Introduzione
Le malattie infettive coinvolgono uno dei maggiori problemi di salute, causando una grande morbilità e raggiungendo livelli di milioni di persone colpite ogni anno. L’aumento dei viaggi, i cambiamenti demografici e le resistenze antimicrobiche contribuiscono in modo significativo a questo fenomeno. Il trattamento delle malattie infettive si basa su una prima diagnosi seguita dalla somministrazione del farmaco corrispondente.
La maggior parte delle malattie infettive sono la conseguenza di una rete complessa di interazioni che possono comportare centinaia di migliaia di fattori, sia da il patogeno e l’host. Per ottenere una migliore comprensione dei processi di malattie infettive, è essenziale effettuare studi traslazionali e multidisciplinari in cui sono integrate la collaborazione del personale coinvolto nelle diverse aree di lavoro.
Le analisi più esaurienti eseguite Per quanto riguarda la ricerca dei biomarcatori e dei nuovi obiettivi per droghe e vaccini sono stati fatti da studi in genomica e trascrittomica. Negli ultimi decenni, il numero di studi proteomici in malattie infettive e per tutta la portata clinica per la ricerca di biomarcatori e nuovi obiettivi per vaccinazione e droga sono aumentati in modo significativo.
Il sequenziamento del genoma microbico ha rivoluzionato lo studio dei patogeni , non solo a livello di microbiologia di base, ma anche in diagnosi, epidemiologia, fisiopatologia, trattamento delle malattie e dello sviluppo del vaccino. Inoltre, il sequenziamento del genoma microbico ha permesso lo studio della sua proteina. Il primo genoma sequenziato è stato il Virus di Epstein-Barr (1984), 170kbs2, e un decennio più tardi, nel 1995, il genoma del batterio gramnegativo hamophilus influenzae, di 1,8 MB3.
Molti studi erano basati su L’analisi dei geni espressa in diversi tipi di cellule e tessuti in diversi contesti fisiologici, principalmente mediante un’analisi dell’RNA Messenger (MRNA), senza spesso esistendo una correlazione diretta tra il contenuto in mRNA e il contenuto proteico. La mancanza di correlazione tra i livelli di proteina ARNM è dovuta al fatto che l’assieme proteico prodotto da una determinata quantità di mRNA dipende dallo stato fisiologico della cella4. Un esempio di questa assenza di correlazione tra Transcriptomic (MRNA) e Proteomics (Protein) è dimostrato al lavoro di Franco et al.5, dove vengono confrontati due ceppi di Helicobacter Pylori, un genitore cancerogeno e non cancerogeno. Le analisi in mRNA hanno mostrato differenze tra entrambi i ceppi, mentre a livello di proteina questi ceppi erano differenziabili.
Proteomics è considerato il prossimo passo nello studio di un sistema biologico, dopo la genomica e la trascrizione. La complessità degli studi proteomici è maggiore, dal momento che il genoma di un organismo è statico, mentre il protetto differisce da una cella a un’altra e tra stati. Il termine Proteoma6, definito da Marc Wilkins nel 1994, è un’immagine dinamica di tutte le proteine espresse da un particolare organismo, cella o scomparto subcellulare, in un dato momento e in determinate condizioni, costituisce la mappa di espressione proteica di una cellula, il tessuto o indicato organismo. Un ulteriore fattore di complessità è le modifiche che la struttura di base o la sequenza della proteina (ad esempio, la lavorazione proteolitica) e le modifiche post-translational (PTM), che servono a modificare o modulare l’attività, la funzione o la posizione di una proteina in diversa fisiologica o Contesti metabolici. Infine, un altro fattore di complessità è il chiaro di luna o la multifunzionalità, in cui la stessa proteina può eseguire varie funzioni7.
Proteomics, un termine anche coniato da Wilkins, è un nuovo approccio nello studio delle proteine che si è evoluta in Anni ultimi grazie all’integrazione delle tecnologie come metodi di separazione delle proteine ad alte prestazioni, della spettrometria di massa (MS) e, soprattutto, gli strumenti in bioinformatica che hanno permesso l’analisi di un grande volume di dati. Grazie alla sua applicabilità, la proteomica consente non solo di identificare le proteine, ma anche categorizzarle e classificarle come la loro funzione e le loro interazioni.
Il campo di studio della proteomica è davvero ampio, ma possiamo raggrupparlo in 3 sottogruppi: a) Proteomica dell’espressione, il cui obiettivo è identificare le proteine presenti nel campione e ottenere tutte le informazioni su abbondanza, PTM e posizione subcellulare; b) Proteomica strutturale, che consente l’ottenimento della struttura tridimensionale delle proteine funzionali e C), il cui scopo è quello di scoprire la funzione delle proteine e conoscere le interazioni che possono fare.
