Méthodes rapides d’identification des bactéries et des champignons. Masses Spectrométrie Maldi-TOF, média chromogénique | Maladies infectieuses et microbiologie clinique

Spectrométrie MALDI-TOF. Origines

L’introduction de la spectrométrie de masse (MS) La désorption au laser assistée par matrice / l’heure d’ionisation du vol (Maldi-tof) a été, sous probabilité, le changement technologique du plus grand projet s’est produit dans la clinique de microbiologie dans la la dernière décennie. En quelques années, il est passé d’être une nouveauté prometteuse pour être une technologie entièrement intégrée dans l’activité clinique quotidienne et disponible, dans notre pays, dans les services de microbiologie de nombreux centres hospitaliers1. Pour cela, il est nécessaire que les spectromètres de masse subissent une évolution technologique importante. À cet égard, il y avait deux progrès cruciaux. Premièrement, la conception du système de vol (TOF) par w.e. Stephens, en 1946, qui permettait la séparation de différentes masses. Lors de l’accélération des ions dans un champ électrique et d’acquérir toutes les mêmes énergie cinétique, la vitesse qu’ils acquièrent et donc le temps utilisé pour parcourir le tube à vide dépend de la masse de la molécule ionisée, qui peut être déduite du temps passé sur Cet itinéraire.

Le deuxième jalon a été le développement de méthodes permettant de ioniser des protéines intactes qui, en raison de leur taille, jusque-là n’ayant pas été sensible à l’ionisation, car l’énergie élevée requise pour cela, il a fini de modifier ou détruire sa propre protéine. En 1987, Köichi Tanaka présente une nouvelle méthode d’analyse (désorption laser molle) qui permettait de transférer les molécules l’énergie nécessaire pour les ioniser sans casser les liaisons chimiques fragiles. Cette découverte lui a valu le prix Nobel en chimie en 2002, ainsi que John B. Fenn, pour « L’élaboration de méthodes d’identification et analyse structurelle des macromolécules biologiques ». Il n’y avait plus de spectromètres de masse basés sur ce type d’analyse, bien que certains changements soient nécessaires dans la méthode de manière à ce que l’EM Maldi-TOF a finalement apparu, dans laquelle la désorption des ions est favorisée par une matrice qui absorbe l’énergie du laser et le transférer partiellement à l’objet d’étude des molécules. Même si ces modifications amélioraient la technique, ce qui facilitent les responsables de ces améliorations, Michael Karas et Franz Hillenkamp, n’ont pas été inclus dans le prix Nobel, ce qui a généré une controverse importante. Sur la base des contributions de ces auteurs ont commencé à être possible, l’étude des macromolécules et des biopolymères par MS, qui a ouvert de nouveaux domaines d’application pour cette technologie.

Dans ses près de 30 ans de vie, le Maldi Em – TOF a été utilisé pour l’analyse quantitative et qualitative des protéines de différentes origines. Initialement, il a été appliqué à des protéines ou de petites protéines précédemment isolées, mais grâce aux avancées techniques de l’instrumentation et dans les outils de l’analyse informatique des données, l’étude de grands groupes de protéines peut maintenant être adressée.

La possibilité de commencer à étudier des protéines complexes, et pas seulement de petits peptides, a considérablement élargi les champs potentiels d’application de la SP. L’un d’entre eux a été l’identification des microorganismes qui, comme la procédure étant simplifiée et que le logiciel nécessaire a été amélioré pour exploiter les données brutes fournies par le spectromètre, dérivée rapidement dans leur application clinique.

masse spttrométrique malzi-tof en microbiologie clinique

Jusqu’à l’introduction de EM Maldi-TOF, l’identification bactérienne, même avec des avancées importantes telles que la création de galeries d’identification miniaturisées et l’automatisation de son inoculation et de sa lecture, a continué de se nourrir par les méthodes développées par la bactériologie classique La pratique des systèmes d’identification a continué à être basée sur la fermentation des sucres et leur détection par le changement de pH généré, la métabolisation d’autres substrats et la production de différents métabolites et activités enzymatiques détectables par des méthodes chimiques. Toutes ces méthodes ont adolé plusieurs limitations:

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  Croissance bactérienne requise, qui supposait dans la plupart des cas une période d’incubation d’au moins 16-18 heures de son inoculation jusqu’à la lecture.

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  a montré des problèmes d’identification dans tous ces micro-organismes avec des difficultés à se développer dans le milieu liquide utilisé pour l’inoculation de ces panneaux, ainsi que dans des micro-organismes à faible activité biochimique et enzymatique.

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  Il était nécessaire d’envisager la marge d’erreur dérivée du fait que, des individus de la même espèce, peuvent avoir des comportements différents contre divers substrats.

Ces limitations, bien qu’elles soient connues et supposées, elles sont devenues un brevet plus clairement lorsque, étant donné les divergences observées dans certaines études entre la MSZ-TOF EM et l’identification conventionnelle, Le séquençage des RNR 16 a montré que, dans la grande majorité des cas, l’identification correcte correspond à celle fournie par l’EM Maldi-tof2.

à cet égard, l’EM Maldi-tof présente des avantages évidents:

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  Quelle que soit la possibilité d’identifier des microorganismes directement à partir de certains échantillons, qui est traité dans une autre section, même une croissance de la plaque très rare ou précoce permet une identification fiable en une courte période de temps , épargnant au moins ces 16-18 h de croissance des systèmes d’identification biochimique.

