La conservation des introns et la perte nucléaire de la SFPQ sont des altones moléculaires – Nature Communications – Communications 2021

Variation de la longueur de 3 ‘utr lors de la neuropèse du moteur humain. Pour encadrer des diagrammes de différentes distributions de longueur UTR maximale exprimée à différentes étapes de la différenciation Mn dans les échantillons de contrôle (à gauche) et du VCP MU (à droite). Valeur VAL obtenue avec le test Wilcoxon. B Bar graphics montrant les 3 ‘UTR numéros avec des modifications statistiquement significatives entre le promoteur distal (à gauche) et le promoteur proximal (à droite) dans différentes étapes de la différenciation par rapport aux IPSCS dans les échantillons de contrôle (barres grises) et des échantillons MU VCP (barres de magenta). Insertion, graphiques circulaires représentant les proportions de gènes présentant l’utilisation de UTR à alternative dans les échantillons de contrôle et VCP MU (blanc), uniquement les échantillons de contrôle (zone grise) ou uniquement les échantillons VCP MU (zone de magenta). C Allez l’analyse d’enrichissement des itinéraires biologiques associés à des gènes qui montrent des changements distaux statistiquement significatifs dans l’utilisation du site poly (a) sous contrôle mm par rapport à la commande IPSC. D, et à gauche, les vues du navigateur de génome des profils ARN-SEQ dans les 3 ‘UTR de gènes GNL1 et TARDBP montrant des modifications statistiquement significatives de manière proximale à l’utilisation du site POLI dans MMN par rapport à IPSCS. À droite, barres de barres montrant l’utilisation distale de l’UTR de 3 ‘par rapport à l’UTR proximal de 3’. P- Valeurs obtenues avec le test du nombre de pêcheurs. F Même que C pour les gènes qui montrent des modifications proximales statistiquement significatives de l’utilisation du site Poly (A) dans le PNJ de contrôle par rapport à la commande IPSC. G, H juste comme D pour znf254 et gènes DRAS qui montrent des modifications distales à une proximité statistiquement significative dans l’utilisation du site Poly (A) dans les NPC par rapport à IPSC

Image complète

Pour étudier davantage la dynamique du traitement UTR en 3 ‘, nous analysons les sites en tandem poly (a) qui se trouvaient dans le même terminal exon. En utilisant le nombre de lectures attribuées à la borne de 300 NT du segment de chaque utr de 3 ‘en tant que proxy pour le niveau d’expression ISOFORM, nous quantifions l’utilisation du site alternatif poly (A) à différentes étapes de développement par rapport à IPSC. 822 gènes montrent des variations de contrôle UTR 3 ‘statistiquement significatives de contrôle et / ou de VCP MU (Fig. 3B). Dans 171 gènes, il y a une utilisation accrue du site poly (A) distal (A) sous contrôle et dans le VCP MMN (Fig. 3B), selon une étude précédente 29; Ces gènes sont enrichis en termes de go liés à l’épissure de l’ARNm (Fig. 3C). Dans le stade Mn < 10, les gènes montrent une utilisation différentielle significative de 3 ‘UTR lorsque les cultures de contrôle et le VCP MU sont directement comparés, ce qui confirme une régulation de la longueur de 3’ utr similaire dans la différenciation des terminaux entre le contrôle et le VCP MU (Fig. 4A Supplément).Il convient de noter que, dans plusieurs cas, les échantillons de VCP MU montraient un changement distal significatif du promoteur à une étape comparativement antérieure pour contrôler les échantillons. Ces exemples incluent GNL1 (figure 3D) et TARDBP (figure 3e); Ce dernier montre également une accumulation d’isoforme UTR 3 ‘longue dans SOD1 Mn par rapport aux commandes, mais pas dans FUS MU (Fig. 4C, D). Aucune de ces variations de UTR en 3 ‘a conduit à des changements mesurables dans l’expression de gènes ou de protéines (Fig. 4e, F, G complémentaire).

de 822 gènes, 169 présentent un changement proximal du promoteur Statistiquement significatif spécifiquement dans la CNP de contrôle par rapport aux IPSCS (Fig. 3B). Divers itinéraires biologiques, tels que la transcription et la régulation de la neurotrophine, sont représentés entre les transcriptions qui montrent un raccourcissement de l’UTR transitoire de 3 ‘(Fig. 3F). Environ 80% de ces événements sont absents dans VCP MU (Fig. 3B, G, H); Ceci est en outre confirmé lorsque VCP MU et les échantillons de contrôle sont comparés directement au stade NPC (Fig. 4a, B). Ces données démontrent que des pics de variation de longueur d’UTR de 3 ‘étendus avant de partir et de caractériser la transition d’IPSC en NPC. Il est important de noter que les échantillons de VCP MU ne montrent aucun processus similaire apparent.

La régulation au bas du facteur de l’épissure correspond à une infrarouge Aberrant IR

après avoir identifié le principal Les différences d’épissage des échantillons d’ELA par rapport au contrôle, il a ensuite été essayé de comprendre si le fond génétique ELA conduit à des différences de transcription mesurables lors de la neurorogenèse du moteur. Plus précisément, nous étudions des changements d’expression qui ne sont pas identifiés de manière optimale par groupe hiérarchique (Fig. 1B), souvent dominés par un seul programme de transcription. Nous appliquons la décomposition de valeur unique (SVD) à l’ensemble de la matrice d’expression (15, 989 gènes dans 31 échantillons; FIGUE. 1A) Pour identifier les principaux programmes de transcription et les processus biologiques associés qui sous-tendent la neurogenèse moteur 30. Utilisation de cette méthode, nous constatons que (1) la neurorogenèse progressive, (2) l’induction neurale et le motif transitoire, et (3) la différenciation terminale avec une contribution à l’induction neuronale constituent les principaux programmes d’expression cellulaire orthogonale qui fonctionnent à long du parcours du temps de développement; Ces trois premiers composants capturent 69% de la variance de l’expression de gènes (Fig. 4A-C, Fig. 5a complémentaire). L’analyse de l’enrichissement fonctionnel Go des groupes de gènes qui étaient associées positivement ou négativement à ces composants (fig. 4D-F) confirme en outre l’association biologique de chaque composant principal. Il est important de noter que les échantillons de contrôle et le VCP MU se comportent de la même manière dans ces trois premiers composants. Une analyse linéaire multivariée a confirmé que la durée de la culture au lieu de la mutation VCP est la variable qui explique les composants 1, 2 et 3 (Fig. 5B complémentaire).

