Les microtubules interpolaires sont dispensables dans la fiose de Meiosis II – Communications de la nature – Communications 2021

a) des kymographes de Les cellules de type sauvage (WT) et MAD2 ont subi une expérience MII en absence (-) ou présence (+) de MBC (N ≥14). Les centronomères du chromosome II ont été marqués de GFP (CEN2-GFP) et son SPB a été contrôlé avec SFI1-CFP (rouge). MBC a été ajouté avant la séparation SPB. La longueur des flèches correspond à 5 min. (b) La précision de la ségrégation de chromosomes lors de la messagerie instantanée en IMS dans le type sauvage et mad2 était quantifiée (TIN non jumelé, N ≥14). Des images typiques sont également présentées pour la ségrégation de CEN2-GFP égal et inégal. (c) La durée de MII a été mesurée lors de la surveillance des signaux CUT11-3MRFP. CUT11-3MRFP Des projecteurs formés dans le SPB à l’entrée de Mii et ont disparu au début de l’anaphase. Les lignes du diagramme de la boîte et des moustaches de petite taille sont la valeur maximale, le centile 75, la médiane, le centile 25 et la valeur minimale (n ≥16). Les astérisques indiquent des valeurs atypiques. (d) Emplacement de MAD2 Pendant Mii en absence (à gauche) ou présence (droite) de MBC (N ≥ 10). MAD2-MCHERRY (MAD2-MCH, RED) a été surveillé avec MIS6-2GFP (vert) et SFI1-CFP (bleu). L’heure à laquelle les projecteurs sont apparus pour la première fois dans les Cinetockers sont désignés à 0 min. L’ajout de MBC a conservé MAD2 dans les CINETOCORAS pendant plus de 12 minutes, date à laquelle les foyers de MAD2 ont déménagé à SPB en l’absence de MBC. Barres d’échelle, 2 μm. (e) la durée de l’emplacement de MAD2 dans les CINETOCOROS avec ou sans MBC a été déterminée à partir des observations de d. N’oubliez pas que l’emplacement de Mad2-Mcharry dans SPB, ce qui signifie qu’une libération d’activation du point de contrôle n’est pas comptée ici. Les lignes du diagramme de la boîte et des moustaches de petite taille sont la valeur maximale, le centile 75, la médiane, le centile 25 et la valeur minimale (n ≥10). Les astérisques indiquent des valeurs atypiques. (f) La progression méiotique de la culture synchrone Diploid Pat1-114 a été surveillée en comptant le nombre de noyaux par cellule à chaque point de temps. La méiose a été induite par changement de température (à 0 h). MBC a été ajouté lorsque la population de cellules binucléées (post-mi) était au maximum (à 3,3 h). (g) la viabilité des spores des cellules diploïdes PAT1-114 traitées avec ou sans MBC comme en F a été examinée par une analyse TETRADE (N > 300).

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en mitose et im, le point de commande de l’ensemble de broche (SAC) fonctionne pour surveiller la connexion des microtubules au cinécorus. Les composants du SAC, y compris MAD2, reconnaissent des Cinetockers Unies et inhibent l’activation du complexe / cyclosome du promoteur anaphase, de sorte que les cellules puissent attendre dans la métaphase jusqu’à ce que l’Union améliore 19. Pendant la mitose, MBC provoque des défauts dans la broche et le sac actif 15, 20. Il est possible que l’activité du SAC soit nécessaire pour IPMT indépendant IMI causée par MBC.De cette manière, nous surveillons le comportement du CEN2-GFP dans le mutant de l’enlèvement de MAD2 (MAD2 Δ). En l’absence de MBC, les Zigotos MAD2 sous ont subi une ségrégation chromosomique normale comme dans les cigotations de type sauvage (MAD2 δ MII, -MBC, Fig. 2a, B). Lorsque MBC a été ajouté au début de la MII, environ 60% des Zigotes d’exposition MAD2 ont montré une ségrégation inégale du CEN2-GFP, qui était nettement plus élevée que la ségrégation inégale ~ 20% survenue dans des cigotations de type sauvage (Figure 2B). Les cigotos de type sauvage traitées avec MBC pendant la MII ont montré un délai au début de l’anafase II (Fig. 2c). Ceci a été annulé en éliminant MAD2, qui indique que le retard était dû à l’activation du sac (fig. 2c). Selon cela, MAD2-MCHERRY a montré un emplacement prolongé de CINETOCOROS dans des cigarres de type sauvage en présence de MBC (Fig. 2D, E). Ces résultats indiquent que, au cours de la MII en présence de MBC, MAD2-SAC assure la reliure correcte des microtubules aux Cinetockers, suggérant que les courtes microtubules restantes qui ont survécu après l’addition du MBC servent de KTMTS et que votre adéquat L’attachement aux Kinetochores désactive la surveillance de la MAD2-SAC (Fig. S3E, F) Supplément. Ces résultats indiquent également qu’il est peu probable que la division indépendante de l’IPMT soit une inadéquation déréglée qui conduit à une ségrégation aléatoire de chromosomes et au détachement du noyau de manière inappropriée, telle que les mutations de la coupe meurtrale.