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  L’analyse du profil de protéine du microorganisme dans le spectre de la 2- 20kd, qui est où la plupart des protéines de la côte sont placées Osomic, il offre la grande majorité des espèces bactériennes d’un profil spécifique, qui permet de différencier du reste avec une fiabilité similaire à celle offerte par le séquençage des RNR 16S.

A Ceci doit être ajouté que, l’introduction de cette technologie, a considérablement élargi la gamme de genres et d’espèces que nous pouvons identifier avec fiabilité, avec une méthode capable d’être utilisée dans la routine. Cela a même conduit à une réévaluation du rôle de pathogènes de microorganismes qui, en raison de la difficulté de leur identification par les méthodes classiques, étaient probablement infahiagnostibles3.4.

déjà en 1975, Anhalt et Fenselau propose l’utilisation de la SP pour l’identification des microorganismes5. Vingt ans plus tard, la première étude est publiée qui démontre l’efficacité des EM de Maldi-TOF pour l’identification des microorganismes à partir de cellules complètes6.

en 2009, il a été publié probablement un article clé à donner à la connaissance générale Les spécialistes impliqués dans le diagnostic des maladies infectieuses, les possibilités d’EM Maldi-Tof7. Il étudie plus de 1600 isolats comprenant des bactéries grammositives et gramnegatives, aérobies et anaérobies, obtenant 95,4% des identifications correctes. Cet article s’adresse à cet article qui a ensuite été transcendu pour l’utilité pratique de cette méthodologie: la disponibilité de bases de données de micro-organismes suffisamment larges, tant du point de vue qualitatif (nombre de genres de genres compris) et quantitatif (les auteurs démontrent que la probabilité d’identification correcte est plus grande pour les microorganismes qui existent au moins dix profils différents introduits dans la base de données).

À partir de ce moment, une expansion rapide de l’utilisation a lieu de cette technologie en microbiologie clinique. La première publication en Espagne a lieu en 2010, montrant une corrélation avec la méthodologie conventionnelle, au niveau des espèces, à 100% en gramservation et de 87,7% en gramnegative8. Depuis lors, le nombre de publications relatives à différents aspects de l’utilisation clinique de EM Maldi-TOF, mais surtout à l’identification des micro-organismes, il a été exponentiel7-12.

Identification des bactéries gramnegatives à l’aide de Maldi-tof

Études montrent que l’efficacité de l’identification de l’entrée d’enterobactéries et d’autres gram négatifs est excellente, y compris à la fois les grammes les plus courants de manière clinique et autre moins fréquente ou plus compliquée à identifier avec une méthodologie classique (différentes espèces de yersinia, aéromonia, plasiomonas , Brucella, Francisella, Achromobacter, Sténotrophomonas, Burkholderia …). Comme dans d’autres cas, des problèmes d’identification ont presque toujours été liés à des insuffisances de bases de données plutôt que de limitations de la méthode, comme cela s’est produit dans certaines études avec des genres tels que Ralstonia, Elizabethkingia ou Sphyngobacterium13. Initialement, certaines limitations ont été soulevées pouvant avoir une plus grande transcendance clinique, telle que l’incapacité de différencier entre Escherichia coli et Shigella14 ou la difficulté de différencier les sérovres de Salmonella Enterica. Des études plus récentes suggèrent qu’il est possible de sauvegarder ces limitations. Utilisation de programmes informatiques tels que Flexanalyse et ClinProtics (Bruker Daltonics GmbH, Allemagne), des pics spécifiques ont été identifiés qui permettent différents de E. coli et de Shigella dans 90% des cas15. D’autres auteurs ont montré que cette différenciation est possible même sans utiliser de logiciel supplémentaire, en augmentant simplement le nombre et la variété de profils de E. coli et de Shigella présents dans la base de données de référence16. Avec cette méthode, les auteurs identifient correctement 60/64 isolats de E. coli et 110/116 isolats de Shigella.

à tous ceux qui ont utilisé l’EM Maldi-TOF pour l’identification, il est consistant que, avec la méthodologie habituelle, l’identification de Salmonella à un niveau de genre est fiable, mais au-delà du niveau de genre est beaucoup moins. Cependant, il existe déjà depuis 2004 publications qui suggèrent l’existence de pics spécifiques pouvant permettre d’identifier des sérovres ayant une plus grande fiabilité17. Une étude récente suggère l’existence de pics permettant d’identifier de manière fiable typhi18 sérovar. Étant donné que les éléments différentiels semblent existants, une extension de la base de données de référence avec un nombre plus élevé de haut – parleurs, au moins, sérovars les plus fréquents, améliorerait probablement la résolution dans ce cas particulier.

dans d’ autres cas, de même que la différenciation entre les espèces du Enterobacter CLOACAEE complexe, la capacité de l’EM MALDI-TOF est d’ environ 80%, ce qui , sans être optimal, représente une amélioration sensible par rapport à la methodology19 classique.

Sur la d’ autre part, comme déjà mentionné, l’identification correcte des micro – organismes préalablement identifiés de manière incorrecte, comme le genre Raoultella, souvent identifiés par des méthodes classiques telles que Klebsiella ou comme Enterobacter, permet à une vision plus réelle de son rôle en tant que agents pathogènes, précédemment undervalued3.