La régulation aux composants d’épissage globaux. A – C analyse de la décomposition de la valeur singulière de l’expression de 15, 989 gènes dans N = 31 échantillons. À gauche, les graphiques de ligne montrent les profilés d’expression des trois premiers vecteurs singuliers \ (\ WillightTarrow v _1 \) via \ (\ WillightTarrow v _3 \), capturant 47%, 15% et 7% de la variance dans l’expression de gènes , respectivement. Les points de données gris et magenta indiquent l’expression des échantillons de contrôle et du VCP MU. Sur la droite, la carte thermique de l’expression normalisée des gènes dont les profils d’expression corrélent positivement (indiqués par les trois rectangles plus sombres) et négatif (indiqués par les trois rectangles plus clairs) avec les trois premiers vecteurs singuliers à droite. Les graphiques de barres D-F indiquent des scores d’enrichissement pour des fonctions biologiques de gènes de gènes qui sont corrélées positivement (trois barres inférieures) ou négativement (trois barres inférieures) avec les trois premiers vecteurs singuliers à droite. G Schéma de bar en haut, qui représente le nombre de gènes réglementés au déclin des échantillons MU de VCP par rapport au contrôle de différentes étapes de la différenciation MN. Ci-dessous, la carte chauffante des fonctions biologiques de Go enrichies entre les gènes régulés aux points de temps correspondants.h Des diagrammes de trésorerie montrant les distributions des modifications apportées à la modification du journal2 pour 66 gènes du facteur d’épissage essentiel entre les mutants et les contrôles de la SLA; Boîtes blanches = VCP MU par rapport aux commandes, boîte bleue = SOD1 MU par rapport aux commandes isogéniques, boîte verte = FUS MU par rapport aux commandes

image complète

Suivant, nous effectuons un Analyse différentielle de l’expression des gènes Pour évaluer si les gènes spécifiques sont réglementés de manière différentielle de différentes étapes de développement neuronal dans VCP MU par rapport aux échantillons de contrôle. Deux cent cinquante-six gènes ont été régulés statistiquement à VCP MU dans la phase NPC au cours de laquelle une IR Aberrant se produit (log2fc > 1.5 et la valeur de p < 0,01); Ces gènes sont hautement enrichis dans l’épissure de l’ARNm et les fonctions de traitement de l’ARN de l’extrémité 3 ‘(Fig. 4G). Il convient de noter que 47 de ces gènes codent rbps (Fig. 5D complémentaires). Il y avait beaucoup moins de gènes réglementés vers le haut (Fig. 5C Supplément). Nous examinons également les niveaux d’expression de 66 gènes régulateurs d’épissage connus 31; Il existe une réglementation globale claire décroissante dans la phase NPC des échantillons MU du VCP et dans le SOD1 MU et les Fus indépendants, coïncident avec une IR Aberrant dans chaque cas (Fig. 4H).

en résumé, nous Découvrit que les programmes de transcription et de traitement d’ARN reflètent le chemin de développement MN car les voies spécifiques sont activées par étapes. Malgré les défauts post-transcriptionnels, le programme de transcription principal n’est pas interrompu pendant la différenciation MN par la mutation VCP. Cependant, une réglementation mondiale à la baisse dans l’expression des composants de l’épissure se produit de manière concomitante avec un iris aberrant dans diverses mutations provoquant la SLA.

Transcriptions IR Cytoplasmique et perte nucléaire de la protéine SFPQ

Le Gene SFPQ, membre de la famille de comportement de Drosophila, épissage humain (DBHS), code une protéine qui effectue des fonctions clés dans la transcription, l’épissage, le traitement final et la viabilité des axones 32, 33, 34, 35. Ici, Intron 9/9 de 9 Ko dans le gène SFPQ montre l’événement IR le plus important identifié lors de la neurogénèse moteur dans nos échantillons VPC MU NPC par rapport aux contreparties de contrôle. Il est important de noter que le SFPQ IR Aberrant survient également dans SOD1 MU et MU MN par rapport aux commandes (Fig. 5a, C). Nous validons la SFPQ IR et sa déréglementation dans VCP MU par rapport aux échantillons de contrôle au moyen de l’analyse QPCR de plusieurs lignes IPSC indépendantes (trois clones de trois contrôles sains et de quatre clones de deux patients atteints de mutations VCP; FIGUE. 5B et Fig. 6a supplémentaire). De plus, nous avons validé deux régulateurs communs Gus et DDX39, qui sont également fortement affectés dans la VCP MU NPC et dans SOD1 MU et MU MU MU (Fig. 6B-G supplémentaire).

BLANGINE DE LA SFPQ INTRON dans diverses formes génétiques de SLA et son interaction avec la protéine SFPQ . À gauche, des vues du navigateur de génome des profils de l’ARN-SEQ pour le gène de rétention de la SFPQ Intrgrade dans le contrôle et des échantillons de MU VCP dans les étapes IPSC, NPC et PMN. L’intron de 9 Ko 9/9 d’intérêt est indiquée par une boîte jaune. À droite, les graphiques à barres qui quantifient le pourcentage d’aller tout au long du temps dans la commande et le VCP MU (moyenne ± SD; test de comptage des pêcheurs). B Bar graphiques montrant les niveaux IR SFPQ mesurés par QPCR; Barres blanches = commandes, barres noires = VCP mu. Les niveaux d’aller à chaque point de temps ont été comparés à ceux de la phase IPSC du même groupe. N = 3 lignes de commande et n = 4 lignes VCP (support + SD * P < 0.05, ** p < 0.01, ANOVA ONE manière avec la correction Dunnet pour plusieurs comparaisons). c Bar graphics montrant le pourcentage de SFPQ IR pour FUS MU ou SOD1 Mn MN en contrôle par rapport à (moyenne ± SD; test de comptage des pêcheurs). d Bar graphiques représentent le niveau d’enrichissement dans la liaison de RBP à l’intron retenue par rapport aux introns non conservés dans le même gène; Barres bleues = Gene SFPQ, barres vertes = générosité. E – F Vue du navigateur génome des événements de réticulation de l’Eclip SFPQ le long des annotations de la transcription de SFPQ et de FUS. Les peintures grises mettent en évidence l’emplacement des introns retenus. G Bar graphics montrant le niveau de localisation nucléaire et cytoplastique des transcriptions de la route mesurée par QPCR.Les niveaux de passage de chaque fraction ont été comparés à ceux de la fraction nucléaire du contrôle IPSC. N = 3 lignes de contrôle et n = 4 lignes VCP, support + Valeur + ANOVA à double sens avec la correction de Tukey pour plusieurs comparaisons. H SPFQ Emplacement Subcellulaire déterminé par immunocytochimie dans IPSCS, NPCS et PMNS. La proportion de l’intensité moyenne de la coloration SFPQ dans le noyau (n) versus du cytoplasme (C) a été déterminée automatiquement dans les cellules MU Ctrl et VCP. Les données présentées sont le rapport N / C (± SD) par champ de vision de quatre lignes de contrôle et quatre lignes MU VCP. Valeur T-Test non associée à la correction Welch. Voir aussi Fig. 7D complémentaire

Image complète

Nous examinons les données d’encodage éclip à grande échelle de 112 RBP dans les cellules K562 et Hepg2 pour identifier les candidats qui rejoignent les introns retenus dans SFPQ et Fus 36, 37. La classification de ces RBP en raison de la proportion d’événements de réticulation dans l’intention par rapport aux introns non retenus dans le même gène a révélé que SFPQ et HNRNPM sont les Rbps la plus enrichis (Fig. 5D-F et Fig. 7a supplémentaire). Cela indique que la protéine SFPQ est directement attachée aux introns de SFPQ et FUS retenue.

Lors de la découverte de preuves d’interactions entre la protéine SFPQ et l’intron 9/9 de la SFPQ, nous essayons de comprendre la nature de cette ingérence . Les modifications de l’IR ne sont pas accompagnées d’une différence statistiquement significative dans les niveaux d’expression de gènes ou de protéines entre VCP MU et les échantillons de contrôle (Fig. 7B, C). Au lieu de cela, nous utilisons la fractionnement cytoplasmique nucléaire et identifions une abondance statistiquement plus grande de l’isoforme de la rétention de SFPQ Intron dans le cytoplasme MU de VCP par rapport aux cultures de contrôle (Figure 5 g). Ces conclusions ont conduit à l’enquête sur la distribution subcellulaire de la protéine SFPQ. Nous trouvons une perte nucléaire modeste mais statistiquement significative de la protéine SFPQ dans les cultures MU VCP (Fig. 5H).