Suivant, nous Évaluez si le traitement avec MBC au cours de la MII pourrait affecter la viabilité des spores. Le mutant PAT1-114 a été utilisé pour induire la méiose synchronisée 21, 22, 23. MBC a été ajouté à 3,3 h après l’induction de la méiose, lorsque la population cellulaire avec deux noyaux (c’est-à-dire post-mi) était au maximum (environ 90%, fig. 2f). Le MBC a entraîné une réduction de la viabilité des spores à 50% de celle des cellules traitées simulées (Fig. 2G). Cette valeur peut refléter la fidélité de la ségrégation chromosomique: la fréquence de la ségrégation fidèle du CEN2-GFP dans les cellules MCI traitées avec MBC était de 80% (figure 2b), ce qui implique que la fréquence estimée de la même ségrégation des trois chromosomes serait 51% ((0,8) 3 = 0.512), comparable à la viabilité des spores observées en présence de MBC.

La membrane de forespora est responsable de Mii sans IPMTS.

Depuis que l’IPMT était dispensable pour les événements Mii, nous nous demandons ce qu’il pourrait servir de pilier structurel pour séparer les SPB et maintenir la structure bipolaire indépendamment de l’IPMT. Comme Mii est couplé à la sporulation (l’événement terminal de la méiose correspondant à la gamétogenèse dans les Upperogyotes supérieures), nous soupçonnons que certains systèmes cytosquelettiques liés à la sporulation pouvaient être impliqués dans les événements indépendants de l’IPMT. Un candidat pourrait être la membrane de spores, qui est un précurseur de la membrane plasmatique de la spore entourant les noyaux pendant la MII 24. La membrane des spores était affichée avec la protéine T-Snare étiquetée avec GFP PSY1 / Syntaxine 1 (GFP-PSY1) 25. Comme indiqué précédemment, la membrane des répondances a commencé à se réunir autour des SPB sous la forme d’une demi-lune après laquelle il a été séparé par IPMT (15 min, figure 3A). La membrane encapsula progressivement les noyaux comme l’anafase II a progressé (36 min et 72 min). Cependant, dans les cigotos traités avec MBC, la séparation SPB sans IPMT s’est produite simultanément avec le début de la croissance de la membrane de spores (30-35 min, Fig. 3a). La membrane des spores a continué de croître et enfin entouré les deux noyaux, ce qui a entraîné sa division (100 min). Cela nous a conduits à l’hypothèse qui, en l’absence d’IPMTS, la membrane de la présera peut servir de squelette structurelle, dont la croissance à l’extérieur pourrait générer une force qui sépare les SPB et limite le noyau.