Identification des bactéries Gamositivas à l’aide de Maldi-tof

L’identification des microorganismes à gram-positif montrent généralement des figures légèrement inférieures, dues Dans certains cas, à la difficulté de mentir le mur, et dans d’autres la similitude entre les espèces. En général, le procédé direct (application de la colonie avec la matrice sur la plaque de spectromètre) est généralement suffisante pour obtenir une bonne identification de la colonie, mais parfois l’extraction précédente avec de l’ éthanol / acide formique peut être nécessaire pour obtenir des valeurs d’identification optimale. Ensemble, il offre d’excellents résultats dans l’identification de Staphylococcus aureus et d’autres espèces et sous-espèces de Staphylocoques, à la fois des producteurs et des non-producteurs de coagulase, ainsi que d’Enterocoques et d’autres décès moins fréquents comme micrococque, Gémella, Rothia, etc. Il a également montré son utilité dans l’identification des bacilles positifs à Gram, y compris une identification complexe par des méthodes classiques (Listeria, Lactobacillus, Corynebacterium, Nocardia, ActinoTICLUM …) 20.

En outre, comme dans le cas de gramnegatives, l’utilisation systématique de cette technologie est en train de changer considération comme agents pathogènes de certains micro – organismes tels que Staphylococcus Lugdunensis21. Ensemble, les données disponibles, il est conseillé, dans le cas de staphylocoques à utiliser, comme dans tous les autres cas, les bases de données qui offrent un plus grand nombre d’espèces et un nombre assez élevé de profils par espèce, et utilisent une méthode d’extraction à la place de Application directe, ainsi que l’application du microorganisme sur la plaque en duplicata. La réduction du score nécessaire pour valider une identification au niveau des espèces à des valeurs > 1.7, au lieu de > 2.0 comme il est courant , comme certains authors22 propose, peut augmenter le nombre d’identifications au niveau des espèces, mais en échange d’une diminution de la spécificité dont la pertinence peut être discutable.

Probablement le groupe de streptocoque est la qui présente des problèmes plus importants entre les gramsidtifs. Bien que certaines des principales espèces pathogènes (Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae) sont identifiés avec une grande fiabilité, Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) a toujours été une source de problèmes, en raison de sa confusion avec d’autres espèces du groupe Mitis. Les principales équipes utilisées dans notre pays identifient S. pneumoniae avec fiabilité. L’erreur la plus courante est l’identification erronée des autres streptocoques du groupe Mitis, tel que S. pneumoniae, en particulier avec la base de données de Bruker23. Certains pics ont été décrits comme S. pneumoniae, de sorte que certains auteurs recommandent leur utilisation pour corroborer ces identifications23. Cependant, la dernière bibliothèque de référence de Bruker Daltonics (bibliothèque MBT 6903 MSP) continue de recommander l’utilisation d’autres tests (Optoquina, solubilité en bile) pour les différencier.

même dans le même groupe, la qualité de l’identification des différentes espèces peut varier considérablement, comme cela se produit au sein du groupe Streptococcus anginosus.

dans tous les cas, comme les staphylocoques, l’utilisation d’une telle base de données large et complète que possible, et l’identification en double exemplaire et avec des protocoles qui incluent l’ extraction est recommandé pour optimiser les résultats (Fig. 1).

identification de mycobactéries utilisant maldi-tof

Les limitations de la méthodologie traditionnelle pour l’identification de mycobactéries, sur tout ce qui se réfère au temps de réponse, ils ont fait la totalité de la pratique des laboratoires décantés par les méthodes d’identification moléculaire. L’utilisation de EM Maldi-TOF pour l’identification de Mycobactéries est une alternative aussi rapide et moins chère que des techniques moléculaires, mais montre des particularités dans plusieurs aspects. D’une part, les méthodes d’analyse directes, ou qui impliquent une concentration élevée ou une manipulation des microorganismes auparavant à son inactivation, ne sont pas recommandées par une question de sécurité biologique. L’utilisation d’une méthode d’extraction garantissant la rupture des cellules améliore la qualité des spectres et augmente la sécurité de la procédure.

Plusieurs facteurs peuvent influer sur l’efficacité de l’identification de mycobactéries par Em Maldi – Tof. Comme il a également été montré avec des champignons, Mycobacteria peut avoir des profils de protéines très différents en fonction de l’antiquité des cultures. Il est donc important que le diagnostic incluait des profils protéiques des cultures de différentes antiquités pour chaque microorganisme. Il a également été parlé de la possibilité possible de polymères qui masquent la taille réelle des protéines caractéristiques utilisées pour l’identification. Tout cela rend l’identification de mycobactéries une procédure moins prévisible en termes de résultats que ceux d’autres bactéries, comme témoignent de l’hétérogénéité des données publiées. Dans les dernières mises à jour, les bibliothèques ont connu des améliorations significatives. Ainsi, par exemple, la biotype microbactériel de Biotyper 3.0 comprend 149 espèces et la version 3.0 de VITEK SP incorpore 48 nouvelles espèces par rapport à la version précédente.

La procédure initialement recommandée par Bruker comprenait une série de étapes (ajustement à Une certaine densité optique, plusieurs étapes de centrifugation et de remise en suspension) qui ont supposé un risque biologique probablement inutile, ils ont donc été remplacés par une seule étape de traitement avec la chaleur. La méthode recommandée comprend actuellement plusieurs étapes de chauffage et de lavage, suivies d’un traitement avec des billes de silice et d’acétonitrile. Par la suite, ils sont traités avec de l’acide formique, appliqué sur la plaque et recouvert de matrice (Fig. 3). Au contraire, la méthode préconisée par BioMérieux partie d’un traitement initial avec 70% d’éthanol et de silice, après quoi l’échantillon est extrait avec de l’acide formique et de l’acétonitrile, appliqué sur la plaque et recouvert de matrice (figure 4).