Proteomic Tecniche che offrono un nuovo approccio e potente per la diagnosi di agenti patogeni, tiro di focolai, dinamiche patogeni-host, controllo della malattia e sviluppo di droghe e vaccini.
La presente revisione è finalizzata a mostrare l’ampia varietà di Tecniche e applicazioni disponibili nel campo della proteomica rivolta allo studio delle malattie infettive.
Metodologie proteomiche
Le tecniche proteomiche coinvolgono molte metodologie sperimentali, come elettroforesi 2-dimensionali (2DE), cromatografia liquida (LC e MS. La combinazione di queste tecniche con una successiva analisi bioinformatica viene utilizzata per lo studio proteico di un’ampia varietà di organismi. Queste tecniche sono potenzialmente preziose, sebbene ci siano complessità in campioni che possono influire sulla loro analisi e interpretazione, come il grado di PTM, la gamma dinamica dell’espressione (ad esempio l’abbondanza di albumina nelle proteine delle minoranza delle maschere plasmatiche) e dei problemi di rilevamento delle proteine associati Con Membrane8.
Il più grande ostacolo per progredire nel settore della proteomica è la difficoltà nella raccolta di agenti patogeni in vivo in abbondanza sufficiente e adeguatamente per le analisi proteomiche. Anche essendo queste condizioni adatte agli studi di espressione di proteine nei microrganismi patogeni, ci sono casi in cui non può essere eseguito e la cultura axenica (in vitro) diventa l’opzione migliore. La moltitudine di agenti patogeni è stata analizzata utilizzando tecniche proteomiche in condizioni in vitro. Questi studi consentono di conoscere la grandezza dell’espressione proteica e avere un’idea globale del loro protetto. Basandosi esclusivamente sullo studio del proteoma in base a queste condizioni può causare la perdita di informazioni fondamentali9-12, poiché non consente di identificare le proteine coinvolte nell’infezione, come i fattori di virulenza, le proteine che consentono l’evasione della risposta immunitaria dell’host e proteine che consentono l’uso del macchinario cellulare dell’host di diffondersi. Una simulazione sperimentale delle condizioni di infezione infezione è l’infezione delle colture cellulari (simulazione in vitro dell’ambiente infezione) o l’uso di modelli animali13,14. Lo svantaggio in questi studi risiede in presenza di una grande “contaminazione” da proteine ospite, nonché un basso ottenimento della biomassa patogeno.
del tutto, approcci sperimentali in vitro / ex vivo hanno implicazioni significative per quanto riguarda All’identificazione di nuovi vaccini, obiettivi per droghe, biomarcatori di infettività e progressi della malattia.
La maggior parte delle proteine coinvolte nelle prime fasi dell’infezione host sono proteine superficiali cellulari. Queste proteine sono la connessione tra la cella e il mezzo extracellulare, quindi sono il mediatore principale nell’infezione. Pertanto, sono componenti di grande interesse per lo sviluppo di nuovi vaccini e per la caratterizzazione di nuovi obiettivi per i farmaci. Le informazioni di queste molecole sono a bassa rappresentazione in studi proteomici grazie alla sua bassa abbondanza, una piccola solubilità e il problema nella sua frazionalità senza contaminazione da parte di proteine citoplasmatiche15,16. Nel caso dello studio dei batteri grampostitivi e dei funghi, è anche importante conoscere la composizione proteica della parete cellulare e non solo dalla membrana plasma17.
preparazione del campione
L’ottenimento e la preparazione dei campioni è uno dei passaggi più rilevanti in studi proteomici. È di vitale importanza che i campioni siano presi ed elaborati dallo stesso protocollo in modo che i risultati ottenuti siano veritieri, riproducibili e che le differenze osservate non siano il risultato della manipolazione.
L’elaborazione del campione in Il laboratorio differisce secondo l’origine di questo e lo scopo dello studio. Negli studi nella coltura axenic, l’isolamento preventivo è necessario per ottenere il campione proteico. Al contrario, quando il microrganismo viene analizzato in uno stato infettivo, la preparazione del campione preciso di un isolamento del microrganismo rispetto alle cellule dell’ospite.I metodi più utilizzati per la separazione sono centrifugazione, separazione immunomagnetica (IMS) e la classificazione delle cellule mediante la citometria del flusso (facce).