(a) des images cellulaires vives de Cigotos Mii que Portan GFP-PSY1 (membrane de spores, vert) et CFP-ATB2 (rouge) en l’absence de MBC (ci-dessus) (n = 18). MBC a été ajouté avant l’apparition de MII (en bas) (n = 18). La séparation SPB s’est produite de manière concomitante avec le début de l’assemblage de la membrane des spores. (B) Mii a été filmé par SPO15 Cellules portant des cellules portant GFP-ATB2, Miss6-2MCHERRY (MIS6-2MCHCH) et SFI1-CFP en présence de MBC (N = 10). Les SPB ne s’étaient pas séparés à la fin de l’observation (94 min). (c) la double mutante SPO15 Δ CUT7-446 qui porte GFP-ATB2, Miss6-2MCHERRY et SFI1-CFP sont soumis à MII à la température restrictive.Le double mutant présentait le phénotype de la broche monopolaire (N = 8), indiquant que la membrane de prévisorama a un rôle crucial dans la formation de la broche bipolaire pendant la MII dans les cellules CUT7-446. (d) Séparation des schémas de sœurs Chromaties lors de Mii dans des cigarres de type sauvage et MEU14 Δ SPN6 surveillée surveillé par CEN2-GFP avec SFI1-CFP (test T-T-Tails à deux queues, N ≥14). Des images typiques sont également présentées pour la ségrégation de CEN2-GFP égal et inégal. (e) la division nucléaire lors de la MII de cigotos de type sauvage et de la MEU14 Δ SPN6 Δ a été surveillée par CUT11-MCHERRY (CUT11-MCH); Les cellules ont été classées comme sujettes à la division normale, division anormale ou sans division (n ≥18). Des images typiques de chaque catégorie sont également présentées. (f) La bague de bord antérieure formée sur le noyau a été affichée avec Meu14-Mchérry (MEU14-MCH) (N ≥ 24). (UP, GAUCHE) En l’absence de MBC, les anneaux de bord d’attaque formés après la séparation SPB. (Up, droite) en présence de MBC, les anneaux de bord antérieurs formés à partir de chaque SPB ont été mis en contact avec l’autre, qui a été maintenu lors de la séparation du SPB (indiqué par un marqueur SPB, Cut12-CFP) et la croissance de la membrane de spores (affichées avec GFP). -Psy1). Les dessins schématiques des noyaux (orange) et les anneaux du bord d’attaque (rouge) sont également présentés. (Partie inférieure) Le complexe septine a été affiché avec SPN6-MCHERRY (N ≥ 8). (En bas à gauche) en l’absence de MBC. (En bas à droite) en présence de MBC. Les dessins sont également représentés pour NUCLEI (Orange) et le complexe septine (rouge). Barres d’échelle, 2 μm.

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Si la membrane des répondrs entraîne une séparation SPB en l’absence d’IPMT, l’inhibition simultanée de la membrane des préviseurs et la formation de microtubules rendra cela difficile. Pour tester cette possibilité, nous utilisons le mutant SPO15 Δ, dans lequel les SPB ne sont pas modifiés correctement et la membrane du précurseur ne s’assemble pas dans eux 27. La séparation du SPB n’a jamais été observée dans les cellules traitées SPO15 traitées avec MBC (94 min, la figure 3B), ce qui montre que, en fait, il s’agissait de la membrane de la présera qui stimule la séparation du SPB en l’absence d’IPMT. En outre, aucune ségrégation de chromosomes ou de division nucléaire n’a été observée. De même, la séparation SPB qui a eu lieu au cours de la MII dans les cigotations CUT7-446 a été bloquée par le retrait SPO15 (Fig. 3C). Par conséquent, la membrane de la présera compense les défauts structurels de la broche bipolaire causée par une perte ou une défaillance de l’IPMT dans le glissement des microtubules antiparailles. Les deux cellules traitées SPO15 traitées avec des cellules MBC (figure 3b) telles que SPO15 7 Cut7-446 cellules (Fig. 3C) ont échoué à séparer les SPB, séparent des chromosomes et divisent le noyau, bien que ces cellules avaient des microtubules restants autour du SPB. Ces observations montrent que ces événements méiotiques indépendants IPMT ne sont contrôlés que par la membrane de spores, mais pas par le reste de la KTMT.

la bague de pointe et le complexe septien.