Une étude comparative entre les deux méthodes effectuées récemment NTE28 montre que bien que l’identification a tendance à être quelque chose de mieux à partir de la moitié 7h10 que Lowenstein Jensen, les différences sont petites dans les deux systèmes. Cependant, il démontre que le procédé de traitement de l’échantillon est essentiel, et il n’est pas interchangeable entre les systèmes. Les échantillons obtenus avec le procédé d’extraction de Bruper donnent de meilleurs résultats dans leur spectromètre et le traitement avec la méthode VITEK le font ainsi avec Salamis et Vitek MS lui-même, bien que la différence dans ce cas soit plus faible. Ensemble, Vitek MS semble être moins affecté par la méthode d’extraction. En ce qui concerne l’efficacité de l’identification, Bruker Biotyper a identifié un score ≥ 1,8 81,5% des isolats, tandis que Saramis et Vitek MS 3.0 sont identifiés avec une fiabilité de 90% de 85,4 et 89,2% respectivement. En utilisant ces mêmes critères, 22,6% des isolats identifiés par Bruker Biotyper devaient être extraits à plus d’une occasion pour obtenir une identification, ce qui s’est produit de 21,5% avec Saramis et de 14,2% avec Vitek MS 3.0.

par rapport à d’autres micro-organismes avec une structure pariétale proche de celle de mycobactéries, il a été considéré que son identification était problématique en raison de la composition de son mur. Cependant, il a été montré que, si une base de données est disponible avec suffisamment de références, une méthode d’extraction similaire à celle utilisée avec Mycobacteria peut offrir de bons résultats29.

Toutes les données mentionnées ci-dessus suggèrent que le spectre des microorganismes susceptibles L’identification de EM Maldi-TOF est extrêmement large et que, avec des exceptions considérées, le facteur limitant de la capacité des maldi-tof émus presque toujours plus dans l’exhaustivité des bases de données de référence qu’à la capacité de la méthode d’obtenir des profils fiables de presque tout microorganisme bactérien capable de grandir dans les milieux de culture. En fait, les entreprises de fabrication semblent être conscientes du problème; Ainsi, la dernière bibliothèque de référence publiée par Bruker Daltonics (Bibliothèque MBT 6903 MSP) intègre 938 nouveaux profils, dont 17,2% visent à couvrir de nouveaux genres et espèces (15 nouveaux genres et 96 nouvelles espèces spécifiquement), en particulier anaérobies et champignons, Mais 82,8% visent à accroître la diversité des profils au sein des espèces déjà envisagées dans les bibliothèques précédentes. De la même manière, Vitek MS version 3.0 comprend 242 nouvelles espèces bactériennes, dont 48 nouvelles microbactéries et 15 nuits et 55 nouveaux champignons, avec une moyenne mondiale de plus de 10 isolés et 25 spectres par espèce.

Identification des micro-organismes, de Maldi-tof, de l’échantillon direct

la possibilité d’identification des microorganismes avant la croissance des colonies a été, dès le début, un objectif très attractif, il suppose donc au moment de pouvoir établir un Traitement empirique plus orienté, réduisez l’émergence de la résistance et optimisez les dépenses30. L’EM Maldi TOF, appliqué à l’échantillon direct, est devenu un outil très utile dans des infections graves avec un taux de morbidité élevé, tel que la bactériémie et les champignons, bien que des travaux directs sur des échantillons présentent des inconvénients pouvant limiter l’utilité de la technique. Dans des échantillons à faible densité microbienne, il n’est pas possible d’effectuer une identification correcte, car la quantité de protéines bactériennes présentes est insuffisante. Quelque chose de similaire se produit avec les échantillons polymiques, car un spectre des protéines aberrantes peut être généré à la suite du mélange de plusieurs profilés, ou en ignorant directement le microorganisme dans une proportion mineure. Certaines améliorations logicielles ont été développées, ce qui peut parfois détecter, et même identifier les micro-organismes impliqués séparément, mais il faut être soigneusement étudié et probablement raffinant d’avoir une nouvelle utilité. Dans la plupart des méthodes qui fonctionnent directement sur l’échantillon, et avant la présence possible de microorganismes intracellulaires, il est conseillé d’utiliser des méthodes qui incluent la lyse cellulaire.

Tous les échantillons ne sont pas valables pour ce type d’étude. L’échantillon idéal est celui qui provient d’une zone habituelle stérile, pouvant accueillir de fortes concentrations de microorganisme et dans lesquelles il n’y a pas de limitations significatives concernant le volume d’échantillon. Les échantillons de zones habituellement colonisées (peau, tabouret, appareils respiratoires élevés …) généreront des profils aberrants de toutes les vraisemblances. Un problème technique à prendre en compte lors du travail directement sur l’échantillon est le volume de l’échantillon disponible, ce qui, dans des cas tels que des cultures d’urine ou de sang, n’est généralement pas un problème, mais dans d’autres avec du liquide céphalo-rachidien, il peut être, et ce sera aussi Beaucoup plus important que mineur est la concentration bactérienne. De plus, des échantillons avec une teneur élevée en protéines de source étranger au microorganisme peuvent également générer des problèmes au moment de son interprétation31.

Cependant, l’avantage qui est, en particulier dans les hémocultures, dépassant 24 h de l’identification de Le microorganisme et l’orientation du traitement plus spécifiquement, a fait l’utilisation directe de la SP sur l’échantillon, en particulier dans ces cas, a largement répandu.