Il primo metodo, centrifugazione, è consigliato per i patogeni con la parete cellulare (impianti, Funghi, alghe, arcuati e batteri grampostitivi), lisi precedente di cellule eucariotiche (host) mediante pressione osmotica18,19 o detergenti come tritonex-11413.
Nel secondo metodo, la tecnica IMS, particelle magnetiche coniugate Con una specifica immunoglobulina (IG) contro il microrganismo di interesse sono utilizzati. Questi microrganismi possono essere facilmente arricchiti e purificati, generando una biomassa sufficientemente proteina virtualmente libera dall’host per un’analisi proteoma esaustiva. Il vantaggio più importante della centrifugazione sta ottenendo un campione privo di contaminanti dall’host. Al contrario, questa tecnica richiede specifici anticorpi contro le strutture della superficie del patogeno.
Nel terzo metodo, i facce, gli anticorpi specifici sono utilizzati per l’etichettatura fluorescente del microrganism target, con lo scopo di facilitare separazione di questo rispetto ad altri microrganismi o detriti della cellula host. Questa tecnica può separare migliaia di particelle al secondo, ma l’accumulo di sufficiente materiale patogenico per l’applicazione di tecniche proteomiche richiede parecchie ore di classificazione, rendendola molto costosa.
Tutti questi metodi di separazione devono essere ottimizzati Aumentare la velocità di elaborazione del campione e ridurre il rischio di digestione parziale da parte delle proteasi, oltre a ridurre la probabilità di contaminazione con proteine host.
Gli studi proteomici possono essere indirizzati allo studio del protetto totale, del sottoproteo o Una proteina concreta. La selezione di una particolare proteina o popolazione proteica deve essere eseguita da un frazionamento del campione. Tra le tecniche utilizzate per questo scopo, vale la pena di evidenziare la purificazione dell’affinità tandem (Co-IP) 21 e il chip di scansione del peptidoma di HLA222,23.
Tecniche proteomiche
Le tecniche proteomiche sono suddivise in qualitative e quantitative. La prima informa sull’espressione o meno di una determinata proteina o assieme proteica (presenza / assenza), mentre la proteomica quantitativa consente di determinare e confrontare la quantità di proteine presenti nel campione.
negli studi in Proteomic , il campione è un complesso mix di centinaia di cento / mille proteine. Per questo motivo, l’uso di una tecnica di separazione è essenziale. Queste tecniche sono raggruppate in: su gel e senza gel. Le tecniche di gel sono quelle in cui si utilizza un quadro di polimeri per la separazione. Le tecniche Gel-free eseguono la separazione del campione proteico in soluzione da diversi tipi di cromatografia liquida (scambio ionico, affinità, fase inversa …). La tabella 1 mostra i vantaggi e gli svantaggi delle diverse tecniche proteomiche.
Riepilogo di I principali vantaggi e svantaggi delle tecniche di gel e del gel proteomico
ad alta risoluzione
Easy Identification e Sequencing di Biomarkers
Rilevamento di isoforme di una proteina
Sovrapposizione proteina
Mancanza di automazione, Laborioso
Limitazione nel numero di esperimenti
Assenza di differenze interensali
Riduzione della quantità di proteina
Processo automatico multidimensionale e alta sensibilità e risoluzione
Possibilità di quantificazione
Numero illimitato di esperimenti
Riduzione dei costi dovuti all’assenza di marcatura
Manipolazione più piccola del campione
ID basso Little abbondante
Difficoltà nell’assemblea dei peptidi tripsuizzati e meno precisione nella quantificazione relativa alla marcatura
Processo multidimensionale multidimensionale
Alta sensibilità e risoluzione Elevata precisione in quantificazione
Costi elevati degli isotopi e sintetici Peptidi
Gestione maggiore del campione
Proteomica qualitativa su Gel Gel
La separazione delle proteine sul gel è uno strumento che consente la separazione di queste proprietà come la dimensione (MR), il punto isoelettrico (PI) e / o la conformazione (Gel nativi). La separazione del gel può essere eseguita da una singola proprietà (monodimensionale) o da 2 proprietà consecutive (bidimensionali). A causa della complessità degli estratti di proteine totali, la separazione dei campioni in elettroforesi bidimensionale (2DE) offre una risoluzione più elevata. Attraverso questa tecnica, le proteine sono separate da IP e successivamente dal sig., Ottenendo una mappa globale del proteoma del campione.