La croissance Le bord de la membrane de brin est bordé par la structure du bord d’attaque, qui contient des protéines telles que la MEU14 (Refs 28, 29) et est supportée par le complexe Septin 30 (SPN2, SPN5, SPN6 et SPN7). La structure de pointe et le complexe septine sont nécessaires pour naviguer sur la croissance de la membrane des spores dans la direction correcte 30. Nous bloquons la fonction des deux structures en utilisant Double MEU14 MEU14 Δ SPN6 DIS pour désorienter la croissance de la membrane de spores. Les cellules traitées SPN6 MEU14 δ traitées avec MBC pourraient séparer SPB pendant la MII dans une certaine mesure, probablement parce que la membrane de la présera pourrait être assemblée initialement sans septinas et le MEU14. Cependant, ces cellules ont souvent échoué dans la ségrégation des sœurs chromatides de manière égale et dans l’exécution de la division nucléaire (Fig. 3D, E).

significativement, les anneaux de bord antérieur formés a des deux SPB ont fait et contact physique maintenu les uns avec les autres lorsque les SPB sont séparés en l’absence d’IPMT (Fig. 3F). Le complexe septine affiché par SPN6-MCHERRY est également apparu simultanément à l’apparition des anneaux d’attaque pour aligner la membrane de spores (Fig. 3F). Ces résultats fournissent ensemble des preuves génétiques et visuelles selon lesquelles la membrane de forespora correctement orientée vers l’anneau du bord d’attaque génère une tension d’interpolate, qui conduit en effet à une séparation constante de SPB, la séparation des chromosomes et de la constriction nucléaire. La bague du bord d’attaque contenant du MEU14 est soutenue avec F-actine 31.Lorsque la polymérisation de l’actine a été inhibée avec la latronculine A en présence de MBC, la bague du bord d’attaque n’a pas été contractée et échouée dans la ségrégation des chromosomes et la division nucléaire, bien qu’une séparation du SPB (Fig. S5 complémentaire) s’est produite. . Ce phénotype est similaire à celui de MEU14 Δ SPN6, validant le rapport fonctionnel de la bague de bord d’attaque et d’actine.

Contribution de la membrane de forespora à la MII physiologique.

Tous les résultats ci-dessus suggèrent que la membrane des spores fonctionne comme un dispositif structurel qui aide la fusée à la broche. Pour vérifier si la membrane interdite la membrane des spores contribue également à la MII physiologique, dans laquelle les microtubules ne sont pas dérangés, nous utilisons le spo15 du mutant δ, qui ne forme pas la membrane de la spore. Bien que SPO15 ne soit pas essentiel pour la progression de MII 27, nous nous concentrons particulièrement sur la fidélité de la séparation SPB en surveillant une composante du complexe de pores nucléaires, CUT11-3MRFP. Cette protéine est située dans les SPBS lorsqu’elles sont intégrées à l’enveloppe nucléaire au début de la phase M 32 (figure 4a) et ne sont plus associées à eux au début de l’anaphase. Pour chaque noyau, nous enregistrons la durée de séparation SPB comme indiqué par la Division d’approche Single Cut11-3MRFP. Étonnamment, le SPO15 pendant les cellules pendant la MII a parfois montré la disparition d’un seul point de coupe 11 sans séparation, ce qui suggère que la séparation du SPB ne s’est pas produite dans Mii (Fig. 4a et Tableau 1). Aucun échec n’a été observé dans la séparation du SPB lors de la mitose et du MI dans les cellules SPO15 Δ (Fig. 4a et Tableau 1). Par conséquent, la membrane des spores, au moins en partie, contribue à la séparation efficace du SPB lors de la MII physiologique.

(a) Le comportement de Cut11-3MRFP a été filmé dans de type sauvage et spo15 dans des cellules au début de la mitose et Mii (n ≥ 26 ). Dans les cellules de type sauvage (WT), CUT11-3MRFP était constituée de manière constitutive dans l’enveloppe nucléaire et a formé des foyers supplémentaires dans les SPB à l’entrée mitotique / MII; Cet emplacement a continué à travers la séparation SPB (visible comme deux projecteurs) et a disparu au début de l’anaphase. Toutefois, dans les cellules SPO15 Δ de l’entrée MII, les foyers Cut11-3MRFP ont parfois disparu sans être divisés, indiquant une défaillance dans la séparation du SPB au début de l’anaphase (26-29 min). (b) Kymographes de laps de temps montrant la cinétique de la broche pendant Mii dans des cellules de type sauvage, SPN6 Δ et MEU14 Δ SPN6 ((N ≥8). L’un des deux points Cut12-CFP (SPB) à chaque point aligné au bas de l’image pour rincer une augmentation de la distance inter-SPB. La longueur des flèches correspond à 5 min. barres d’échelle, 2 μm (c) La cinétique de SPB a été graficly représentée dans un type sauvage, SPN6 δ et MEU14 Δ SPN6 Les cellules observées observées observées en b. Chaque ligne représente la cinétique d’un seul noyau (n ≥8).