Identification directe des échantillons d’urine

L’urine est l’un des échantillons qui ajustent le mieux à la Conditions idéales pour travailler avec EM Maldi-TOF sur un échantillon direct. C’est un fluide stérile dans des conditions physiologiques, la charge bactérienne de l’urine infectée est élevée dans la plupart des cas et les limitations concernant le volume d’échantillons et obtenant de nouveaux échantillons si nécessaire, sont minimes.

études avec excellente Des résultats ont été publiés, avec une concordance dans l’identification atteignant 90-95% 32,33 par rapport aux systèmes automatisés.Différents protocoles de traitement des échantillons ont été décrits, tous coïncidant dans la nécessité d’une pré-dépistage (cytométrie de flux, de gramme) pour discriminer entre des échantillons positifs et négatifs et limiter l’utilisation de la SEP aux échantillons initialement positifs34.

Avec de petites variations, la préparation des échantillons consiste généralement à les soumettre à une série de centrifugations et lavée à l’eau désionisée, puis effectuant la procédure conventionnelle du maldi-tof. Des modifications ont été effectuées en incorporant l’échantillon SDS Aliquot à 10% 33 pour améliorer la libération de protéines, ou Tween-8034 afin d’améliorer les résultats. Les résultats obtenus sont généralement meilleurs avec gramnegatif qu’avec les grampositifs et les champignons, ce qui améliore beaucoup la fiabilité lorsque les comptes sont élevés, au-dessus de 105fc / ml.

Un inconvénient de cette méthode a été la nécessité de réaliser le Étude de sensibilité grâce à la méthodologie conventionnelle. Une étude récente suggère que, une fois l’identification de EM Maldi-TOF, les mêmes sédiments peuvent être utilisés pour effectuer un disque de disque antibiogramme avec d’excellents résultats, ce qui permet de réduire en 24 h l’étude complète35. Le changement organisationnel important que l’introduction de cette méthodologie suppose et infections dans lesquelles il est souvent diagnostiqué n’est pas critique pour la gestion du patient, a rendu le diagnostic d’infection urinaire à EM Maldi-tof n’a pas eu la Pénétration Il a eu, par exemple, dans le cas des cultures de sang. Il est nécessaire d’atteindre à la fois une sensibilité plus grande et une plus grande normalisation des méthodes visant à considérer leur introduction dans la routine clinique.

Identification directe des hémocultures

L’établissement d’un traitement empirique correct est décisif dans l’évolution de la bactériémie La probabilité que le traitement établi soit correct, sera plus grande plus précis et concrets les informations que nous sommes en mesure de fournir rapidement. Dans cet aspect, la possibilité offerte par l’EM Maldi-TOF d’obtenir une identification fiable en peu de temps après la positivisation de la culture sanguine est une avance évidente.

De nombreux protocoles de transformation culturelle de sang-sang ont Décrit (centrifugation différentielle, lyse cellulaire et extraction de protéines par des méthodes chimiques, séparation de gel …). La plupart d’entre eux sont basés sur la lyse et l’élimination des composants cellulaires, soit par centrifugation et lavoirs, dans lesquels différents composés sont utilisés comme saponine, chlorure d’ammonium ou SDS, ou en utilisant des tubes avec gel séparateur sérique et activateur de la coagulation. En bref, ce qui est recherché avec ces méthodes consiste à isoler et à concentrer des microorganismes jusqu’à atteindre au moins 105-107FC / ml, la concentration à laquelle la quantité de protéines est suffisante pour générer des profilés appropriés dans EM Maldi-tof.

Dans le cas des hémocultures, une procédure commerciale approuvée (SEPSITYPER, Bruker Daltoniks GmbH, Allemagne), composée de l’ajout d’une solution de lyse à une aliquote de 1 ml de la culture sanguine, après quoi l’échantillon est soumis à plusieurs étapes de lavage. et centrifugation et, enfin, à une extraction conventionnelle avec éthanol et acide formique36.

Les résultats de la transformation directe des cultures de sang sont généralement bons, avec des pourcentages d’identification corrects de 80-90%, bien que certaines nuances. L’identification des négatifs de Gram est généralement correcte dans 90 à 95% des cas, tandis que dans les gramsidages sont beaucoup plus hétérogènes, oscillant entre des figures similaires à celles de gram-négatif et de figures environ 50%. Au sein de ceux-ci, ils posent des problèmes de fiabilité sur tous les streptocoques du groupe Viridans et de staphylocoques non productrices de non-coagulase.

Les résultats des fungémies, dans les premières études, étaient décevantes. Une extraction correcte, indispensable dans ce cas, conduit à des chiffres d’identification supérieurs à 90%, homologué avec ceux obtenus en bactériémie37. L’impact possible de certains composants de certaines hémocultures, tels que le carbone actif, peut être pris en compte, ce qui peut interférer avec l’identification. De même, un temps d’incubation prolongé de la culture sanguine peut avoir un impact négatif sur les spectres obtenus. Toutefois, étant donné que la procédure habituelle consiste à effectuer MS dans, au plus quelques heures après la positivisation, et plus de 80% des cultures de sang positives significatives sont au cours des premiers 48 h, l’impact clinique de cet aspect ne semble pas transcendant .

Lors de l’évaluation de l’hétérogénéité des pourcentages d’identification correctes dans les hémocultures, il convient de prendre en compte qu’il n’y a pas de critère homogène quant à la manière d’évaluer les scores obtenus. Certains auteurs envisagent une identification correcte avec des valeurs > 1.7. D’autres diminuent cette exigence jusqu’à 1,5, mais incluent des exigences telles que l’identification est répétée dans les deux ou trois premiers postes de la liste d’identification possible, ou entre les deux premières options offertes par la différence Maldi-tof, une différence de score de au moins 0,3 point.