Technique 2 può essere applicato solo in modo soddisfacente se c’è un minimo di 108 celle isolate. Questa tecnica consente di separare tra 3.000-5.000 proteine uniche24, generalmente differenziate in un singolo punto. Tuttavia, la stessa proteina può essere identificata in diversi punti, indicando che questa proteina ha diverse isoforme che differiscono in PI e / o MR. Queste isoforme possono informare sul possibile PTM di una determinata proteina. I PTM più frequenti sono fosforilazioni, glicosiolazioni o proteolisi limitata25. Un altro fenomeno meno comune è l’identificazione di due proteine nello stesso punto, grazie alla sua uguale PI e al sig.
la preparazione del campione per l’elettroforesi bidimensionale è fondamentale per ottenere risultati ottimali, essendo necessario processi di solubilizzazione, disintegrazione, denaturazione e riduzione delle proteine26.
Una possibilità offerta da 2d Gels è la sua combinazione con tecniche di etichettatura delle proteine che consentono il confronto della proteina nello stesso gel, evitando in questo modo variazioni interensali (tra Gel / esperimenti). Questa tecnica è nota come un gel bidimensionale differenziale (2D-Dige). L’etichettatura da parte di fluorofori può essere applicata allo studio comparativo di 2 proteomi che consentono una quantificazione relativa dei campioni. Questa marcatura può essere diretta a specifiche serie di proteine; Ad esempio, lo studio delle proteine con le regioni esposte al mezzo extracellulare. L’applicabilità di questa tecnica ha permesso allo studio di SurfAde27 evitando il frazionamento delle proteine superficiali, che di solito sono lunghe e costose.
2d-diga Gels può essere applicato alla ricerca di obiettivi terapeutici analizzando l’in vitro analizzando Proteace contro il proteome del patogeno in una situazione di infezione, ottenendo nello stesso gel il comparativo del proteome in entrambe le situazioni. A causa della difficoltà nell’ottenere un campione sufficiente di agenti patogeni in una situazione di infezione, sono stati condotti studi in cui il proteoma del microrganismo in vitro è confrontato in diverse fasi di crescita. Nel lavoro di Hayashit et al.28, le proteine espresse da Legionella Pneumophila sono state studiate in 2 fasi di crescita: esponenziale e post-dipendente, osservando un’elevata espressione di fattori di virulenza nella fase post-opinione. Grazie a questo studio, può essere stabilito nei lavori futuri nel protetto di fase post-opinione come approssimazione del proteoma in infezione.
Un significativo svantaggio della 2a tecnica è la limitazione della capacità di focus di proteine di abbondanza medio a bassa a basso contenuto di abbondanza dovuto alla vasta gamma di livelli di espressione proteica. Le proteine più colpite da tale limitazione sono proteine a membrana e proteine a basso peso molecolare, che sono sottorappresentati nella proteina totale. Queste proteine possono essere rilevate meglio da altre tecniche proteomiche29.
Tecniche senza gel
La tecnica senza gel richiede una prima separazione delle proteine presenti nel campione da cromatografia liquida da parte di diverse proprietà, definita in base alla colonna usato. Esistono diversi tipi di colonne sul mercato, il più utilizzato è la fase inversa, lo scambio di ioni, l’affinità e l’esclusione molecolare. Successivamente, un’analisi viene eseguita da MS per l’identificazione delle proteine (LC-MS / MS).
Le tecniche di separazione senza gel sono consigliabili quando la quantità di campione è scarsa, come è il caso di Esperimenti in infezione in cui si ottiene un basso numero di microrganismi. In questi casi, le tecniche MS senza Gel-free sono adatte per offrire una migliore sensibilità, poiché consente di monitorare 500-600 proteine da solo 106 celle14 (un importo 100 volte più basso rispetto ai Gel 2D). Questa tecnica consente il rilevamento delle proteine difficili da separabili in 2DE, come proteine molto idrofobiche, proteine a membrana e proteine PI-ends, come le proteine ribosomiche con PI30-32 di base. Un chiaro esempio in cui questa maggiore sensibilità è dimostrata è il lavoro svolto in mycoplasma genitalium, un modello genoma e un proteome minimo, in cui la frazione ricca di proteine a membrana è stata studiata da Tritton FractionAtion114. L’analisi di questa frazione è stata eseguita sia da 2 sia da LC-MS, ottenendo una chiara differenza in termini di numero identificato di proteine. Tramite 29, 49 proteine sono state identificate, mentre 242 proteine sono state identificate33 da LC-MS.
Proteomica quantitativa
Proteomica quantitativa è uno strumento utile per analisi proteomiche da LC-MS / MS34. I metodi di quantificazione possono essere classificati in quantificazione relativa / assoluta o con / senza etichettatura.