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Tableau complet

Pour enquêter plus en profondeur si la croissance de la membrane de spores contribue à la séparation du SPB lors de la MII physiologique, nous surveillons la cinétique de la distance inter-SPB (marquée par CUT12-CFP). La distance inter-SPB a augmenté avec une manière progressive au cours de la MII dans des cellules de type sauvage, comme le produit lors de la mitose (Figure. 4b, c). En revanche, la croissance désorientée de la membrane des spores dans la MEU14 Δ SPN6 était fréquemment associée à une fluctuation de la distance inter-SPB (figure 4b, c). Une fluctuation similaire mais moins notable a été observée dans le seul mutant SPN6 (figure 4B, C), qui indique que le MEU14 et SPN6 fonctionnent dans le guide de la membrane de spores sur une route parallèle 30 (Fig. 5a pour un schéma). Le Taux de séparation de SPB dans la MEU14 Δ SPN6 Les cellules pourraient être transitoyablement plus rapides que celles des cellules de type sauvage (Fig. 4C), probablement parce que la croissance désorientée de la membrane foresporase a forcé une séparation rapide des SPB. Ces résultats montrent que la dynamique de la membrane de spores contribue efficacement à la cinétique de la séparation SPB pendant la MII dans des conditions physiologiques. En outre, les cellules présentées par le MEU14 Δ SPN6 ont montré une division anormale en hausse de 20% des noyaux de MII, suggérant l’importance de l’organisation adéquate de la la membrane de spores pour une constriction précise du noyau.

(a) Illustration schématique de la fonction des septinas et des protéines de pointe (LEP) dans l’assemblage de la membrane des spores.Septes et Les LEP ont un rôle important dans l’orientation de la membrane des spores. Dans le type sauvage (WT), le bord de la croissance de la membrane forestière est bordé par les LEPS qui incluent MEU14 pour guider et construire adéquatement la membrane de la présera. Le complexe septine méiotique (SPN2, SPN5, SPN6 et SPN7) guide la direction de la croissance des bords. Les Septes et les LEP contrôlent de manière coopérative la gestion de la croissance de la membrane de la présera. Le phénotype de sporulation médiocre est plus important lorsque SPN6 combiné est combiné à MEU14; Par conséquent, le double muant muant MEU14 Δ SPN6 a été utilisé dans cette étude comme une souche qui manque de septine et de LEP. Dans les cellules SPN6 MEU14 Δ, la membrane des spores ne peut pas encapsuler de manière adéquate le noyau, entraînant la production de spores défectueuses. b) Cette étude propose un nouveau rôle pour les septinas et le LEPS dans la ségrégation des chromosomes et de la division nucléaire au cours de la MII. En l’absence d’IPMTS (WT + MBC), la membrane de la présera, qui commence à se réunir de SPBS, divise les SPB. La membrane des spores est ensuite guidée par les structures contenant des septin et le LEP pour entourer le noyau. Lorsque MBC est ajouté à MEU14 Δ SPN6 cellules ((MEU14 SPN6 Δ + MBC), l’assemblage membranaire de la présera est désorienté et la ségrégation de chromosomes ou de division nucléaire n’est pas produite. Comme le SPB émanant des microtubules est connecté à la membrane des spores. Son assemblée non coordonnée peut affecter l’efficacité et la fidélité de l’Union des microtubules Kinetochore. De plus, Septinas et le LEP limitent le noyau libre IPMT en générant une force normalement utilisée pour encapsuler le noyau après la médiation de la division nucléaire de GPMT .