En général, nous ne sommes pas favorables à la réduction du niveau d’exigence dans l’identification correcte dans les cultures de sang, car l’existence d’un pourcentage plus élevé de « aucune identification » suppose toujours un risque plus faible, du point de vue clinique, que la prolifération d’identifications incorrectes, qui pourraient conditionner des traitements insuffisants.

concernant l’utilisation de méthodes de traitement commerciales, telles que SEPSITYPER, les résultats en général ils sont similaires par rapport aux méthodes de traitement manuelles. Chaque laboratoire doit hiérarchiser parmi la plus grande normalisation et l’économie de temps de traitement qui a propitié ces méthodes, ou des économies économiques (environ 1 € / échantillon) qui implique l’utilisation d’une méthode manuelle.

en jeu, EM Maldi- TOF est une méthode rapide et fiable d’identification directe des microorganismes dans les hémocultures. Sa combinaison avec des méthodes permettant de détecter des mécanismes de résistance à certains antimicrobiens, permet d’offrir des informations cliniques précieuses à une durée nettement inférieure (24-48 h moins) selon les besoins par la méthodologie conventionnelle. Probablement le point principal à élucider, à ce stade, est de savoir comment intégrer cette nouvelle activité dans des laboratoires de microbiologie, de sorte que les informations proposées soient optimisées sans supposer une surcharge sur les services, généralement pas précisément sur le technicien du personnel et avec des structures de temps très diverses.

Identification directe des autres échantillons

Le nombre d’études relatives à l’application directe du Mali-tof em vers d’autres échantillons biologiques est plus petit. Comme indiqué dans une autre section, l’utilité de EM maldi-tof dans ces échantillons est déterminée par plusieurs facteurs: d’une part, l’échantillon doit provenir d’une zone stérile dans des conditions physiologiques et dans laquelle il apparaît, stocker être généralement monomicrobien. D’autre part, la charge bactérienne présente dans l’échantillon est cruciale, telle que le volume de l’échantillon disponible pour l’étude. Cela rend de nombreux échantillons différents d’urine et d’hémoculture pose de problèmes, par faible volume habituellement disponible (CSF, exsudates purulents), en raison de la faible concentration de microorganismes (CSF, fluide péritonéal chez les patients subissant une dialyse péritonéale) ou par la présence d’importantes quantités de non protéines -Bactéries pouvant modifier les profilés ou interférer avec l’ionisation des protéines bactériennes (exsudats purulents).

faible sensibilité dans ces produits dans lesquels la charge bactérienne n’est pas très élevée et le volume d’échantillon disponible, Souvent limité, faire des techniques moléculaires préférables pour un diagnostic rapide, même avec la limitation que la gamme de microorganismes détectables dans un seul test est bien inférieure à celle de EM Cuzii -Tof. Les diagnostics étiologiques de la méningite bactérienne ont parfois communiqué par CDRI-TOF sur la CSF, mais une étude signalée à 21ereccmid a indiqué que, sur 183 échantillons de CSF, dont 14 étaient positifs pour la méthode conventionnelle, aucune n’a été positive par EM Cuzid -Tof direct sur Échantillon38, qui réaffirme le fait que, du point de vue de la sensibilité, le Maldi-tof EM ne peut pas concurrencer les techniques moléculaires. Dans d’autres types d’échantillons, l’expérience est très limitée, il n’y a pas de protocoles ou de données publiés sur la sensibilité et la spécificité, et donc l’utilisation clinique de EM Maldi-tof, à ce stade, n’est pas pertinente.

Média chromogénique

Depuis l’apparition du premier moyen chromogénique (MC), il y a plus de 30 ans, est devenu un outil très utile pour l’isolement différentiel des microorganismes pathogènes. Il y a actuellement Mc Crowd commercialisé pour l’identification des bactéries et des champignons, ainsi que pour l’étude de certains mécanismes de résistance aux antimicrobiens.

Le fondement de ces moyens dans l’inclusion d’un substrat chromogène qui, hydrolysé par Une enzyme spécifique présente dans le microorganisme, il donne lieu à une colonie de colonisation caractéristique, permet sa différenciation.Ils sont également également des moyens sélectifs, qui inhibent la croissance d’autres micro-organismes à une plus grande ou à une étendue, favorisant la détection de colonies de couleur. Les principaux substrats des MC commerciaux sont des dérivés indóliciques39 qui peuvent être hydrolysés par des galactosidas ou des glucosidases, produisant de faibles dérivés toxiques et qui n’intiment pas la croissance bactérienne.

Détection de microorganismes positifs à grammes

De grands efforts ont été consacrés à Le développement de méthodes de détection de la méticiline résistant à S. Aureus (SARM), compte tenu de son importance dans l’infection nosocomiale. Dans ce contexte, l’utilisation de MC a collecté une grande importance pour l’isolement rapide et l’identification de cette bactérie. Il existe de nombreux MC sur le marché pour la détection de SARM. Une étude récente40 se compare trois d’entre eux: chromide Mrsa Smart (SMART), génération de Fist MrsA (Chromide) et Brilliance MRSA (OX2) pour le dépistage de 1 220 échantillons de patients hospitalisés. La détection de ces médias a été corroborée par EM Maldi-TOF, la diffusion sur l’agar avec des disques de céfoxitaine et une PCR commerciale pour la Mecque et la MECC. La sensibilité à 24 h était meilleure pour le milieu intelligent par rapport au milieu chromide, mais il n’y avait pas de différences significatives avec l’environnement OX2. Cependant, les auteurs indiquent qu’il est encore nécessaire, d’obtenir des résultats optimaux, d’enrichissement de bouillon pendant 24 h avant l’inoculation dans l’un des médias étudiés.