En résumé, l’augmentation la plus significative de la traversée par VCP, Fus et Sod1 est vue dans la transcription. de SFPQ. Cette séquence d’intron est largement liée par la protéine SFPQ et les deux membres de ce complexe (c.-à-d. La transcription de la protéine et la rétention des introns) présentent une distribution cellulaire aberrante.

perte nucléaire de SFPQ à travers la famille ELA et Sporadic

Ayant établi une diminution de l’abondance nucléaire de la protéine SFPQ dans la différenciation des cultures IPSC, il a été cherché à tester la généralisation de cette découverte par le biais de modèles de page transgéniques dans les tissus vivo et les tissus humains post mortem des cas sporadiques ELA. À cette fin, nous avons examiné d’abord deux modèles transgéniques de SLA, y compris Sod1 G93A et VCP A232E. En utilisant cette approche, nous démontrons la perte nucléaire de la protéine SFPQ de la moelle épinière avec les deux mutations génétiques liées à la SLA (Fig. 6a). Par conséquent, la perte nucléaire de la protéine émerge de différentes formes génétiques de l’ELA qui est connue pour présenter une protéinopathie TDP43 (VCP MU) et celles qui ne le font pas (SOD1 MU). Notant que 90% des cas d’ELA ne sont pas familiers, nous examinons ensuite le tissu post mortem de la moelle épinière des cas ELA dans les humains sporadiques. En fait, nous démontrons une perte nucléaire surprenante de la protéine SFPQ de l’ère sporadique humaine par rapport aux tissus de contrôle normaux, qui souligne la pertinence plus large de cette découverte (Fig. 6B). À partir de ces résultats, nous arrivons à la conclusion que la perte nucléaire de la protéine SFPQ est un joint distinctif à travers divers modèles in vitro et in vivo qui représentent des SLA familières et sporadiques.

Le débogage nucléaire de SFPQ est un joint moléculaire de SLA génétique et sporadique. Analyse de l’emplacement subcellulaire de SFPQ dans Mn dans la moelle épinière ventrale de souris de type sauvage, VCP A232e et Sod1 G93A. Le cytoplasme Mn a été identifié par la coloration des discussions, les noyaux ont été contrastés avec DAPI. Les données présentées sont la proportion nucléaire / cytoplasmique (N / C) (moyenne ± SD) par cellule de trois souris SOD1 G93A et 3 VCP A232E de type sauvage. Barre d’échelle: 20 μm. P- WELCH T Valeurs de test sur un côté. Les cellules d’origine individuelles de chaque condition ont été regroupées après avoir exclu l’effet de souris individuelles en comparant des modèles linéaires complets (maladie et facteur individuel) avec des modèles linéaires réduits (maladie uniquement) à l’aide des critères d’information de Akaike. B Analyse de l’emplacement subcellulaire de SFPQ en MN dans la moelle épinière ventrale des contrôles sains et des patients atteints de Sporadic ELA (SALS).Le cytoplasme Mn a été identifié par la coloration des discussions, les noyaux ont été contrastés avec DAPI. Seul le MN avec un noyau visible a été considéré comme une analyse. Barre d’échelle 50 μm. Les données présentées sont un rapport N / C (moyenne ± SD) par cellule de trois cas par groupe

image complète

Discussion

Les objectifs de cette L’étude était double: (i) résoudre les événements de traitement d’ARN alternatifs qui sous-tendent dans les différentes étapes de la MN et (ii) la restriction des mécanismes pathogènes primaires entre des formes pathologiquement divergentes d’ELA (c’est-à-dire avec ou sans protéinopathie TDP43). Pour y parvenir, nous intégrons la différenciation dirigée des IPSC spécifiques au patient dans MN. Espinales avec séquençage d’ARN et examen bioinformatique complet. Nous montrons qu’un programme de jonction solide sous-tend le développement de MN telle que résumée à la Fig. 6a. En résolvant la nature précise des programmes post-transcriptionnels séquentiels qui sous-tendent les différentes étapes de la différenciation MN, nous révélons que l’heure de ces événements moléculaires soigneusement chorégraphiés est perturbé par la mutation VCP causée par la SLA. Lors de l’analyse des échantillons de Mn liés à des AL supplémentaires, nous montrons également que l’historique des gènes de SLA, tels que SOD1 et FUS, affectez la structure de la transcription des régulateurs d’épissures d’ARN clés de manière similaire aux objectifs du programme Aberrant Splice dans les échantillons VCP. De plus, nous montrons qu’un règlement au déclin mondial des composants de l’épissure coïncide avec des défauts d’épissage. Cette « affaiblissement » des machines d’épissage fournit une explication plausible pour l’IR Aberrant que nous trouvons dans la SLA relative à la mutation VCP, SOD1 et FUS. La transcription SFPQ présente l’intron retenue de manière significative de manière significative, à laquelle la protéine SFPQ est annulée avidement, fournissant une preuve d’une interaction directe entre la protéine et la transcription qui conserve l’intron. Nous montrons également que le relevé de rétention d’Intron SFPQ est exporté vers le cytoplasme. Cela se produit dans une plus grande mesure dans le mutant VCP qui coïncide avec le programme IR Aberrant. Cela nous a amenés à examiner l’emplacement cellulaire de la protéine SFPQ, qui a découvert sa perte nucléaire en SLA. SFPQ code un régulateur clé de la localisation et du développement axonal de l’ARNm 38. Ensemble, ces résultats constituent l’idée que la structure de transcription déréglée peut jouer un rôle clé dans la dégénérescence axonale lors du développement de l’ELA. En fait, SFPQ émerge en tant que régulateur clé de la neurodégénérescence plus largement 34, 38, 39, 40.

Changements dynamiques de ceux-ci ont été informés auparavant dans la fourrière des rongeurs entre différentes étapes du développement 41, 42 . Ici, nous avons identifié des modifications non comptabilisées auparavant dans la structure de transcription du gène qui régit le traitement et l’épissure d’ARN dans les étapes initiales de la restriction de lignage Mn humaine (Figure 7a). Nous montrons qu’un remodelage maximal de 3 ‘UTR, y compris le raccourcissement de 3’ UTR, précède d’aller. Plus précisément, il existe une variation de longueur de 3 ‘statistiquement significative qui affecte les structures de la transcription que les cellules sortent de la pluripotence pendant l’induction neuronale. Cela précède le pic d’accumulation de la transcription de rétention d’intron produit dans le schéma neural de la moelle épinière ventrale. Après cela, l’allongement progressif progressif dans 3 ‘, l’inclusion des exons de cassettes et l’épissage d’intron caractérise les phases restantes de la différenciation terminale à des MN comme précédemment représenté 1, 6.