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Discussion

Nous avons démontré la fonction sans précédent de la membrane des spores dans la séparation du SPB, la ségrégation de chromosomes et la Division nucléaire au cours de l’IIM. Nous proposons que, au stade initial de Mii, la membrane forestière en développement génère une force de séparation du SPB des SPBS correspondant à HA. Il est à l’extérieur le long de la membrane nucléaire, puis soutient la broche bipolaire pour une ségrégation efficace de chromosomes. En l’absence d’IPMT, les structures de bord de progression développées à partir de la collision de deux SPB et leur force de répulsion génère une tension physique entre les SPB (Fig. 5). L’appareil de division média par la membrane des spores, renforcé par la structure du bord de l’attaque et septien, peut faciliter la ségrégation de chromosomes et la constriction de l’enveloppe nucléaire, même en l’absence d’IPMT. Fait intéressant, MAD2-SAC était tenu de garantir le moment adéquat de la ségrégation de chromosomes en l’absence d’IPMT, ce qui implique que la constriction nucléaire médiée par la membrane de spores pourrait être réglée par le complexe promoteur de l’anaphase / cyclosome. Sur la base de la capacité de la membrane de spores à compenser l’absence d’IPMT lors de l’IAS, nous pensons que les fonctions cruciales de l’IPMT sont les suivantes: ancrez les poteaux de la broche à l’enveloppe nucléaire pour assurer la force de la ségrégation des chromosomes et diviser le noyau en anaphase.

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La division cellulaire sans l’homologue de Tubulin FTSZ est produite dans des souches de bactéries Bacillus subtilis qui sont défectueuses dans l’organisation de la paroi cellulaire 33. Il a récemment été signalé qu’une division nucléaire indépendante des microtubules (fission nucléaire) survient dans la mitose de S. Pombe lorsque la cytokinesis (la formation de la paroi cellulaire à la sortie mitotique) est inhibée artificiellement, bien qu’il ne soit pas clair comment il est généré une force. Dans cette étude, nous avons des mécaniciens clarifiés pour générer la force nécessaire à la division nucléaire sans IPMT pendant la MII: le contact physique des bords de la membrane de spores est le pivot. Contrairement aux études précédentes de la mitose, la force médiée par la membrane de spores contribue apparemment à la MII physiologique.

Nous spéculons que ladite machine à médiation de machines peut avoir été développée en tant que système de sauvegarde pour la ségrégation de chromosomes pendant la MII, dans lequel la structure de la broche peut ne pas être aussi robuste que lors de la mitose ou de la messagerie instantanée. L’axe méiotique est construit en premier lors de la messagerie instantanée, puis des démonticules, suivis de la reconstruction au cours de la MII. En particulier, Mii est une « méiose pratiquement ouverte » dans laquelle les protéines nucléaires sont dispersées du noyau lors de l’anafase 34, 35. Ces situations peuvent impliquer que l’organisation de la broche pourrait être moins efficace dans l’IMA que dans la mitose.D’autre part, Mii doit être couplé à l’encapsulation des noyaux des frères par la membrane des spores. Par conséquent, la membrane de la présera peut avoir besoin de la capacité de générer une force qui aide les fonctions de la broche. La structure de la membrane qui implique des protéines de pointe et septien a acquis une double fonction: l’encapsulation du noyau et l’assistance de la ségrégation de chromosomes. Il est intéressant d’observer les similitudes et les différences entre cette structure et la matrice de cordes, qui est censée maintenir la structure de la broche dans des eucaryotes supérieures, comme un squelette en matériaux qui ne sont pas des microtubules 36. Une organisation membraneuse comprenant une feuille B a récemment été montrée qu’il fonctionne comme une matrice de broche qui entoure toute la broche de PROMTAFASE pour maintenir sa structure 37, 38, 39. Cependant, en plus d’être un échafaudage structurel, la membrane de la présera peut générer une force pour la séparation de la division SPB et nucléaire. Les eucaryotes supérieurs ont peut-être développé une machine dépendante de microtubule en tant que dispositif de générateur de force avantageuse et la matrice de broche membranienne peut avoir différenciée comme une structure de support.

souches de levure et procédures génétiques.