XU et al.41 avis sur 5 des médias les plus utilisés pour Détection de MRSA. Celui qui aboutit mieux à cette étude est le Brilliance MRSA 2 (Oxoid Ltd, Terminofisher, États-Unis), avec une sensibilité de 65,7% et une spécificité de 99,8%. Le rendement de ce milieu s’améliore si l’échantillon est inoculé dans un bouillon d’enrichissement avant de la planter dans le MC, avec une sensibilité de 100% et une spécificité de 99,1%. Le Maria Chromagar MRSA montre une sensibilité de 95% après 24 h d’incubation, qui atteint 100% si elle est incubée de 48 h. La spécificité dans les deux cas est de 100%. Le MARSA MARD MODIO BBL Chrome comprend la céfoxitaine dans sa composition, ce qui simplifie l’interprétation des résultats. Ce milieu a été étudié avec des isolats de SARM obtenus à partir d’hémocultures, avec une sensibilité et une spécificité de 97,6 et 99% respectivement. Le SARM SELECT a été évalué en utilisant 652 isolé des hémocultures après une incubation de 18 à 24 h à 35 ° C, avec une sensibilité de 99% et une spécificité de 98%, qui a augmenté de 99% lorsqu’il est combiné avec le test de coagulase. Le Mrsa Middle Chromid, qui intègre également la céfoxitaine dans sa composition, a été étudié dans des isolats des blessures et des cultures de sang. Dans les hémocultures, cela montre une sensibilité de 97,8% à 24 h, ce qui augmente 100% à 48 h et une spécificité de 99,7% maintenue (99,6%) à 48 h. Dans les plaies, la sensibilité et la spécificité étaient de 88,9 et 100% à 24 h et 100% dans les deux cas à 48 h.

L’établissement de comparaisons entre ce type de milieu de culture est complexe, car il existe de nombreux facteurs, car il existe de nombreux facteurs, Outre le milieu de la culture, qui peut influencer les résultats (type d’échantillon, concentration d’inoculum, temps d’incubation …). Cependant, les données de sensibilité et de spécificité disponibles suggèrent que l’un des médias susmentionnés peut être utilisé comme routine pour la détection de SARM avec une fiabilité élevée.

Un autre groupe de bactéries ayant acquis une importance dans l’infection nosocomiale est EnterocoCCICI (VRE) résistant à la vancomycine, au point que le CDC recommande l’étude des transporteurs dans des centres de prévalence élevés. L’étude des transporteurs VRE a été réalisée à l’aide de Sculin Bilis Agar avec Azide et Vancomycine (BEAV). Son utilisation impliquait un délai de diagnostic de 48 h, en plus de la nécessité d’effectuer des tests complémentaires pour une identification correcte. Pour accélérer ce processus, divers MCS ont été développés. Une étude récente compare cinq MC pour VRE en utilisant 400 échantillons de selles. Les moyens utilisés étaient intrayen Cololx VRE (biomeddiagnostiques, ville blanche ou), chromide VRE (BioMérieux, Marcyl’étoile, France), Vreselect (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France), Hardychrom Vre (Hardy Diagnostics, Santa Maria, ca) et Spectra Vre (Remel, Lenexa, KS), utilisant Beav Agar et Beavre Brev comme méthode de référence. La lecture a été réalisée à 24 heures. Les résultats des cinq médias montrent une sensibilité comprise entre 89,9 et 94,9%, plus élevés dans tous les cas que ceux montrés par Agar Beav (84,9%). Les meilleures données de sensibilité et de spécificité continue de leur fournir le BEAV, mais au détriment d’un délai de diagnostic allant jusqu’à 48 h en ce qui concerne le MC. Le MC le plus sensible de cette étude était Chromid VR (94,9%), bien que sans différences statistiquement significatives avec le reste.

La spécificité et la capacité de différencier les espèces d’Enterococcus étaient similaires pour les cinq mc. L’intray CololX VR avait la spécificité la plus basse de 98,8%, tandis que celles des quatre autres plaques étaient de 99,7%. Les caractéristiques de sensibilité et de spécificité de ces moyens permettent de détecter la détection de supports VRE lorsque cela est pertinent. Ils sont, au moins, parfaitement comparables à la gélose Beav, la diminution du temps de détection à 24-48 h.

Détection de microorganismes gramnegatifs

en 1979, Kilian et coups Décrivez un nouveau milieu de culture qui utilise la β-glucoronidase en tant que Substrat pour la détection directe de E. coli dans les urocultures. Les études de rentabilité ont indiqué que cette méthode impliquait une économie économique de 46% et une réduction de temps d’identification de 64% en ce qui concerne les méthodes conventionnelles39. Depuis lors, de nombreux MCS ont été développés avec différents substrats pour l’identification des principaux uropathogènes. L’un des médias récemment commercialisés est Chromid CPS Elite (BioMérieux, Durham, NC) qui permet une identification directe de E. coli et de l’identification présomptive d’Enterococcus spp., De certains Enterobacteriaceae et les bactéries du groupe Proveae, bien que dans ces cas. La confirmation de l’identification est nécessaire par des tests biochimiques ou EM maldi-tof.