Metodi di quantificazione relativi (ICAT, ITRAQ, IPTL o Silac) sono utilizzati per il confronto di abbondanza di proteine o peptidi tra campioni. D’altra parte, attraverso l’uso di peptidi sintetici contrassegnati isotopicamente, si ottiene una quantificazione assoluta dei peptidi target.
Proteomica quantitativa marcando
Tecniche quantitative mediante etichettatura Utilizzare composti isotopici per un’analisi successiva di MS, ottenendo una quantificazione relativa. L’etichettatura delle proteine può essere eseguita durante la crescita cellulare o una volta effettuata l’estrazione di questi. I campioni da confrontare sono differenziati dall’etichettatura isotopica. Secondo la tecnica di marcatura, differenziaremo: ICAT (ITOOTOPO CODICE AFFININIGING TAGGING: Affinità marcatura con codifica isotopica) 35, ITRAQ (Chimica Isobarica multiplexed Multiplexing Etichettatura isobarica) 36 E IPTL (Etichettatura termini peptide isobarica: Etichettatura terminale isobarica Peptide) 37.
La quantificazione relativa mediante la marcatura consente il confronto di 2 popolazioni in base alla sua crescita cellulare da SILAC (etichettatura isotopica stabile da / con acidi di amminino nella coltura cellulare: amminoacidi isotopici stabili nella coltura cellulare) . In questa tecnica, i marcatori isotopici non radioattivi sono incorporati durante la crescita cellulare a proteine sintetiche non novo38-41.
Le tecniche di quantificazione significative hanno determinate limitazioni, come è l’aumento della complessità nella preparazione del campione ( Con il trattamento indipendente del campione), la necessità di una grande concentrazione di ciò, gli alti costi dei reagenti, segni incompleti che distorcono il risultato e la necessità di un software specifico per quantificazione.
Proteomics Quantitative Marking
Le strategie di marcatura gratuite possono essere utilizzate per la quantificazione sia relativa che assoluta. Queste tecniche raggiungono una maggiore velocità, risultati più puliti e una semplice analisi dei risultati. Per questo motivo sono promettenti nella quantificazione di proteine private grazie alla loro elevata sensibilità, sebbene essere applicate determinati criteri devono essere presi in considerazione: a) è necessario avere spettrometri di massa con strumenti ad alta precisione e HPLC con un tempo sicuro di ritenzione; b) Il materiale sufficiente deve essere applicato per determinare la concentrazione di proteine prima della misurazione mediante la SM con lo scopo di applicare quantità equivalenti di peptidi, e c) il numero di peptidi della cella host deve essere ridotto al minimo per evitare falsi positivi.
La quantificazione delle proteine da parte di questo metodo è generalmente basata su 2 categorie: a) misurazione dei cambiamenti di intensità degli ioni, sia da picchi o dall’altezza di questi nella spettrometria e b) conteggio degli spettri di proteine identificate dopo l’analisi MS / MS42-53.
Un miglioramento della proteomica quantitativa senza etichettatura è l’incorporazione di peptidi sintetici contrassegnati isotopicamente come standard interni. Questi peptidi consentono una quantificazione assoluta (Aqua: quantificazione assoluta) dei peptidi di interesse54.
strumenti per l’analisi e l’identificazione delle proteine mediante spettrometria di massa
L’identificazione delle proteine viene eseguita più attraverso spettrometri di massa. Questi strumenti consentono di ottenere ioni da molecole organiche, separandole e rilevandole a seconda della loro massa / carico (m / z). Gli spettrometri di massa sono costituiti da 3 componenti: fonte di ionizzazione, analizzatore di massa e rilevatore. Esistono diversi tipi di spettrometri di massa in base alla combinazione dei diversi elementi. I più comunemente utilizzati sono:
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MALDI-TOF (Desorbimento laser a matrice-assistito / Iionizzazione-Time of Flight: Cancellazione / ionizzazione da parte di laser assistita da Matrix, “Tempo di volo”) : Comunemente utilizzato per l’identificazione delle proteine per mezzo di un’impronta peptidica e lo studio dei profili proteici di un’interazione dei campioni e delle interazioni proteiche. Vale la pena evidenziare lo sviluppo della tecnica di “imaging”, che consente una visualizzazione 2-dimensionale della distribuzione di metalli di traccia, metaboliti, lipidi superficiali, peptidi e proteine, direttamente nei tessuti senza avere una pre-estrazione o estrazione .55.56.