Diagramme schématique du modèle proposé. Une caricature qui résume le parcours temporaire des événements post-transcriptionnels qui sous-tendent la neurorogenèse du moteur humain dans les échantillons de contrôle et de VCP MU. Nos résultats suggèrent que les événements de traitement d’ARN prédominants à un stade précoce de la différenciation des neurones sont IR et de remodeler 3 ‘utr. Ces événements commencent prématurément dans les échantillons de VCP MU, mais n’affectent pas les principaux programmes de transcription qui sous-tendent la différenciation du MN humain. B Caricature qui résume la conséquence fonctionnelle d’un IR Aberrant dans le gène SFPQ à travers diverses formes génétiques et sporadiques de SLA. Intron 9/9 de 9 Ko dans SFPQ est préservé dans tous les fonds mutants ALS, ce qui conduit à une plus grande abondance cytoplasmique de transcriptions affectées. La protéine SFPQ est largement attachée à l’intron retenue. La protéine SFPQ est elle-même relocalisée du noyau au cytoplasme dans tous les fonds mutants de la SLA, ainsi que dans des échantillons post-mortem de patients sporadiques avec ELA.

image complète

UTR dans 3 ‘Play Touche Fonctions dans la régulation de l’expression de gènes post-transcriptionnelle et des MRNAS exprimées dans les tissus cérébraux ont généralement une utr en 3’ plus longue en comparaison avec Autres tissus 12, 13. En fait, une allongement progressive de l’ARNA 3 ‘UTR lors du développement embryonnaire de la souris 29 est observé. Nous observons ici une variante étendue de la longueur de 3 ‘UTR lors de l’induction neuronale des IPSC humains. De manière inattendue, nous trouvons un raccourcissement transitoire de 3 ‘UTR qui précède l’allongement progressif de l’UTR 3’ précédemment signalé au cours de la différenciation des terminaux. La fonction moléculaire de ce raccourcissement reste incertaine, bien que d’autres études signalent un rôle potentiel de l’UTR 3 ‘dans la formation de parasites et la production de pluripotence 43, 44. La nature très transitoire de ce processus de réglementation peut expliquer pourquoi elle a évadé la détection expérimentale à ce jour. Notre conception expérimentale résolue dans le temps a permis l’identification de programmes de transcription séquentiels qui sous-tendent la neurorogenèse du moteur humain.

va devenir un nouveau mécanisme post-transcriptionnel qui régule l’expression de gènes. Les types de cellules neuronaux et immunitaires ont des proportions plus élevées des introns retenus par rapport aux autres tissus 7. Les études précédentes ont montré progressivement lors de la différenciation du terminal des neurones de la souris et la pertinence des transcriptions qui conservent une intron dans la régulation de gènes spécifiques de neurones liés fonctionnellement dans les modèles de souris 6, 7. Nous fournissons ici des preuves d’une augmentation transitoire des transcriptions de rétention des introns à la phase PMN qui est dirigée vers un réseau de régulateurs d’épissage. En reconnaissant l’interaction entre les événements infrarouges et les parasques nucléaires, cela soulève la possibilité que ces transcriptions contribuent à la stabilisation des parasques ou qui soient dynamiquement dans lesdites structures nucléaires pour inhiber leur fonction. Les expériences futures détermineront la stabilité et l’emplacement de telles transcriptions.

Nous démontrons que la synchronisation des programmes post-transcriptionnels est perturbée dans des échantillons avec des mutations VCP, ce qui provoque une SLA, avec prématuré et augmenté et, dans une certaine mesure, avec une variation de la longueur de 3 ‘utr. Fait intéressant, les régulateurs clés d’épissage d’ARN sélectionnés par le programme Aberrance Junction dans les échantillons de VCP MU ont également montré une large infrarouge dans le MN qui portait des mutations portuaires dans d’autres gènes provoqués par l’ALA, y compris Sod1 et Fus. En particulier, nous avons observé une expression réduite des composantes clés de l’épidosome coïncidant avec une IR Aberrant dans VCP, Sod1 et Fus. Cela correspond à une étude récente qui montre l’association entre l’IR et la réduction du recrutement de facteurs d’épissure 45. Bien que le programme conjoint aberrant dans les échantillons de Mu VCP Mu puisse être lié à la dégénérescence neuronale, l’absence de modifications des programmes de transcription associées à la neurogénèse automobenèse indique que les dysfonctionnements du traitement de l’IR et de la fin 3 »n’affectent pas le développement fondamentalement neuronal. Ces conclusions relèvent de l’hypothèse selon laquelle l’IR Aberrant représente des démonstrations subtiles d’une manière déréglée de neurones en développement, ce qui contribue éventuellement à la plus grande vulnérabilité de la maturité de la MNA.

La transcription de retenue de Intron plus significatifs via des modèles VCP MU , SOD1 MU et FUS MU IPSC étaient SFPQ, qui code une protéine qui effectue des fonctions clés de manière continue liée à l’ELA, y compris la transcription d’ARN, l’épissage, le traitement final 3 ‘et la viabilité d’Axon 32, 33, 34. Les expériences ultérieures ont montré que la transcription de retenue intrlar est plus abondante dans le cytoplasme du VCP MU par rapport aux contreparties de contrôle et coïncide avec la diminution nucléaire de la protéine SFPQ. Nous constatons également que la protéine SFPQ est largement attachée à son intron retenu. L’autorégulation entre les protéines de liaison d’ARN (PRB) (par exemple, TDP43) est comptabilisée et, par conséquent, cette constatation est compatible avec la littérature précédente 46, 47. De manière cruciale, nous trouvons la perte nucléaire de la protéine SFPQ sur les deux modèles transgéniques de VCP SOD1 et de la souris et dans le cordon sporadique sporadique sporadique sporadique, suggérant que cela représente un joint moléculaire de la SLA. Par conséquent, nous proposons que l’interaction entre la protéine SFPQ et sa transcription conserve l’intron impose sa co-localisation aberrante dans le cytoplasme (Fig. 7B).L’abondance réduite de la protéine du SFPQ nucléaire peut affecter l’épissure avant l’ARNm, qui pourrait contribuer aux défauts post-transcriptionnels que nous et d’autres personnes identifiées dans la SLA 48, 49. Pris ensemble, nous constatons que l’IR dans la transcription de SFPQ et la perte nucléaire de la protéine SFPQ sont des caractéristiques moléculaires communes de diverses formes génétiques et sporadiques de la SLA.

Déclaration d’éthique

Le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients et contrôles en bonne santé dans cette étude. Tous les protocoles expérimentaux ont été réalisés conformément aux règles et directives approuvées par le Comité national de la recherche d’éthique de la neurologie nationale et de la neurochirurgie de l’UCLH et de l’Institut de neurologie de l’UCL (09/0272).

Dérivation des fibroblastes humains et IPSC

Les fibroblastes dermiques ont été cultivés dans Optimem + FCS à 10%. Les plasmides épisomaux suivants ont été transfectés pour la génération IPSC: PCXLE HOCT4 SHP53, PCXLE HSK et PCXLE HUL (AddNGENE), comme indiqué précédemment. Les détails des lignes utilisées dans cette étude sont fournis dans le tableau complémentaire 1. Deux des lignes de commande utilisées (contrôle 2 et Control 3) sont disponibles dans le commerce et achetées auprès de Corell (numéro de catalogue ND418666 * C) et Thermofisher Scientific (Cat Non . Nombre A18945), respectivement.

Culture cellulaire

Les PSC induites ont été maintenues dans Geltrex (Technologies de la vie) avec un médium essentiel (Technologies de la vie) et ils ont passé en utilisant EDTA (Technologies de la vie , 0, 5 mm). Toutes les cultures cellulaires ont été maintenues à 37 ° C et 5% de dioxyde de carbone.