Les souches utilisées dans cette étude sont répertoriées dans la table complémentaire S1. Les méthodes standard basées sur la PCR pour l’orientation de gènes 4, 40 ont été utilisées pour construire des générateurs de gènes et de souches marquées de protéines fluorescentes avec des cassettes de gènes de marqueurs de sélection, à l’exception de la souche GFP-PSY1 26, construite par intégration d’un plasmide contenant GFP-PSY1 Construction de fusion (un cadeau de T. nakamura). A. Yamamoto 17 a fourni la souche CEN2 – GFP. En bref, les séquences répétitives de Lachco ont été insérées près de la région de Centromera du chromosome II (CEN2), qui a été reconnue par une protéine de fusion de la fusion de la dentelle-GFP nucléaire-GFP Co-exposée. Pour l’induction de la méiose, des cellules H 90 homothéliques ont été observées dans le milieu de gélose de la sporulation pour toutes les expériences, à l’exception du test de faisabilité de spores illustré à la Fig. 2f, g (voir ci-dessous).

Synchronisation de la méiose et Essai de viabilité des spores.

pour le test de viabilité de SPORore (Fig. 2f, g), nous utilisons un système pour induire une méiose synchronisée à l’aide du Diploid (H-/ H -) PAT1-114 + MAT-PC Souche 41, déterminant ainsi lorsque la population binucléée était à son apogée (et donc lors de l’ajout de MBC). Pour contrôler la progression de la méiotique avec le nombre de noyaux, les cellules ont été colorées avec 4 ‘, 6-diamino-2-phénylindol après la fixation dans un méthanol à 50%. La viabilité des spores a été examinée par analyse Tetrade. Les spores ont été germées dans le milieu riche en extrait de levure. La faisabilité est la moyenne de trois expériences indépendantes.

Microscopie

pour obtenir des images de cellules mitotiques cellulaires vivantes, cellules de croissance logarithmiques cultivées en milieu défini synthétique riche en thiamine à 30 ° C pendant ≥ 13 h. Pour obtenir des images de cellules cellulaires vivantes dans la méiose, des cigotos ont été utilisés situés dans le milieu de l’agar de sporulation à 25 ° C pendant ≥8 h. Les cellules vivantes ont été observées dans le milieu minimum d’Édimbourg avec ou sans une source d’azote pour analyser le cycle mitotique ou la méiose, respectivement. Les images de cellules vivantes ont été effectuées comme décrit 4 dans un système DeltaVision-Softworx (précision appliquée) utilisant un microscope (IX71, Olympus) équipé de filtres d’isothiocyanate de fluorescéine, de MCHERRY et de CFP (Technologie de la chroma), APO N × 60 (NA, 1,42 ) ou une huile d’huile d’huile SAPO × 100 (NA, 1.40) Huile (Olympus), une caméra COOLSNAP HQ2 (photométrique) et un contrôleur de température (contrôle de précision) à 25 ° C, à l’exception des Figs 1G et 3C et des figues complémentaires S2 et S3E , F (32 ° C ont été utilisés pour le mutant sensible à la coupe de température 7-446 et NUF2-1). La section z a été effectuée à des intervalles de 0,4 ou 0, de 5 μm, et les images ont été prises toutes les 1 à 5 minutes. Les images ont été décontées et une projection z-pile a été créée avec la somme ou la méthode maximale. Le changement de température des mutants sensibles à la température a été effectué au moins 1 h avant l’observation.

Traitement de la toxicomanie

dans des images de cellules vivantes, des images pour la première fois qu’ils ont été prises sans MBC. Ensuite, MBC (Sigma-Aldrich) a été ajouté à une concentration finale de 50 μg ML -1 dans toutes les expériences. La latronculine A (Invitrogen) a été ajoutée à une concentration finale de 50 μm d’au moins 1 h avant d’obtenir des images de cellules vivantes.

statistiques

Un test TION T a été utilisé des files d’attente non ratinées pour des analyses statistiques .

Informations complémentaires