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Seldi-TOF (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time of Flight: Desorption / Ionizzazione tramite laser di superficie avanzata, “Tempo di volo”): Questo strumento utilizza la stessa tecnologia che Il Maldi-TOF che incorpora la funzionalizzazione della piastra (scambio ionico, fase inversa, anticorpi, DNA, altre proteine, ecc.) In cui il campione è caricato. Il confronto delle proteine trattenuto sulla piastra tra diversi campioni può essere utilizzato per la ricerca di Biomarkers57.
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ESI (Ionizzazione dell’elettrotospray: ionizzazione da parte dell’elettrospray): Questo dispositivo è particolarmente utile Per il sequenziamento del peptidico, poiché consente la ionizzazione delle macromolecole mediante frammentarsi da parte dei legami peptidici (sindacati più deboli), ottenendo così la sequenza di amminoacidi56,58.
Bioinformatics
Proteomic Le analisi generano una grande quantità di dati da analizzare. Lo sviluppo di strumenti bioinformatici, come l’introduzione di nuovi algoritmi, è stato fondamentale per manipolare detti set di dati. Questo campo consente e facilita la manipolazione di dati su larga scala, sviluppo di programmi e strumenti di ricerca appropriati. Questi strumenti sono stati applicati con grande successo nel trattamento dei dati MS, sia nell’analisi del peptidica (identificazione delle proteine), dell’impronta di frammentazione del peptidge (identificazione della sequenza peptidica) e del sequenziamento novo.
Ci sono una moltitudine di programmi che consentono l’identificazione in silice di proteine. Negli studi proteomici in malattie infettive ci sono programmi che consentono l’identificazione e la caratterizzazione di epitopi del patogeno che interagiscono con il sistema immunitario dell’host, immunoma. Le interazioni patogeni-host non sono note in profondità in molte delle malattie infettive, in modo che gli studi bioinformatici possano dirigere lo studio di queste interazioni.
ApplicationsProteComa di microrganismi
Studi del protetto totale dei microrganismi patogeni sono molto preziosi in termini di informazioni ottenute dall’espressione proteica in una determinata condizione. In altri studi è più interessante ottenere informazioni da determinati sottoprotemi, come le proteine esposte nella membrana o sapere quali proteine innescano la risposta immunitaria nell’host. Vale la pena evidenziare il ruolo del PTM nell’interazione tra l’agente patogeno e l’host, quindi il suo studio nei microrganismi patogeni dovrebbe essere preso in considerazione.
membrana, superficie e secreta
Il sottoproteo della membrana costituisce un insieme di proteine relative all’infezione. Ci sono tecniche per il rilevamento delle proteine esposte sulla superficie cellulare (surfoma), così come l’etichettatura specifica da fluorofori nella rasatura 2D-Dige e sulla cella. La tecnica di rasatura delle celle è stata utilizzata in modo soddisfacente in vari agenti patogeni umani grampostivi come in Streptococcus59 o Staphylococcus Aureus60, sebbene la sua applicabilità nei batteri gram-negativi non sia ancora nota.Questi batteri hanno un involucro cellulare meno rigido e meno resistenti delle grampositivas, in modo che il “rasato” compromette l’integrità della membrana e provoca la lisi cellulare. In alternativa a queste tecniche, i protocolli esistenti di estrazione delle proteine della membrana sono stati migliorati attraverso diversi detergenti o insufficienza di membrana61, come nel caso dell’uso del buffer carbonato per l’eliminazione delle proteine solubili contaminanti nei campioni.
Le proteine segrete costituiscono un importante sottoproteo e possono innescare la lisi delle cellule host da tossine, che possono influenzare l’adesione, la colonizzazione e l’invasione, nonché la deviazione della risposta immunitaria di Host62-66. Questo importante gruppo di proteine viene perso durante la lavorazione dei batteri intatti67.68. Le proteine provenienti da vescicole membrane esterne (OMV) sono un sottoproteo molto importante nei patogeni, poiché innescano potenti reazioni immunogeniche quando vengono rilasciate dal microrganismo al mezzo extracellulare. Le vescicole prodotte da Neisseria Meningitidis sono state utilizzate dal loro effetto immunoprotettivo contro questo pathogenic69.70.
