina proinflamatória que atua como um mediador em um grande número de patologias SNC. É interessante notar que durante a infecção experimental pelo vírus EEV, IL-1B é capaz de induzir atividade antiviral através da ativação e aprimoramento de células assassinas naturais (NK) (24). Neste estudo, a alta produção sérica e cerebral em camundongos infectados pelo vírus EEV parece responder à atividade antiviral desta citocina. Alguns autores (25) relatam no soro de camundongos infectados com o vírus do EEV e tratados com melatonina (MLT), aumento da IL-1B, e sugerem que desempenham um papel relevante na resolução da infecção. Da mesma forma, Bonilla et al. (26) sugeriram que uma diminuição no TNF-A níveis, com um aumento na IL-1B estimulada pela MLT no cérebro de camundongos infectados pelo vírus EEV, pode explicar entre outros aspectos, o aumento da sobrevivência dos animais infectados tratados com MLT.
Em nossos resultados, é evidente que a IL-4 não lançou variações significativas na sua concentração, por isso sugere que a infecção do vírus EEV não estimula uma imune Resposta dependente do padrão Th2 através da IL-4. No entanto, é necessário considerar a possibilidade de que a replicação viral tenha sido aumentada durante este estudo, o suficiente para permitir que os mecanismos imunológicos necessários sejam ativados para a expressão das referidas citocinas. Por outro lado, em estudos subseqüentes, outras citocinas pertencentes a esses padrões devem ser avaliadas para determinar se esse vírus é certamente capaz de inibir a produção das citocinas que intervêm na resposta TH2.
Os resultados obtidos em nosso estudo, mostram que a infecção causada pelo vírus EEV, ativa a produção de IL-1B, IFN-G e TNF-A no O cérebro homogeneizado, possivelmente pela produção dessas citocinas no tecido cerebral, o que provavelmente contribui para uma elevação sérica das ditas citocinas, sugerindo que elas poderiam estar envolvidas na resposta imune precoce ao vírus EEV durante a infecção primária. Torna-se necessário, realiza estudos subseqüentes que ajudam a esclarecer-se o aumento da produção de IL-1B e TNF-A e IFN-G, é o produto da produção local no SNC ou que a ruptura do BHE permite a passagem de As citocinas mencionadas acima e isso contribui para a patogênese da infecção EEV.
Obrigado
ao Conselho para o desenvolvimento científico e humanístico da Universidade de Zulia (Condamentos Projecto CC-0141-05) e do Fundo Nacional de Ciência, Tecnologia e Inovação (Projeto Fonacit No. 1998003550), pelo financiamento concedido.
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