Différenciation du neuron moteur

Mn Différenciation a été réalisée à l’aide d’une version adaptée d’un protocole 19 publié précédemment. En bref, les IPSCS diffèrent pour la première fois dans NurePithélium en plaquant à 100% de confluence à un milieu défini chimiquement constitué de DMEM / F12 glutamax, de neurobasal, de l-glutamine, de supplément N2, d’acides aminés non essentiels, de complément de B27, β- mercaptoétanol (toutes les technologies de la vie) et l’insuline (Sigma). Le traitement avec de petites molécules du jour de 0 à 7 était la suivante: Dorsomorphine 1 μm (Millipore), SB431542 2 μm (ToCris Bioscience) et Chi99021 3, 3 μm (Miltenyi Biotec). Le jour 8, la couche NurePithéliale a été dissoute enzymatiquement à l’aide de la dispute (Gibco, 1 mg ml-1), a été placée dans des feuilles revêtues de la laminine, puis modélisée pendant 7 jours avec de l’acide rétinoïque 0, 5 μm et une purmorfamine de 1 μm. Le jour 14, les précurseurs de la moelle épinière Mn ont été traités avec de la purmorfamine 0, 1 μm pendant 4 jours de plus avant de différencier de manière terminale pendant

10 jours dans le composé E 0, 1 μm (Enzo Life Sciences) pour promouvoir la sortie du cycle cellulaire. Aux points de temps pertinents, les cellules ont été recueillies pour une extraction d’ARN ou ont été fixées dans 4% paraformaldéhyde pour Immunomarcaje.

Extraction d’ARN et de séquençage

Le kit de cellules d’ARN simples de Promega Maxwell RSC qui comprend le traitement avec Adnasa, ainsi que l’instrument Maxwell RSC, a été utilisé pour les extractions d’ARN. Pour les validations de QPCR, l’ARN a été extraite avec le kit RNeasy Plus Mini (QIAGEN). Le Nanodrop a été utilisé pour évaluer la concentration de l’ARN et le rapport 260/280, et le bioanalyseur Agilent a été utilisé pour évaluer la qualité. Les scores d’intégrité d’ARN (RIN) étaient > 8 pour tous les échantillons utilisés dans ce travail. Les bibliothèques RNaseQ ont été préparées à l’aide du kit ARNm tressé Trusq (Illumina) avec une entrée de 1 μg de Poly (A) + ARN. Ensuite, les produits ont été purifiés et enrichis avec une amplification PCR pour créer les bibliothèques finales de l’ADNc. Des bibliothèques ont été envoyées pour un séquençage à haute performance, ont été exécutées pour 75 cycles dans une cellule à flux rapide, dans l’installation centrale de NGS de l’Institut de neurologie à l’aide du HISEQ2500. Pour l’analyse des transcrits nucléaires et cytoplasmiques, le kit de purification de l’ARN cytoplasmique et nucléaire (Norgen Biotek Corp) a été utilisé.

Les données de séquençage d’ARN

lectures d’ARN ont été obtenues d’une seule séquence de 50 pb de cinq étapes autres que la différenciation MN des échantillons de contrôle et VCP MU (IPSC et les jours 7, 14, 21 et 35); Les échantillons sont répertoriés dans les données supplémentaires 1. Le numéro d’accès d’expression génique omnibus (GEO) pour les bibliothèques RNA-SEQ est GSE98290.Nous avons également obtenu des lectures de séquençage d’ARN à extrémité simple et jumelée dérivé de deux études indépendantes de la différenciation neuronale in vitrine des HESCS (GSE20301 22 et GSE86985 23); Deux études indépendantes sur les formes familiales de la SLA, soit causées par des échantillons DOD1A4V de N = 5; 2 dérivés par le patient et 3 Sod1a4V et 3 échantillons de Mn de commande d’isogène lorsque la mutation a été corrigée; HB9 FACS FACS purifiée MNS, GSE54409 27 ou FUS (N = 6; 3 FUS R521G Dérive du patient et 3 Contrôles de frère sain MNS, GSE77702 28; Deux données ARN-SEQ de l’ESC humain partagé par MIHA MODIC; Deux SPMN FOTAL (E-MTAB-3871; Consortium de cartographie de la feuille de route NIH) et SPMN adulte (laser Échantillons SPMN; SPMNCapturé 53) Échantillons.

Données d’expression Pré-traitement

Les lectures à une seule et jumelée pour chacune de l’étude ont été initialement alignées sur des séquences d’ARN ribosomales pour filtrer les lectures Cela peut provenir de la contamination de l’ARN ribosomal à l’aide de Bowtie2 (-v 0) 57. Les lectures restantes ont été alignées sur le génome humain (H19) à l’aide de l’aligneur sensible à l’épissure TOPHAT2 58 avec des paramètres par défaut. Toutes les bibliothèques générées dans cette étude avaient < 1% d’ARNr, échoué à 90% et > 70% exon IC lit.

Quantification du gène et caractérisation non supervisée de l’ensemble de données

La quantification absolue des gènes a été réalisée à l’aide du nombre HTSEQ 59. L’analyse ultérieure a été réalisée avec la version 3.3.1 (2016) et les bibliothèques bioconductrices version 3.3 (R: une langue et un environnement pour l’informatique statistique. Vienne, Autriche: R Fondation pour l’informatique statistique; 2013).

Avant d’analyser la clustering non supervisée des 31 échantillons de différenciation MN, nous avons identifié des gènes exprimés de manière fiable pour chaque état (VCP MU ou contrôle aux jours 0, 7, 14, 21 et 35). Pour un échantillon donné, l’histogramme du nombre de gènes de log2 est généralement bimodal, avec les modes correspondant à des gènes non exprimés et exprimés. Des gènes exprimés de manière fiable ont été identifiés en ajustant un mélange gaussien à deux composants aux données de gènes de comptage estimées de Log2 avec r package McCust 60. Un gène a été considéré comme exprimé de manière fiable dans une condition donnée si la probabilité qu’il appartenant à la classe non exprimée était inférieure à 1% dans chaque échantillon appartenant à la condition. 15, 989 gènes ont été sélectionnés sur la base de leur expression détectée dans au moins une des 10 conditions (c.-à-d. Cinq timbres différents de la restriction de lignée pour le contrôle et le VCP MU). Ensuite, nous n’avons normalisé les colonnes de la matrice de comptage de gènes avec r package Limma 61. La grappe hiérarchique non supervisée de la matrice de comptage de gènes filtrée et normalisée a été réalisée avec la corrélation de rang de Spearman comme mesure de distance et algorithme de clustering complet.

Nous avons effectué SVD de l’expression des 15, 989 gènes sur les cinq étapes distinctes de la différenciation MN des contrôles sains et du VCP mu. Nous avons ensuite sélectionné les composants capturer au maximum la variance dans l’expression de gènes. Pour visualiser les vecteurs singuliers droit \ (\ \ gauches \ {{\ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ _k} \ droite \} \), nous avons tracé l’expression sur l’axe vertical en fonction du temps correspondant à chaque échantillon sur l’axe horizontal et à colorier tout Les échantillons correspondant à des contrôles sains gris et ceux correspondants à VCPMU à Magenta. Nous avons ensuite identifié des gènes dont les profils d’expression corrélés (corrélation Pearson entre le profil d’expression de gène individuel et les vecteurs singuliers droit) et ont contribué (projection de chaque profil d’expression de gène sur les vecteurs singuliers droit), le plus fortement ou négativement) avec le profil d’expression de la vecteurs singuliers. Afin d’identifier les gènes représentatifs de chaque vecteur singulier, les gènes ont été classés en fonction des scores de projection et de corrélation. Les scores les plus élevés (les plus positifs de la projection et de la corrélation) et les plus basses (des scores les plus négatifs dans la corrélation et la projection) ont été sélectionnés pour chaque vecteur singulier à l’aide de la cluster de K-Moyenne pour l’analyse de l’enrichissement en aval.

Analyse d’APA de APA de ARN-SEQ

pour l’identification de l’identification d’une alternative 3 ‘UTR de l’ARN-SEQ, une couverture bloquée de niveau de nucléotide a été obtenue pour chacun des 31 échantillons utilisant Genomecov à partir de la suite de BedTools Suite 62. Les régions suivantes transcrivantes continuellement ont été identifiées à l’aide d’une fenêtre coulissante sur le génome nécessitant une couverture minimale de sept lectures dans plus de 80 positions par fenêtre de 100 pb; Les régions voisines séparées par des régions peuplables ont été fusionnées comme décrit précédemment 13. Des fragments exprimés ont ensuite été associés à un utr de 3 ‘qui se chevauchent à l’aide des dernières versions HG19 Ensembl V75 63.Les régions exprimées isolées qui ne se sont pas chevauchées avec aucune fonctionnalité ont été encore associées au 3 ‘UTR le plus proche si (1) la caractéristique annotée la plus proche n’était qu’un UTR de 3’ (2) si le brin de la région exprimée était aligné avec le Strand du plus proche 3 ‘Utr, et (3) si la distance à l’UTR de 3’ était inférieure à 10’000 Ko, qui est la gamme de distance intragenic. Les utrs de 3 ‘étendus résultants ont été soumis à un filtrage étendu pour exclure la transcription intragénique potentielle, se chevaucher des transcripties et les introns retenus comme décrit précédemment 13. Nous avons finalement intersecté le plus long segment UTR d’Utr avec des données ARN-SEQ avec une annotation de site poly (a) de site intégrée à l’aide de lectures à partir de bibliothèques de séquençage de 3’-fines dans des échantillons humains 64 pour obtenir un poly de putatif (A) dans le plus long segment UTR 3 ‘ de chaque transcription.

Nous avons ensuite utilisé le nombre de lectures mappées à -300 NT Région terminale de chaque isoforms de 3 ‘UTR en tant que proxy pour le niveau d’expression ISOforme de 3’ UTR pour identifier les modifications de l’utilisation de l’utilisation proximale. et des sites poly (a) distal. La densité des lectures mappées en -300 NT Région de terminal de 3 ‘d’utr Isoform est bimodale, avec un pic à faible densité correspondant probablement à la transcription d’arrière-plan, c’est-à-dire 3’ utr isoformes d’une faible abondance ou 3 ‘isoformes d’utr sur lesquels se produisent des lisions étaient fausses, et un pic à haute densité correspondant à des isoformes d’utr de 3 ‘exprimés. Afin d’identifier des isoformes d’utr de 3 ‘exprimés de manière fiable dans l’étude, un mélange gaussien à deux composants a été monté sur les données à l’aide du package R McCust 60; Un isoforme s’appelait de manière fiable si dans les deux réplicats comportait moins de 1% de chances d’appartenir à la catégorie de fond.

afin d’identifier les transcriptions qui montrent un changement marqué de l’utilisation du site poly (a) entre les conditions , nous avons marqué les différences d’utilisation du site Poly (A) proximal à distal (A) en utilisant les deux scores suivants:

\ \ (S_1 = {\ mathrm {journal}} _ 2 \ gauche ({\ frac {{ I _ {\ mathrm {proximal}}}} {{i _ {\ mathrm {distal}}}}} \ droite) _ {\ mathrm {cond1}} – {\ mathrm {journal}} _ 2 \ gauche ({\ frac { {I _ \ \ mathrm {proximal}}}} {{i _ {\ mathrm {istal}}}}} \ droite) _ {\ mathrm {cond2}} \)

\ (s_2 = \ frac {{I _ \ \ mathrm {proximal}}}} {{i _ {\ mathrm {proximal}} + i _ {\ mathrm {distal}}}} _ {\ mathrm {cond1}} – \ frac {{i _ {\ mathrm {proximal}}}} {{i _ {\ mathrm {proximal}} + i _ {\ mathrm {distal}}}} _ {\ mathrm {cond2}} \ in \ gest \)

La statistique La signification des modifications du rapport de site poly (A) proximal à distal (A) entre deux conditions a été évaluée par le test de comptage exact de Fisher à l’aide de rapports de lecture bruts résumés de promoteur-proximal VERSU s Promateur-distal 3 ‘utr isoformes originaires des conditions. Nous avons ajusté le contrôle de p -Value pour un faux taux de découverte (FDR) de 0,01. Nous avons limité notre analyse sur les transcriptions ENSEMBL contenant au moins deux UTRS 3 ‘générées par la polyadénylation tandem exprimée dans des conditions d’intérêt. Les décalages proximaux ont ensuite été sélectionnés lorsque \ (S_1 \ LE – 1 \), \ (S_2 \ LE – 15 \% \) et FDR < 0,01; Le décalage distal a été sélectionné lorsqu’il est sélectionné lorsque \ (S_1 \ GE 1 \), \ (S_2 \ GE 15 \% \) et FDR < 0.01.

Épissage Analyse

L’identification de toutes les classes d’événements de différenciation MN a été réalisée avec les vastes outils de pipeline ARN-SEQ 21. Pour un événement comme étant considéré comme réglementé différentiellement entre deux conditions, nous avons nécessité une moyenne minimale ΔPSI (entre les réplicats appariés) d’au moins 10% et que le transcrit ciblé par l’événement d’épissage en question doit être exprimé de manière fiable dans tous les échantillons de la Conditions comparées, c’est-à-dire une couverture de lecture suffisante dans tous les échantillons d’intérêt. Nous avons ensuite effectué une visionneuse intégrative génomique (IGV) -Guided manuée une commission manuelle pour éliminer la faible couverture IR obtenant 167 événements IR de confiance élevée. L’analyse ciblée IR a ensuite été effectuée sur ces 167 événements IR pour lesquels un pourcentage d’IR a été calculé car la fraction du mappage d’intron se lit au nombre moyen de mappage de lecture aux exontions adjacentes de 5 ‘et 3’ normalisées à la longueur du Intron et exons respectifs. Un test de comptage de pêche p -Value a été obtenu lors du test d’IR différentiel entre les conditions.

Análisis Différencial de la expresión Génica.

pour l’analyse de l’expression de génique différentielle Nous avons couru Kallisto 54 et Slituth 55. Kallisto a été utilisé pour (1) Construire un index de transcription de la transcriptome de Sapiens Ensembl Grc38 85 (-K 31), (2) pseudo-align sur l’ARN-SEQ se lit sur le transcriptome et (3) quantifier les abondances de transcription (-B 100-single -l 275 -S 50-RF-brin). Nous avons ensuite identifié les gènes différentiellement exprimés différentiellement avec STUTUH. L’analyse ultérieure a été effectuée avec la version 3.3.1 (2016) et des bibliothèques bioconducteurs version 3.3 (R: une langue et un environnement pour l’informatique statistique. Vienne, Autriche: R Fondation pour l’informatique statistique; 2013). Avant de sélectionner des gènes exprimés de manière différentielle, nous avons identifié des gènes exprimés de manière fiable.Kallisto génère une abondance de la transcription, et nous avons donc calculé l’abondance de gènes en résumant le nombre brut estimé des isoformes constitutifs pour obtenir une valeur unique par gène. Pour un échantillon donné, l’histogramme du nombre de gènes / transcript log2 est généralement bimodal, avec les modes correspondant à des gènes non exprimés et exprimés. Les gènes / transcrits exprimés de manière fiable ont été identifiés ensuite en ajustant un mélange gaussien à deux composants sur le relevé de compression de comptage estimée de log2 et des données gènes r avec le package McCust 60; Un pseudocompte de 1 a été ajouté avant la transformation de Log2. Un gène a été considéré comme exprimé de manière fiable dans une condition donnée si la probabilité d’appartenance à la classe exprimée était supérieure à 0,1 dans chaque échantillon appartenant à la maladie. Enfin, les gènes qui montraient une expression différentielle à double journal et un p -value < 0,05, et qui ont été exprimés de manière fiable dans des conditions de mutant ou de contrôle VCP ont été considérables de manière significative.

Go Enrichment Analysis

Go Analyse d’enrichissement a été réalisée à l’aide du test de Fisher Classic avec le package Bioconducteur Topgo 65. Seuls les termes allant contenant au moins 10 gènes annotés ont été pris en compte. A p -Value de 0,05 a été utilisé comme niveau de signification. Sur les figures, les termes de haut niveau significatifs ont été sélectionnés manuellement en supprimant les termes et les termes de GO redondants qui contiennent moins de cinq gènes significatifs.

análisis de rouge

Information d’interaction de protéines expérimentales a Était extrait de la base de données des chaînes 66 et visualisée dans CyCapape 67, 68.

Mappage des données ECLIP

Les données ECLIP brutes ont été téléchargées à partir de EnCode 36, 37. Avant l’alignement, la suppression de l’adaptateur en deux étapes a été réalisée à l’aide de CutaDAPT selon la procédure d’exploitation standard de l’écle de code ECLIP. Une approche en deux étapes a également été utilisée pour l’alignement. Premièrement, Bowtie2 a été utilisé pour éliminer les lectures d’alignement de l’ARNr ou de la TRNA. Ensuite, l’étoile a été utilisée pour aligner les lectures restantes à Grch38, avec uniquement des lectures de cartographie uniquement retenues. Les doublons de PCR ont été effondrés en fonction des identifiants moléculaires et des emplacements de cartographie uniques. La position de réticulation de la résolution de nucléotide a été calculée comme la coordonnée précédant immédiatement l’événement de troncature de la transcription inverse.

Transcription inverse, Validation QPCR et IR

La transcription inverse a été réalisée à l’aide du premier brin d’aide à l’aide. Kit de synthèse d’ADNc (thermofiseur scientifique) utilisant 1 μg d’ARN total et hexamères aléatoires. Le QPCR a été réalisé à l’aide du système Master Vert Powerup Sybr Green (Thermofisher Scientific) et du système Agilent MX3000P QPCR ou du système PCR de QuantiStudio 6 Flex 6 Flex (biosystèmes appliqués). Les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 2. L’amplification spécifique a été déterminée par analyse de la courbe de fusion et électrophorèse sur gel d’agarose des produits PCR. Les paires d’apprêt avec une efficacité de 90 à 12% ont été utilisées. Pour chaque validation infrarouge à l’écran, trois paires d’amorces ont été utilisées: (1) la paire d’amorçage F1 R1 (épargnée d’intron, à travers une jonction exon-exon) a été utilisée pour analyser les niveaux d’expression des gènes; (2) paire d’amorçage F2 R2 (une amorce sur un exon flanquant l’intron à analyser, l’autre sur l’intron) a été utilisée pour évaluer les niveaux d’IR; et (3) la paire d’amorçage F3 R2 (les deux amorces des exons flanquant l’intron d’intérêt, si possible conçus sur la jonction exon-exon) a été utilisée pour mesurer les niveaux de la transcription épissée. Les échantillons RT-Minus ont été utilisés comme contrôles négatifs. Les niveaux d’IR (paire d’apprêt F2R2) ont été normalisés sur le niveau d’expression de chaque gène individuel (paire d’amorçage F1R1). Les niveaux d’expression génique ont été mesurés à l’aide de la méthode DDCT à l’aide de trois gènes de ménage (GAPDH, POLR2B et UBE2D3).

Análisis del Ciclo Celular

L’analyse de cycle de cellule a été effectuée par cytométrie de flux selon protocoles standard. En bref, les cellules ont été dissociées à l’aide de l’accutase ou de la trypsine (technologies de la vie), lavées et fixées en suspension utilisant 70% d’éthanol froid. Les cellules ont été teintées à l’aide de l’iodure de propidium (PI, 50 μg ML -1, Sigma Aldrich) en présence de RNase A (10 μg / ml, Sigma Aldrich). Les cellules ont été analysées à l’aide d’un BD FACS Calibur (BD Biosciences). Les doublets ont été exclus des analyses et 10 000 événements ont été collectés dans la porte à cellule unique par échantillon. Les données de cycle de cellules ont été analysées à l’aide du module multicyclet de FCS Express 6 (logiciel de novo).

animaux, modèles transgéniques et traitement des tissus

Tous les expériences animales décrites dans cette étude ont été portées Sous la licence du Bureau à domicile britannique et a été approuvée par le comité d’examen éthique de l’Institut de neurologie. Les lignes de souris transgéniques suivantes ont été utilisées: (1) Sod1 G93A souris (B6SJL-TG (SOD1 * G93A) 1GUR / J, Jackson Laboratories) (2) SUPPRESSIONS Mutant humain VCPA232E a été généré par J. Paul Taylor et al, St Hôpital de recherche pour enfants Jude, Memphis, TN, États-Unis et sont décrits dans Custer et al, 2010 69 et élevés à l’arrière-plan Noir 6 (C57 / B6) de type Wild-type C57.Fond mixte C56BL / 6-SJL de type sauvage (laboratoires Jackson) ont été utilisés comme contrôle. Pour la collecte des tissus, des animaux ont été injectés avec une anesthésie terminale (pentobarbital sodique, euthatal) et ont été perfusés de manière transcardique avec 4% de paraformaldéhyde. La région lombaire de la moelle épinière a été retirée et post-fixée avec 4% de paraformaldéhyde et cryoprotégé pendant une nuit avec 30% de saccharose; Les cryosections transversales série de 10 ou 20 μm ont été coupées pour la coloration de l’immunofluorescence.

Tissu post-mortem humain

Sections de tissu convergées dérivées de la moelle épinière lombaire de trois ans et de sexe Sporadic SLA Patients, Durée de la maladie 1, 2 et 2 ans, respectivement et les sujets de contrôle de trois ans et de sexe sans antécédents de maladie neurologique (n = 3 patients et 9 sections; moyens d’âge: 68 + 6,55 et 69,5 + 2,12 ans ; Voir Tableau supplémentaire 3). La mort des délais de retard de congélation était également comparable entre les groupes (retard: 25 + 5,29 et 29,33 + 9,29 h, pour les patients atteints de contrôle et de sels, respectivement). Les échantillons de la moelle épinière ont été obtenus auprès de la banque de tissus Neuroresource, UCL Institute of Neurology, London, Royaume-Uni. Les échantillons ont été donnés à la banque de tissus avec un donateur de tissu écrit le consentement éclairé à la suite d’une révision éthique par le comité NHS NRES Londres-Central et stocké sous une licence du secteur de la recherche de l’Autorité du tissu humain britannique (HTA).

Immunolabellation et Imagerie

pour immunocytochimie et immunohistochimie, des échantillons ont été bloqués dans 10% de sérum de chèvre normal (NGS) ou à 10% de sérum d’âne normal (NDS), selon le cas et perméabilisé dans 0,3% Triton X-100 (Sigma-Aldrich; dans le PBS) à la température ambiante (RT) pendant 1 heure. L’immunomabilisation a été réalisée avec des anticorps primaires dans les NGS (5%) et TRITON X-100 (0,1% dans du PBS) à 4 ° C pendant la nuit suivi des anticorps secondaires spécifiques à une espèce pendant 1 h à RT et DAPI Counter Stun (100 ng / ml) pendant 10 min à RT. Pour les échantillons humains post-mortem, la fixation et la perméabilisation dans le méthanol froid (-20 ° C, 20 min) ont été effectuées avant l’immunoménagement. Les anticorps primaires ont été dilués comme suit: Lapin anti-olig2 (Millipore, AB9610) 1: 200; souris anti-SMI32 (Bioscience de Cambridge, SMI-32R-500) 1: 1000; Chèvre Anti Chat (Millipore, AB144P) 1: 100; lapin anti-pax6 (biolegend, 901301) 1: 300; Souris et lapin anti-SFPQ (ABCAM, AB11825 et AB38148, respectivement) 1: 100; Souris et lapin anti-bêta-tubuliniiiiiiiii (Biolegend, 801201), souris anti-LIM3 (DSHB, 67.4e12) 1:50; Poulet anti NKX2.2 (DSHB, 74.5A5) 1:50. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal à balayage de 710 laser (Zeiss) ou du système de dépistage haute teneur en phénix de l’opéra (Perkin Elmer). Pour l’analyse d’image, les Fidji ou le système d’analyse d’image Columbus (Perkin Elmer) ont été utilisés.

Western Blotting

Western Blott a été effectué conformément aux protocoles standard (Biorad). Les lysats de cellules entières ont été obtenus à partir de granulés de cellules congelées à l’aide de la mémoire tampon de lyse de LISY-M EDTA complet (Roche). La concentration en protéines a été déterminée par Pierce BCA test (Thermofisher Scientific) et utilisée pour maximiser la charge égale sur les gels (~ 9 μg par voie). L’électrophorèse a été exécutée sur un gel de protéine critère de 4 à 12% ™ XT BIS-tris (Biorad) à une tension constante (200 V, une heure) et suivi d’un transfert de protéines à une membrane de nitrocellulose (Biorad). Le blocage a été effectué dans du PBS, 0,1% entre la poudre de lait sec à 5% (merveille) à RT pendant une heure, suivie d’une incubation d’anticorps primaire pendant une nuit à 4 ° C. Les anticorps primaires ont été dilués dans du PBS, à 0,1% entre la poudre de lait sec de 5% comme suit: Souris anti-SFPQ (abcam, AB11825) 1: 250; Lapin anti-TLS / FUS (ABCAM, AB84078) 1: 500; Rabbit Anti DDX39 (Sigma Aldrich, SAB2700315) 1: 500, Rabbit Anti Dars (ABCAM, AB182157) 1: 1000; souris anti-GLN1 (Antibodries-Online, AA 1-373) 1: 1000; lapin anti-TDP-43 (abcam, ab133547) 1:10 000; Mouse Anti Gapdh (Technologies de la vie, Clone 6C5, AM43000) 1: 5000. Pour des membranes de détection, des membranes de détection ont été incubées avec des anticorps fluorescents infrarourés spécifiques à l’espèce (Irdye, Licor) pendant une heure à RT et imagé à l’aide d’un système d’imagerie FC Odyssey FC (licor).

Disponibilidad de DATOS

Le numéro d’accession géographique des bibliothèques nouvellement générées de l’ARN-SEQ est GSE98290 (//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE98290). Nous avons également obtenu des lectures de séquençage d’ARN à extrémité simple et jumelée dérivé de deux études indépendantes de la différenciation neuronale in vitrine des HESCS (GSE20301 22 et GSE86985 23); Deux études indépendantes sur les formes familiales de la SLA, soit causées par des échantillons DOD1A4V de N = 5; 2 dérivés par le patient et 3 Sod1a4V et 3 échantillons de Mn de commande d’isogène lorsque la mutation a été corrigée; HB9 FACS FACS purifiée MNS, GSE54409 27 ou FUS (N = 6; 3 FUS R521G et 3 contrôleurs de frère sains du patient MNS, GSE77702 28; Deux données ARN-SEQ de l’ESC humain partagé par MIHA MODIC; Deux SPMN FOTAL (E-MTAB-3871GENE EXPRESSEMENT OMNIBUS; Consortium de cartographie de la feuille de route NIH; // www .ebi.ac.Royaume-Uni / Arrayexpress / Expériments / E-MTAB-3871 /) et SPMN adulte (SPMN capturé laser; GSE76514 52, 53) Échantillons. Des informations supplémentaires et des demandes de ressources et de réactifs devraient être adressées à et seront remplies par le contact principal, Rickie Patani ().

Expresiones de Gratitud

Les auteurs souhaitent remercier les patients pour les dons de fibroblastes. Nous remercions également MIHA MODIC pour partager les données HESC ARN-SEQ, Martina Hallegger et Roberto Simone pour leur entrée concernant la conception d’amorce, Anob M Chakrabarti pour le partage de fichiers de lit de données ECLIP alignées. Nous remercions Benjamin Clarke, Mhoriam Ahmed et membres des laboratoires de Schiavo et de Greensmith pour un soutien technique précieux. Nous remercions Selina Wray pour avoir gentiment l’accès aux lignes VCP Mutant IPSC. Ces travaux ont été soutenus par l’Institut Francis Crick, qui reçoit son financement fondamental de la recherche sur le cancer du Royaume-Uni (FC010110), le Conseil de recherche médicale britannique (FC010110) et la fiducie Wellcome (FC010110). Nous remercions le financement Wellcome Fiducie à RP, à NML et à JU, un prix de l’infrastructure de bioinformatique médicale MRC Emedlab à NML (MR / L016311 / 1), le Prix de la CLIC Grand défis (CEH), une bourse de recherche de Marie Curie post-doctorant (657749- NeurouTRR) et une bourse de mobilité postdoc avancée de la Swiss National Science Foundation (P300PA_174461) à RLNML est un chef de groupe de Winton en reconnaissance du soutien de la Fondation de bienfaisance de Winton à la création de l’Institut Francis Crick. Nous reconnaissons la plate-forme DPUK / MRC pour la fourniture de l’opéra Phenix pour une analyse IPSC à haut débit et un soutien généreux de l’Institut national de la recherche sur la santé de l’Université de recherche de l’Université des hôpitaux de Londres Centre de recherche biomédical.

Matériel Suplément Electrono.

1. información SuplémentAria

Description des ARCHIVOS SUPPLEMENTAIOS ADICIONALES

2. DATOS SUPLENTAIOS 1