Biofilms
Biofilms sono formati da una robusta biocappa di microrganismi e matrice extracellulare. Questa struttura consente alle cellule che costituiscono il legame a superfici artificiali o biotiche, rendendo difficile eliminare i microrganismi che compongono IT71. I biofilm batterici rappresentano una vecchia strategia di sopravvivenza procariotica. Donlan72 ha definito il biofilm come comunità microbica della sesile, caratterizzata da celle che sono irreversibilmente aderisci a un substrato o interfaccia, o ad alcune con altre, incorporate in una matrice di sostanze polimeriche extracellulari che hanno prodotto esibendo un fenotipo alterato in relazione al tasso di Trascrizione della crescita e del gene. Il Biofilm fornisce i batteri incorporati in esso vantaggi significativi contro le fluttuazioni ambientali di umidità, temperatura e pH e riserva di sostanza nutritiva73. Per questo motivo, le differenze nell’abbondanza di proteine tra cellule coltivate in biofilm e cellule cellulari vegetali sono state studiate attraverso la 2a tecnica con colorazione d’argento a Candida albicans. Come risultato di questo confronto, è stato osservato che le cellule coltivate nel Biofilm avevano una capacità anti-ossidativa inferiore oltre ad avere la proteina PIL1P, la proteina sensibile al trattamento con un dato tipo di antifungals74. Questo risultato ha permesso di trovare un obiettivo e un trattamento efficaci contro lo stato più resistente di questi lieviti.
Identificazione di microrganismi e sensibilità a antimicrobica
L’identificazione dei microrganismi che causa l’infezione deve essere ottenuta nel tempo minimo possibile. Pertanto, un ampio campo di ricerca è la ricerca di tecniche di identificazione alternativa a fenotipica / metabolica, che richiedono, oltre all’isolamento del microrganismo, tra 18-24h di più per l’identificazione di questo. Un’opzione per l’identificazione rapida dei microrganismi è l’ottimizzazione della SM. Nella revisione di Jordana-Lluch et al.75, l’uso di questa tecnica e gli anticipi ottenuti finora sono spiegati in dettaglio.
L’applicazione degli Stati membri nell’identificazione dei microrganismi richiede solo l’isolamento e una media di 5 minuti; Tuttavia, in questo processo, i dati sulla sensibilità antimicrobica non sono ottenuti. Per ottenere queste informazioni, è necessaria la realizzazione dei test di sensibilità del microorganismo, ma detti test richiedono un tempo aggiunto. Studi sono stati condotti utilizzando la SM per rilevare la presenza di beatalactamasi, differenziare tra s.aureo sensibile e resistente a meticillina, e persino rilevare Factors Pathogenicità76-79.
Cerca i biomarkers in fluidi corporei
I biomarcatori facilitano lo sviluppo di specifici strumenti diagnostici, monitorando la risposta alla terapia o al progresso della malattia80. Quando analizziamo i campioni biologici (di provenienza del modello umano o animale), la difficoltà risiede nella creazione di gruppi omogenei per garantire una buona correlazione dei risultati. Per questo motivo, la standardizzazione della classificazione dei campioni è essenziale.
Il confronto dei fluidi tra pazienti e controlli può consentire l’identificazione delle proteine differenziali. Queste proteine possono essere utilizzate più tardi come metodo diagnostico rapido. Uno studio di questo tipo è stato effettuato con il virus epatitise (HEV), in cui il plasma e l’urina dei pazienti infetti sono stati analizzati dai campioni di controllo 2D-scavo. È stato dimostrato che più di 30 proteine sono state espresse differenzialmente in pazienti con HEV acuto rispetto ai controlli81.Questi risultati dimostrano il potenziale di proteomica nella ricerca dei biomarcatori.
Le proteine differenziali ottenute in confronto tra i pazienti con diversi gradi della malattia potrebbero essere utilizzati per determinare la prognosi del paziente.
Immunoma
L’immunoproteomica è uno strumento potenzialmente utile nel campo della ricerca di biomarcatori per malattie infettive, specialmente in situazioni in cui il patogeno è difficile da coltivare in vitro82-85. La tecnologia Seldi è stata applicata molto recentemente nell’identificazione dei biomarcatori per discernere i ceppi di Helicobacter Pylori associati a diversi stati di malattia86. In questo modo sono identificati le “firme” degli anticorpi in siero83,84.
L’identificazione e la caratterizzazione delle proteine antigeniche è un requisito per lo sviluppo dei vaccini, poiché hanno un grande interesse come alternativa terapeutica al trattamento. Per l’indagine sull’immunoreattività degli anticorpi umani o degli anticorpi di modelli animali contro le proteine microbiche, la combinazione di 2DE e immunoblitting rappresenta il metodo di scelta. Gli estratti di proteine totali del microrganismo patogenico sono separati dal 2 ° e le proteine immunoreative vengono rilevate da immunoblot 2D con siero di pazienti infetti, rispetto al modello ottenuto con SERA Control87. Le proteine che generano un segnale differenziale tra entrambi i gruppi sono identificate dall’impronta peptidica.
L’espressione proteica varia in base allo stato e alle condizioni di crescita dei microrganismi. Per questo motivo, è consigliabile svolgere gli immunoblitting con estratto di proteine di microrganismi coltivati in vivo, per evitare variazioni trascrizioni, traslazionali e postgradulabili trovate tra vitro vs in colture in vitro.
Immunoproteomics è utile per fornire proposte generali diagnostico o per la selezione di biomarkers83. Inoltre, questa metodologia può essere facilmente applicata a più infezioni umane e veterinarie di grande importanza grazie alla sua incidenza e severità88-96.
Vaccini e droghe
La selezione degli obiettivi per farmaci e / o vaccini è essenziale per L’ottenimento di un risultato ottimale nel controllo e / o nel trattamento di una malattia infettiva. I criteri da prendere in considerazione per selezionare un obiettivo sono: a) che è essenziale per l’infettività e la proliferazione del patogeno nell’host; b) che ha una bassa ridondanza nel patogeno, sebbene abbia un’elevata ridondanza nelle tracce dell’ospite, purché gli effetti tossici possano essere mitigati; c) che è ampiamente e costantemente espresso nei tessuti di infezione e nei diversi pazienti della popolazione, e d) che è terapeuticamente trattabile con piccole molecole come Sirna, anticorpi o altre modalità farmaceutiche.
La retromarcia del vaccino è una tecnica utilizzata nella ricerca di nuovi obiettivi. Questo approccio consente uno screening a favore delle proteine con potenziale immunogenico. I dati ottenuti dal proteoma durante l’infezione possono essere sfruttati come base per lo sviluppo di nuove chemioterapie e vaccini antimicrobici. Una percentuale bassa di queste proteine può essere utilizzata come obiettivo per la chemioterapia antimicrobica97 o come antigene per vaccini protettivi98. Alcuni agenti patogeni in cui è stato condotto lo studio dell’immunoma: Chlamydia Pneumoniae, Haemophilus Influenza, Neisseria Meningitidis, Helicobacter Pylori, Bacillus Anthracis, Streptococcus Agalactiae, Mycobacterium tubercolosi e mycobacterium bovis98-111.
Conclusione
La Proteomica È uno strumento veramente utile nello studio delle malattie infettive, fornendo una visione globale. Le analisi proteomiche consentono la realizzazione di uno studio di base della malattia, facilitando la ricerca di marcatori di infezione o virulenza. Successivamente, i risultati ottenuti hanno un’applicabilità traslazionale rivolta alla diagnosi e alla prognosi della malattia, oltre a consentire lo sviluppo di nuove terapie antimicrobiche e l’avanzata del vaccino.
Tecniche proteomiche non solo consentono l’identificazione di Nuovi marcatori, ma possono essere impiantati come tecniche diagnostiche rapide, essendo in grado di indirizzare il trattamento con una maggiore velocità evitando colture in vitro, che richiedono tempi di incubazione lunghi, ritardare la diagnosi, oltre a generare falsi negativi in quei microrganismi vitale ma non coltivati.
Questa revisione mostra come la proteomica è un potente strumento di ricerca. A questo giorno, molti esperti considerano utili le tecniche di proteomica nella scoperta delle proteine di interesse clinico, come i biomarcatori, ma la loro applicabilità di assistenza è bassa.Il risultato ottenuto nel lavoro di ricerca basato su proteomico è adattato alle tecniche convenzionali come ELISA, ma queste non vengono mantenute come strumenti diagnostici. Questa recensione mira a mostrare gli esperti del campo clinico Nuove tecniche disponibili per risolvere le difficoltà che si verificano giorno dopo giorno.
Attualmente, la proteomica è un’area valutata dalla sua chiara utilità, anche se c’è ancora molto di lavoro che si esibiscono in aree come malattie infettive. Per migliorare la sua utilità in futuro, dobbiamo aumentare la consapevolezza tra tutti i personale coinvolti nel campo sanitario della sua importanza, nonché integrare i risultati degli studi di tutte le “omica”. Quest’ultimo aspetto è di grande importanza, poiché, ad esempio, la conoscenza del genoma di un microrganismo è di vitale importanza per l’interpretazione dei risultati proteomici.
Un altro aspetto limitante nella microbiologia clinica è l’isolamento del microrganismo per una successiva identificazione. Eliminare questa fase, sia la genomica che la proteomica migliorerebbero la sua applicabilità nell’identificazione del patogeno in un’infezione. Pertanto, questi miglioramenti renderebbero possibile l’accettazione delle tecniche proteomiche nell’ambiente di cura per il rilevamento e la diagnosi in malattie infettive, riducendo tempi e costi.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.