L’efficacité de ce support pour la détection d’uroopathogens43 a été évaluée, évaluant le temps requis pour le diagnostic et les consommables utilisés en comparaison avec l’utilisation de l’agar de sang et de l’agar Macconkey. La concordance de ce média avec la méthodologie conventionnelle était de 88% pour l’urine cliniquement significative, de 74% pour l’urine ayant une croissance non significative, 69% pour la contamination et de 95% pour les plaques sans croissance bactérienne. Les principales divergences étaient dues à la croissance de la gélose sanguine, mais pas dans le MC de la bactérie de Grampositivas, en général, avec peu de pertinence clinique dans les urocultures, telles que Staphylococcus spp. et lactobacillus. En ce qui concerne le temps écoulé entre le semis d’échantillon et l’identification des colonies, la différence n’était pas statistiquement significative si les deux moyens sont comparés globalement (27,2 h de moyenne pour la méthode conventionnelle par rapport à 26,6H pour le MC), mais c’était dans Ces urinoirs dans lesquels E. coli a grandi dans une culture pure (27,1 h dans la méthode conventionnelle par rapport à 24,4 h dans chromide, p

0,0001). Les auteurs soutiennent que ce temps d’amélioration est dû à la facilité et à la fiabilité de l’identification des couleurs, ce qui évite la nécessité de méthodes d’identification complémentaires.

Médias chromid ™ CPS (CPS4) (BioMérieux, ST. Laurent, QC) et URISELECT ™ 4 (URS4) (Bio-Rad, Montréal, QC), ont été évalués44, plus de 903 échantillons d’urine, comparativement à la méthode de l’agar des sang conventionnelle et à la gélose Macconkey. La concordance avec la méthode conventionnelle était de 89,3 et 89,5% pour URS4 et CPS4 respectivement. Si seulement ces échantillons dans lesquels la croissance était considéré comme cliniquement significatif, cette concordance a augmenté à 93% dans le cas d’URS4 et 93,1% pour le milieu CPS4.

Dans tous les cas, les auteurs conviennent que le plus grand avantage de L’utilisation de MC est la rationalisation du processus d’identification, en réduisant la nécessité de tests complémentaires, ce qui permet un diagnostic étiologique plus rapidement.

Étant donné l’utilitaire démontré de cet outil de diagnostic, plusieurs groupes conçoivent de nouveaux mcs , certains pas encore commercialisés, qui peuvent supposer une alternative intéressante à l’avenir. Un nouveau Media45 a été conçu pour la détection de bactérioïdes, qui comprend dans sa formulation 3,4-cyclohechexanoscuétine-β-D-glycoside, qui est la cible d’action de la β-glucosidase de bactérioïdes et qui donne lieu à l’apparence de colonies de noir. Ce milieu a été comparé à la gélose Bilis Sculear dans 100 échantillons fécaux. Le MC a permis l’identification de B. fragilis dans 34 échantillons, tandis que dans l’agar bilis Esculinine, ce microorganisme a été détecté dans 19 échantillons. En outre, le MC était beaucoup plus sélectif, car, en aucun cas, la croissance des espèces non sexensières, tandis que dans l’agar bilis Escululine a été observée, la croissance des micro-organismes appartenant à d’autres genres (Enterobacteria, Clostridium, Candida …) par 34 occasions. Les auteurs étudient également la capacité de ces MC, complétés par Meropenem et avec métronidazole, afin de détecter la présence de bactérioïdes résistant à l’un ou à un autre antimicrobien, démontrant que dans les deux cas, ils sont capables de détecter des souches résistantes à une sensibilité de 100% et a spécificité de, au moins 85%.

Un autre moyen innovant développé est le chromagar entérocoly yersinia qui présente un avantage sur l’environnement de la cessulodine-irgasan-novobiocine la possibilité de la croissance des souches de Y. Enterocolitia Serovar O3 et Y. Psedotuberculose, dont la croissance peut être vue. inhibé dans le milieu cin46.

Détection de levure

Bien que le premier MC développé pour les champignons, au début des années 90, ils ont eu peu de succès dans leur application clinique par leur capacité de différenciation limitée, MC pour la mycologie développée dans le Les 15 dernières années ont eu un succès beaucoup plus grand, car ils permettent une identification rapide présumée de différentes espèces de levure, une meilleure étude des cultures mixtes et l’identification précoce des espèces associées à la résistance antifongique. Les moyens développés sont basés, comme dans les cas précédents, en présence de substrats pour une ou plusieurs enzymes (β-N-acétyl hexosaminidase, et dans certains cas, β-glucosidase ou phosphatase), qui permettent une identification rapide, du moins, Par Candida Albicans, et dans de nombreux cas, l’identification définitive ou présumée de Candida Gabrada, Candida Lusitaniae, Candida Kefyr, C. Parapassilose, Candida Tropicalisais et Candida Krusei. Les études disponibles et l’expérience déjà prolongée avec ce type de média démontrent une spécificité de spécificité élevée et une bonne sensibilité. Toutefois, compte tenu de la variabilité de la couleur et de la morphologie pouvant apparaître dans des isolats de la même espèce, l’identification doit toujours être considérée comme présomptive. Une étude récente sur plus de 5 600 échantillons cliniques positifs pour la levure, montre que plus de 8% étaient des cultures mixtes, dont la détection est beaucoup plus probable si MC est utilisé et propose un algorithme qui combine MC et EM Maldi-tof comme une procédure plus appropriée de l’identification47.

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêts.