La ritenzione di introni e perdita nucleare di SFPQ sono altoni molecolari – Comunicazioni naturali – Comunicazioni 2021

Soggetti

• Splicing alternativo
• indotto pluripotente cellule staminali
• cellule staminali neurali
• neurologia
• patoogenesi

Sommario

mutazioni che causano La sclerosi laterale amiotrofica (ELA) coinvolge notevolmente i regolatori della lavorazione dell’RNA espressa in forma onnipresente. Per comprendere l’impatto molecolare delle mutazioni che causano Ela nello sviluppo e nella malattia neuronale, analizziamo le trascrizioni durante la differenziazione in vitro dei motoneuroni (MN) del controllo umano e dei mutanti mutanti con più mutanti indotti dal controllo umano (IPSC). Identifichiamo maggiore ritenzione di introni (IR) come caratteristica dominante del programma di giunzione durante la differenziazione neurale precoce. È importante notare che IR viene prodotto prematuramente in colture mutanti di VCP rispetto alle loro controparti di controllo. Questi eventi IR aberranti sono visti anche in set di dati rnaseq indipendenti di mn mutanti Sod1 e FUS. L’IR più significativo è visto nella trascrizione di SFPQ. La proteina SFPQ è ampiamente attaccata al suo introne trattenuto, mostra meno abbondanza nucleare nelle colture mutanti VCP ed è persa da MN Nuclei nei modelli del mouse e dei modelli del mouse e dell’Umana Sporadic ALS. Complessivamente, mostriamo la SFPQ IR e la perdita nucleare come distinzioni molecolari della famiglia e della SLA sporadica.

Introduzione

La sclerosi laterale amiotrofica (ELA) è una condizione rapida progressiva e incurabile relativa all’età , che porta alla degenerazione selettiva dei neuroni dei motori (MN). Le mutazioni causate da ALS comportano regolamenti cruciali di lavorazione dell’RNA, normalmente espressi in tutto lo sviluppo, nella patogenesi sottostante. Ciò solleva la possibilità che i cambiamenti post-trascrizioni che si verifichino nelle prime fasi della vita, compreso lo sviluppo neurologico, possano svolgere un ruolo fondamentale nella patogenesi molecolare sottostante dell’ELA. Comprendere l’impatto delle mutazioni che causano la SLA nello sviluppo neurologico e nella malattia ci consentiranno di chiarire gli eventi di avvio molecolare. Questo, a sua volta, può guidare lo sviluppo di nuove terapie volte ai meccanismi primari prima che la malattia progredisca troppo.

Sia lo sviluppo che l’omeostasi di sviluppo e neuronico sono fondamentalmente basati sull’attuazione precisa dell’elaborazione dell’RNA alternativa del tipo di cellulare E perdio, compresa una giuntura alternativa (AS) e poliaodenilazione alternativa (APA) 1, 2, 3. Sono stati stabiliti diversi meccanismi, che includono l’omissione di Exon, gli esoni a reciprocamente esclusivi e la ritenzione di introni (IR). L’uso alternativo dell’esone è particolarmente caratterizzato da neuroni per regolare la varietà di proteine e funzione 4. I tipi di cellule neuronali mostrano una percentuale maggiore di introni trattenuta rispetto ad altri tessuti e c’è un organismo di prova in espansione che dimostra un ruolo funzionale per lo sviluppo neuronale e l’omeostasi 5, 6, 7, 8. È stato dimostrato che l’aumento di andare durante la differenziazione neuronale regola la espressione delle trascrizioni che non sono necessarie per la fisiologia neuronale matura 7. Uno studio recente ha mostrato prove di elaborazione post-trascrizionale di trascrizioni che trattengono gli introni in risposta all’attività neuronale 8.

APA è una modalità di elaborazione dell’RNA alternativa che genera diversi estremi 3 ‘più frequentemente nella regione 3’ non Tradotto (3 ‘UTR) dell’mRNA, generando isoforme a lunghezza variabile di 3’ UTR. L’UTR 3 ‘funge da piattaforma chiave nella rete di regolamentazione dell’RNA che controlla l’efficienza, la posizione e la stabilità della traduzione dell’mRNA 9, 10. Utr 3 ‘House Una vasta variabilità della lunghezza specifica del tessuto che influisce in modo significativo della sua funzione 11. Di tutti i tipi di cellule umane, le isoforme specifiche del cervello hanno l’UTR di 3 ‘più lungo 12, 13. Inoltre, le mutazioni che disturbano la struttura secondaria del mRNA e dei siti di interazione di ARNM-Miarn possono portare alla neurodegenerazione 14. Nonostante queste scoperte, le funzioni del regolamento IR e il 3 ‘UTR nel contesto dello sviluppo MN e dell’omeostasi sono rimaste poco studiate rispetto ad altre forme di EA.

AS e APA sono coordinati per le singole azioni o combinazioni delle proteine vincolanti dell’RNA (RBP) che agiscono in Trans che si legano a siti specifici all’interno (pre-) mRNA 15, 16. RBPS Media Media MRNA Spliting, esportazione nucleare e posizione.L’accumulo di prove coinvolge PRR come regolatori chiave dello sviluppo neurologico sia delle forme specifiche di neurodegenerazione. In effetti, le mutazioni in diversi RBP, compresa la proteina obbligatoria del DNA di risposta transattiva, 43 kDA (TDP-43), fusa in Sarcoma (FUS) e il fattore associato alla proteina legante box-box (TAF15) che sono stati collegati causalmente La forma familiare di ELA che conduce ai difetti di elaborazione dell’RNA nei modelli del mouse 17, 18.

La nostra ipotesi è che l’articolazione aberrante e l’APA svolgono ruoli importanti sia nello sviluppo come nella malattia del sistema nervoso . In questo contesto, cerchiamo di capire come le diverse modalità di AS e APA appaiono nella neurogenesi motoria umana e esaminiamo sistematicamente l’impatto delle mutazioni che causano elastica nella rimodella post-trascrizionale durante la restrizione del lignaggio. Combinando la differenziazione delle cellule staminali guidata dall’uomo indotta da Man (IPSC) con sequenziamento dell’RNA risolto nel tempo, identifichiamo per la prima volta il programma di rimodellamento post-trascrizionale sequenziale che è alla base della neurogenesi del motore umano. Recentemente, abbiamo identificato fenotipi chiari cellulari di ELA attraverso l’uso di IPSC derivati da pazienti con antosine (VCP) 19. Questa piattaforma ci ha permesso di confrontare il mutante VCP (VCP MU) per controllare le colture durante la differenziazione MN e identificare la deregolamentazione di splicing dipendente dalla mutazione in uno specifico fase di sviluppo. Identifichiamo la prolina e il ricco fattore di splicing (SFPQ) come la trascrizione dei contenitori più significativi tra le varie mutazioni causate da ALS (VCP, SOD1 e FUS). Mostriamo che la proteina SFPQ è ampiamente attaccata al suo introne trattenuto, che mostra l’abbondanza citoplasmatica elevata in VCP MU rispetto ai controlli. Fondamentalmente, la proteina è meno abbondante nei nuclei delle culture di VCP MU e infine è persa dal MN Nuclei nei modelli dei topi (modelli di topi transgenici Sod1 Mu e VCP MU) e campioni di post-mortem sporadici umani di ALS. In sintesi, il nostro studio implica la SFPQ IR e la perdita nucleare come distinti molecolari generali della famiglia e sporadica Elo.

IR è la modalità di giunzione predominante nella neurogenesi del motore.

per esaminare Cambiamenti trascrizionali Durante la neurogenesi motoria umana, analizziamo i dati di sequenziamento dell’RNA ad alte prestazioni (RNA-Seq) per l’RNA poliadenilazione isolato dalle cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC; Giorno 0), precursori neurali (NPC, Giorno 7), precursori MNS “con motivo “(midollo spinale ventrale, PMN, GIORNO 14), postmitotico ma elettrofisiologicamente immaturo MNS (MNS; GIORNO 21), e MNS elettrofisiologicamente maturo (MMN, giorno 35) derivato da due pazienti con Mutation VCP di ALS GEN e due controlli sani (fig. 1A, 31 campioni di 5 punti temporanei e 3 genotipi; 2 cloni di 2 controlli sani e 3 cloni di 2 pazienti con ELA con mutazioni VCP: R155C e R191Q). I campioni di cellule di ogni fase della differenziazione MN sono stati caratterizzati come precedentemente riportato. Qui, eseguiamo una vasta caratterizzazione aggiuntiva per confermare le colture mn altamente arricchite (> 90%; Fig. 1a Complementary). È importante notare che l’efficienza di differenziazione MN era simile tra il controllo e le colture di VCP (figura 1b, c). Utilizzando un set di 19 indicatori genetici chiave della maturazione dell’MN e dello sviluppo embrionale spinale, confermiamo anche una constatazione precedente che il NMM derivato da IPSC assomiglia a MN 20 fetali invece degli adulti (Figura 2A, B supplementare). Gruppo gerarchico non supervisionato (correlazione di rango di Spearman e raggruppamento completo) dei 31 campioni che utilizzano 15, 989 campioni segregati di geni espressi in modo affidabile a seconda della stadio di sviluppo all’interno del lignaggio MN anziché dallo sfondo o dal controllo genetico mutante (fig. 1b).

Trattivvertura introna è Il cambiamento predominante della giunzione durante la neurogenesi motoria precoce e viene prodotta prematuramente nelle culture MU di VCP. Uno schema che rappresenta la strategia di differenziazione IPSC per la neurogenesi motoria. Le frecce indicano i punti del tempo di campionamento nei giorni. I cloni IPSC sono stati ottenuti da due pazienti con mutazioni confermate di VCP (R155C e R191Q, un totale di 3 linee IPSC, 1 induzione di ciascuna linea) e 1 clone di ciascuno dei 2 controlli sani (un totale di 2 diverse linee IPSC, 2 Induzioni di una linea e 1 induzione dall’altra linea).Cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC); precursori neurali (NPC); I neuroni del precursore “modellati” (midollo spinale ventrale, PMN); Neuroni dei motori postmithototici ma elettrofisiologicamente immaturi (MN); MNS elettrofisiologicamente maturo (MMN). B Il gruppo gerarchico non supervisionato di 15, 989 geni gruppi dei 31 campioni secondo la fase neuronale di sviluppo, invece dello sfondo genetico. Cerchi grigi = campioni di controllo; Circles magenta = campioni di VCP MU; I punti di tempo di campionamento sono indicati all’interno dei cerchi. C Grafica circolare che rappresenta proporzioni di eventi di giunzione nei campioni di controllo e MU VCP in diverse fasi della neurogenesi motoria rispetto al punto temporaneo precedente. Le aree grafiche sono proporzionali al numero totale di eventi in ogni fase. Ritenzione di introni (IR); Exon alternativo (ALTEX); microexoni (microfono); Alternativa 5 ‘e 3’ UTR (ALT5 e ALT3). D, F bar grafica che rappresenta il numero di eventi di giunzione esterna e intronici, rispettivamente, in controllo (barre di grigio) e campioni di VCP MU (BARNTA BARS) in punti specifici durante la differenziazione MN. E, G Bar Graphics che mostra il punteggio di arricchimento dei percorsi biologici Vai associati alle trascrizioni che sperimentano eventi di giunzione esononica e introduttiva nei campioni di controllo. H In cima, i grafici in contanti rappresentano le distribuzioni della percentuale di ritenzione (vedere i metodi) per 167 introni in base alle repliche in diverse fasi di differenziazione nei campioni di controllo (a sinistra) e VCP MU (a destra). I diagrammi di cassa mostrano il riassunto di cinque numeri mediani, i quartili inferiori e superiori, i valori minimi e massimi. Di seguito, le mappe di calore della percentuale relativa standardizzata dell’IR in 167 introni in campioni ripetuti in ogni fase di differenziazione. I quanto in H, ma per la differenziazione in vitro di HESCs alla fase neurale di induzione (1 settimana), NPC (4-10 settimane) che produce solo i neuroni dopo ulteriore differenziazione e dopo > 15 settimane, una fase più gligenica che produce sia i neuroni che le cellule gliali 22

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Esaminiamo le dinamiche temporanee di come durante la differenziazione MN. Utilizzando Vas-Tools 21 del tubo RNA-Seq, identifichiamo 1599 e 1507 eventi come nel tempo nei campioni di controllo e nei VCP MU, rispettivamente (Fig. 2c, D). Secondo gli studi precedenti, > il 60% di come eventi nelle fasi successive della differenziazione del terminale MN sono state exon alternative (inclusione ed esclusione di esoni di cassette) e eventi di omissione di introne (figura 2c , d). Abbiamo scoperto che i campioni di controllo e MU VCP mostrano un simile aumento progressivo nell’inclusione dell’exon in cassetta nel tempo (figura 1c, d) nei geni arricchiti per l’organizzazione di componenti cellulari e funzioni di ononologia genica dell’assonogenesi (GO) ( Fig. 1e).

Al contrario, l’IR rappresentava > 65% degli eventi come nella precedente fase della restrizione di lignaggio NPC a PMN (figura 1C) . L’espressione delle trascrizioni di ritenzione di intrusione è aumentata nella transizione da NPC a PMN (IE modello neurale) in campioni di controllo (figura 1F). È interessante notare che i campioni MU VCP hanno mostrato un sorprendente aumento dell’espressione delle trascrizioni che mantengono l’intrusione nella precedente transizione di sviluppo di IPSC a NPC (cioè induzione neurale, figura 1F). Abbiamo trovato che il 53% degli eventi IR è iniziato con il modello nei campioni di controllo (NPC a PMN); Al contrario, il 72% degli eventi IR in MU culture di VCP è iniziata con induzione neurale (IPSC a NPC, figura 2E complementare, a destra). È importante notare che il 60% di tutti gli eventi IR coinvolge gli introni e le trascrizioni identiche tra i campioni di VCP MU e Control (figura 2E complementare, fino a sinistra), che coinvolgono notevolmente geni relativi alla trasformazione e alla giuntura di RNA (figura 1G) . Gli eventi rimanenti erano esclusivi delle culture di VCP MU o si sono verificate in un punto diverso. Ciò indica che i campioni di MU VCP mostrano un’attività simile a quella osservata nelle controparti di controllo durante la differenziazione, ma in una fase prematura.

Quindi, curare ogni evento identificato automaticamente al breve elenco 167 con alta fiducia. È stato assegnato un valore di ritenzione per ciascun evento per essere correlato all’espressione degli esoni di fianchi (vedere i metodi). È immediatamente evidente dalla Fig. 1h che gli imporni 167 vengono mantenuti sistematicamente più in VCP MU nel passaggio NPC rispetto ai campioni di controllo di qualsiasi fase.

Come convalida iniziale, valutiamo se gli introni 167 vengono anche mantenuti in due set di dati trascrittiomici indipendenti di cellule staminali embrionali umane 22, 23. L’esame del suo livello di conservazione generale ha confermato che IR durante la neurogenesi precoce è un fenomeno generalizzabile in vari modelli sperimentali (figura 1i e fig. 2F supplementare). Successivamente, esaminiamo se gli introni contenessero caratteristiche caratteristiche presentabili caratteristiche che potrebbero essere distinte dagli introni convenzionalmente succaldosi e hanno scoperto che il set altamente sicuro di 167 introni trattenuto è più lungo e più conservato rispetto agli introni non conservati dallo stesso set di geni (Fig. 2G Complementary).

Il VCP riproduce un ruolo nella progressione del ciclo cellulare e una percentuale più elevata di IR può derivare dal collegamento stabilito tra l’efficienza della giunzione e il ciclo cellulare 24. Pertanto, esaminiamo se l’apparente accelerazione in come programmi in VCP MU è spiegata da un aumento dipendente dalla mutazione nell’attività del ciclo cellulare. Utilizziamo la citometria del flusso in IPSCS, NPCS e PMN trattati con l’agente fluorescente intercalato e l’agente stacrio di ioduro di propidio per esaminare il contenuto del DNA. Questi esperimenti effettivamente escludevano le differenze nel ciclo cellulare tra VCP MU e i campioni di controllo (Figura 2H-J supplementare). Pertanto, collettivamente, queste scoperte dimostrano che IR è il cambiamento predominante di giunzione che colpisce le prime fasi della restrizione del lignaggio neurale. È importante notare che l’IR è prodotto sia ad alti livelli e prematuramente nelle culture del VCP MU nella fase NPC, che non può essere spiegata dalle differenze nell’attività del ciclo cellulare.

IR Aberrant in MN che trasporta varie mutazioni causate da ALS

Il distintivo patologico in > Il 97% di tutti i casi di ELA (sporadico e famiglia) è il cytoplasmatico del TDP- 43 25, 26. Tuttavia, l’assenza della posizione scarsa del TDP-43 nel 3% dei casi sostiene che vengono ancora scoperti meccanismi patogeni comuni. Per affrontare questo, quindi esaminiamo l’impatto delle mutazioni che causano Sod1 e Fus SLA, che, in modo caratteristico, non esibiscono un segnale di posizione errato di TDP-43. Analizziamo i set di dati transcriptomici per Mutant Sod1 (Sod1 MU) (N = 5; 2 Sod1 A4V derivato dai pazienti e da 3 milioni di campioni purificati con facce di controllo isogenico, in cui la mutazione) 27 è stata corretta e campioni fus (fus mu) ( 6; 3 derivati del paziente FUS R521G e 3 controlli MN non interessati) 28. Confermiamo che IR è il modo predominante della giunzione in MNS derivato da entrambi i mutanti (figura 3a complementare), suggerendo un fenomeno molecolare unificante attraverso vari background genetici ALS (VCP, SOD1 e FUS). È importante notare che il nostro set di alta confidenza di 167 eventi IR che si verificano prematuramente durante la differenziazione di VCP MN sono generalmente influenzati in FUS MU e SOD1 MU MNS (Fig. 2A); In particolare, gli eventi 74 e 59 mostreranno un aumento statisticamente significativo dei MN SOD1 MU e FUS, rispettivamente rispetto ai controlli (valore di P < 0, 01; Prova del conteggio del Fisher; Fig. 3b Complementary). L’estensione della giuntura per quegli introni trattenuta significativamente sia in Sod1 Mu che in FUS MU è mostrata in una mappa di calore in Fig. 2b. Questi formano una rete di proteine arricchita nella giunzione e la traduzione di RNA (Fig. 2c, D). Ciò dimostra che gli eventi IR identificati nel nostro modello ALS sono anche inclusi in MNS che trasportano altre mutazioni causate da ALS che non mostrano una cattiva posizione del TDP-43. Cumulativamente, questi risultati confermano la possibilità di una generalizzazione aberrante in diverse forme genetiche di ALS.

Le trascrizioni coinvolte nell’induzione neurale mostrano una ritenzione diffusa di introni in mn derivate dalle mutazioni che causano la fus e Sod1. La grafica della scatola che mostra la distribuzione della percentuale di ritenzione per 167 introni tenuta manualmente nell’MNS di controllo (scatola bianca), i mutanti MNS Mu fus (scatola grigia) o Sod1 Mu MNS campioni (Blue Bar) 28, 50. I campioni mutanti mostrano sistematicamente una maggiore proporzione di andare rispetto ai controlli. I diagrammi della scatola sono mostrati in Fig. 1h. B HeatMap raggruppata gerarchicamente (distanza da Manhattan e reparto raggruppamento) di livelli relativi di IR in 40 geni che mostrano una ritenzione statisticamente significativa durante la neurogenesi del motore sia in Sod1 MU che in FUS MN.Circles blu = campioni Sod1 mu, cerchi grigi = campioni fus mu e cerchi vuoti = campioni di controllo. C Rete di interazioni proteiche-proteine per geni che esibiscono vanno durante la neurogenesi del motore presso Sod1 MU o FUS MN MNS. I bordi rappresentano le interazioni proteiche-proteine descritte sperimentalmente annotate nel database della stringa 51. I nodi indicano proteine, colorate in base alle condizioni in cui la trascrizione corrispondente mostra; Le dimensioni dei cerchi sono proporzionali al numero di bordi nella rete. D Bar Graphics che mostra i punteggi di arricchimento (valore P Value P Value Fisher Test) dei GOS biologici associati ai geni che mostrano durante la neurogenesi del motore in Sod1 MU e / o FUS MN MN rispetto ai controlli

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Transitory Transitory Utr 3 ‘nella neurogenesi precoce

La giunzione e la regolazione della poliadenilazione sono solitamente interconnesse. Per esaminare se la lunghezza UTR da 3 “varia lungo la differenziazione e come il VCP MU influisce su questo processo, per prima cosa estendiamo il catalogo corrente dell’RESEMBL 3 ‘UTR utilizzando i nostri dati RNA-Seq (vedere i metodi); Per ogni gene, analizziamo le tue lunghezze massime espresse nel corso della differenziazione. Sia i campioni di controllo e VCP MU, le lunghezze medie di 3 ‘UTR per 12, 364 geni espressero continuamente aumentano durante il corso del tempo di differenziazione. Tuttavia, eccezionalmente, UTR 3 ‘nei campioni di controllo vengono temporaneamente abbreviati durante la fase NPC (valore di P < 0, 01; test Wilcoxon; Fig. 3a). Come allungamento di 3 ‘UTR nello sviluppo embrionale è previsto, l’accorciamento osservato nella fase NPC (rispetto a IPSC) è sorprendente.

Variazione della lunghezza di 3 ‘UTR durante la neurogenesi del motore umano. Per scatolare i diagrammi di 3 ‘massima lunghezza UTR distribuzioni espresse in diverse fasi della differenziazione MN nei campioni di controllo (a sinistra) e VCP MU (a destra). Valore Val ottenuto con il test Wilcoxon. B BAR grafica che mostra i numeri UTR 3 ‘con modifiche statisticamente significative tra il promotore distale (a sinistra) e il promotore prossimale (a destra) in diverse fasi di differenziazione rispetto ai IPSCS in controllo (barre grige) e campioni di VCP MU (BARS). Inserimento, grafica circolare che rappresenta le proporzioni dei geni che mostrano l’uso di UTR in alternativa nei campioni di controllo e nei campioni di controllo e nei VCP MU (Bianco), solo i campioni di controllo (area grigia) o solo i campioni VCP MU (Area Magenta). C Vai Analisi dell’arricchimento delle rotte biologiche associate ai geni che mostrano cambiamenti distali statisticamente significativi nell’uso del Poly (A) Sito nel controllo mm rispetto al controllo IPSC. D, e a sinistra, le viste del browser del genoma dei profili RNA-SeQ nel 3 ‘UTR dei geni GNL1 e TARDBP che mostrano cambiamenti statisticamente significativi in prossimali per distali nell’uso del sito Poli in MMN in confronto con iPSCS. A destra, i grafici a barre che mostrano l’uso distale dell’UTR di 3 ‘in relazione all’Utr proximale 3’. P- Valori ottenuti con il test del conteggio di Fisher. F Come c per i geni che mostrano modifiche prossimali statisticamente significative nell’uso del sito Poly (A) nel NPC di controllo rispetto al controllo IPSC. G, H Proprio come D per i geni ZNF254 e Dars che mostrano modifiche distali a prossimali statisticamente significative nell’uso del sito Poly (A) in NPC rispetto a IPSC

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Per indagare ulteriormente le dinamiche della lavorazione UTR in 3 ‘, analizziamo i siti Tandem Poly (A) che si trovavano nello stesso terminale Exon. Utilizzando il numero di letture assegnate al terminale 300 NT del segmento di ciascun 3 ‘UTR come proxy per il livello di espressione ISOFORM, abbiamo quantificato l’uso del sito di poli (a) alternativo in diverse fasi di sviluppo rispetto a IPSC. 822 I geni mostrano le modifiche statisticamente significative Utr 3 ‘nel controllo e / o VCP MU (figura 3b). In 171 geni, c’è un uso maggiore del sito di poli (a) distale sia nel controllo che nel VCP MMN (Fig. 3b), secondo uno studio precedente 29; Questi geni sono arricchiti in termini GO relativi alla giuntura di mRNA (figura 3C). Nel MN Stage < 10, i geni mostrano un significativo uso differenziale di 3 ‘Utr quando le culture di controllo e VCP MU sono direttamente confrontate, che conferma una regolazione della lunghezza di 3’ UTR simile Nella differenziazione terminale tra il controllo e il VCP MU (Fig. 4a supplementare).È degno di nota che, in diversi casi, i campioni di VCP MU hanno mostrato un significativo cambiamento distale del promotore a una fase relativamente precedente per controllare i campioni. Questi esempi includono GNL1 (Fig. 3D) e TARDBP (figura 3e); Quest’ultimo mostra anche un accumulo di Long UTR 3 ‘ISOFORM in SOD1 MN rispetto ai controlli, ma non in FUS MU (figura 4C, D). Nessuna di queste variazioni in UTR in 3 ‘ha portato a cambiamenti misurabili nell’espressione dei geni o delle proteine (figura 4e, f, g complementare).

di 822 geni, 169 mostrano una modifica prossimale al promotore Statisticamente significativo specificamente nel controllo NPC rispetto a IPSC (Fig. 3b). Varie rotte biologiche, come la trascrizione e la regolazione della neurotrofina, sono rappresentate tra le trascrizioni che mostrano un accorciamento UTR transitorio da 3 ‘(figura 3F). Circa l’80% di questi eventi è assente in VCP MU (Fig. 3b, G, H); Ciò viene ulteriormente confermato quando i campioni di VCP MU e Control sono confrontati direttamente nella fase NPC (Fig. 4a, B). Questi dati dimostrano che ampi picchi di variazione della lunghezza UTR a 3 ‘prima di andare e caratterizzare la transizione da IPSC a NPC. È importante notare che i campioni MU VCP non mostrano alcun processo apparente simile.

Il regolamento nella parte inferiore del fattore di giunzione corrisponde a un Aberrant IR

dopo aver identificato il principale Queste si girano differenze nei campioni ELA rispetto al controllo, quindi è stato provato a comprendere se lo sfondo genetico ELA porta a differenze trascrizioni misurabili durante la neurogenesi del motore. Nello specifico, indaghiamo indagino dei cambiamenti di espressione che non sono identificati in modo ottimale dal raggruppamento gerarchico (figura 1b), che è spesso dominato da un unico programma di trascrizione. Applichiamo la decomposizione di valore unica (SVD) a tutta la matrice di espressioni (15, 989 geni in 31 campioni; figura 1A) per identificare i principali programmi trascrizionali e i relativi processi biologici che sono alla base della neurogenesi del motore 30. Usando questo metodo, troviamo che (1) neurogenesi progressiva, (2) induzione neurale e il modello transitorio, e (3) differenziazione del terminale con un certo contributo all’induzione neurale costituisce i principali programmi di espressione cellulare ortogonale che operano a lungo del corso di tempo di sviluppo; Questi primi tre componenti catturano il 69% della varianza nell’espressione genica (figura 4a-c, fig. 5a complementare). L’analisi dell’arricchimento funzionale Vai dei gruppi geni che sono stati associati positivamente o negativamente a questi componenti (figura 4D-F) conferma ulteriormente l’associazione biologica di ciascun componente principale. È importante notare che i campioni di controllo e il VCP MU si comportano in modo simile in questi primi tre componenti. Un’analisi lineare multivariata ha confermato che il tempo nella cultura anziché la mutazione VCP è la variabile che spiega i componenti 1, 2 e 3 (figura 5b complementare).

Regolazione alle partite globali a basso contenuto di splicing corrispondenti. A – C Analisi di decomposizione del valore singolare dell’espressione di 15, 989 geni in n = 31 campioni. A sinistra, i grafici della linea mostrano i profili di espressione dei primi tre vettori singolari \ (\ overighttarrow v _1 \) tramite \ (\ overrightarrow v _3 \), catturando il 47%, il 15% e il 7% della varianza nell’espressione genica , rispettivamente. I punti dati Grigio e Magenta indicano espressione per campioni di controllo e VCP MU. A destra, la mappa del calore dell’espressione standardizzata dei geni i cui profili di espressione sono correlati positivamente (indicati dai tre rettangoli più scuri) e negativi (indicati dai tre rettangoli più chiari) con i primi tre vettori singolari sulla destra. I grafici a barre D-F mostrano i punteggi di arricchimento per andare le funzioni biologiche dei geni che sono correlati positivamente (tre barre inferiori) o negativamente (tre barre inferiori) con i primi tre vettori singolari sulla destra. I diagrammi di G Bar in alto, che rappresentano il numero di geni regolamentati al calo dei campioni MU di VCP rispetto al controllo in diverse fasi della differenziazione MN. Sotto, la mappa di calore delle funzioni biologiche Go arricchita tra i geni regolamentati ai corrispondenti punti temporali.H Diagrammi in contanti che mostrano le distribuzioni dei cambiamenti nelle modifiche Log2 per 66 geni del fattore di splicing essenziale tra mutanti e controlli di ALS; Scatole bianche = VCP MU rispetto ai controlli, Blue Box = Sod1 MU rispetto ai comandi isogeni, scatola verde = FUS MU rispetto ai controlli

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Avanti, Eseculendo a Analisi differenziale dell’espressione genica per valutare se i geni specifici sono disciplinati in modo differenziale in diverse fasi dello sviluppo neuronale in VCP MU rispetto ai campioni di controllo. Duecentocinquantasei geni sono stati statisticamente regolati da VCP MU nella fase NPC durante la quale si verifica un IR aberrante (Log2FC > 1.5 e valore di P < 0.01); Questi geni sono altamente arricchiti nella giuntura dell’mRNA e nelle funzioni di elaborazione GO della fine 3 ‘(figura 4G). Va notato che 47 di questi geni codificano RBP (figura 5D complementare). C’erano molti minori geni regolamentati verso l’alto (figura 5c supplementare). Esaminiamo anche i livelli di espressione di 66 geni regolamentari conosciuti di giunzione 31; Esiste una chiara regolamentazione discendente globale nella fase NPC dei campioni di MU VCP e nella FUS SOD1 MU e FUS indipendente, coincidono con un IR aberrante in ogni caso (figura 4h).

In sintesi, noi Trovato che i programmi di lavorazione della trascrizione e dell’RNA riflettono il percorso di sviluppo MN poiché i percorsi specifici sono attivati da stadi. Nonostante i difetti post-trascrizioni, il programma trascrizionale primario non viene interrotto durante la differenziazione MN mediante mutazione VCP. Tuttavia, un regolamento verso il basso globale nell’espressione dei componenti della giunzione avviene in concomitanza con un’iride aberrante in varie mutazioni che causano la SLA.

Trascrizioni IR citoplasmatici e perdita nucleare della proteina SFPQ

Gene SFPQ, membro della famiglia Comportamento della Drosophila, Splicing umano (DBHS), codifica una proteina che esegue funzioni chiave in trascrizione, giunzione, 3 ‘Elaborazione finale e fattibilità degli Assoni 32, 33, 34, 35. Qui, l’introne 9/9 di 9 KB nel gene SFPQ mostra il più importante evento IR identificato durante la neurogenesi dei motori nei nostri campioni VPC MU NPC rispetto alle controparti di controllo. È importante notare che l’Aberrante SFPQ IR avviene anche in Sod1 MU e MN MN rispetto ai controlli (figura 5a, c). Convalidiamo SFPQ IR e la sua deregolamentazione in VCP MU rispetto ai campioni di controllo mediante l’analisi QPCR di più linee IPSC indipendenti (tre cloni di tre controlli sani e quattro cloni di due pazienti con mutazioni VCP; Fig. 5b e fig. 6A supplementare). Inoltre, abbiamo convalidato due regolatori congiunti GUS e DDX39, che sono altrettanto fortemente interessati in NPC VCP MU, e in Sod1 MU e MN MN (fig. 6b-G supplementare).

Blendthing dell’Atron SFPQ in varie forme genetiche di ALS e la sua interazione con PROTEIN SFPQ . A sinistra, le viste del browser del genoma dei profili RNA-Seq per il Gene di ritenzione della ritenzione di intricamento SFPQ in Control e campioni VCP MU nelle fasi IPSC, NPC e PMN. L’introne di 9 KB 9/9 di interesse è indicato da una scatola gialla. A destra, i grafici a barre che quantificano la percentuale di andare in tutto il corso del tempo nel controllo e sul VCP MU (media ± SD; test del conteggio dei fisher). B. Grafica della barra che mostra i livelli IR SFPQ misurati da QPCR; Barre bianche = Controlli, barre nere = VCP MU. I livelli di andare in ogni momento sono stati confrontati con quelli della fase IPSC dello stesso gruppo. N = 3 linee di controllo e n = 4 linee VCP (media + SD * P < 0.05, ** P < 0.01, ANOVA ONE Modo con la correzione del Dunnet per più confronti). La grafica della barra di C che mostra la percentuale di SFPQ IR per FUS MU o SOD1 MN MN nel controllo rispetto a (media ± SD; test di conteggio del fisher). I grafici a barre rappresentano il livello di arricchimento nel legame di RBP all’introna conservata rispetto agli introni non conservati nello stesso gene; Blue Bars = Gene SFPQ, barre verdi = gen fus. E-F Vista del browser del genoma degli eventi di crosslining di Eclip SFPQ lungo le annotazioni di trascrizione di SFPQ e FUS. I dipinti grigi evidenziano la posizione degli introni trattenuti. G Bar Graphics che mostra il livello di posizione nucleare e citoplastica delle trascrizioni di andare misurata da QPCR.I livelli di andare in ogni frazione sono stati confrontati con quelli della frazione nucleare del controllo IPSC. N = 3 linee di controllo e n = 4 linee VCP, supporto + valore SD P anova a due vie con correzione di tukey per più confronti. H Posizione subcellulare SPFQ determinata da immunocytochimica in IPSCS, NPC e PMN. La proporzione dell’intensità media della colorazione SFPQ nel core (N) contro il citoplasma (c) è stata determinata automaticamente nelle celle MU Ctrl e VCP. I dati mostrati sono il rapporto N / C (± SD) per campo visivo di quattro linee di controllo e quattro linee VCP MU. Valore T-test non accoppiato con correzione welch. Vedi anche Fig. 7D Complementary

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Esaminiamo gli eclip su larga scala dei dati di 112 RBP in celle K562 e HePG2 per identificare i candidati che si uniscono agli introni presenti in SFPQ e FUS 36, 37. La classificazione di questi rbp dovuta alla proporzione di eventi di reticolazione nell’intronazione rispetto agli introni non conservati nello stesso gene rivelato che SFPQ e HNRNPM sono i RBP più altamente arricchiti (figura 5D-F e fig. 7a supplementare). Ciò indica che la proteina SFPQ è direttamente collegata agli introni SFPQ e FUS trattenuti.

Durante la scoperta della prova delle interazioni tra la proteina SFPQ e l’introne 9/9 di SFPQ, cerchiamo di capire la natura di questa interferenza . I cambiamenti in IR non sono accompagnati da una differenza statisticamente significativa nei livelli di espressione dei geni o delle proteine tra VCP MU e i campioni di controllo (figura 7b, c). Invece, usiamo la frazionaria citoplasmatica nucleare e identifichiamo un’abbondanza statisticamente maggiore dell’isroforma di ritenzione di introna SFPQ nel cytoplasma MU di VCP rispetto alle culture di controllo (Figura 5 G). Questi risultati insieme hanno portato all’inchiesta della distribuzione subcellulare della proteina SFPQ. Troviamo una perdita nucleare modesta ma statisticamente significativa della proteina SFPQ nelle culture di VCP MU (figura 5h).

In sintesi, l’aumento più significativo di passare attraverso VCP, FUS e SOD1 è visto nella trascrizione di SFPQ. Questa sequenza di introne è ampiamente collegata dalla proteina SFPQ e entrambi i membri di questo complesso (cioè la trascrizione di ritenzione di proteine e di intrusione) esibiscono una distribuzione delle cellule aberranti.

perdita nucleare di sfpq attraverso la famiglia Ela e Sporadic

Avendo stabilito una diminuzione dell’abbondanza nucleare della proteina SFPQ nella differenziazione dei colture IPSC, è stato cercato di testare la generalizzazione di questa scoperta attraverso i modelli transgenici al page in vivo e il tessuto umano post mortem dei casi di ELA sporadica. A tal fine, abbiamo esaminato per la prima volta due modelli transgenici di Mouse ALS, tra cui Sod1 G93A e VCP A232E. Usando questo approccio, dimostriamo la perdita nucleare della proteina SFPQ del midollo spinale con entrambe le mutazioni genetiche relative alla ALS (figura 6a). Pertanto, la perdita nucleare della proteina emerge in diverse forme genetiche dell’ELA che è noto per mostrare la proteinopatia TDP43 (VCP MU) e quelle che non fanno (Sod1 MU). Notando che il 90% dei casi ELA non è familiare, esaminiamo quindi il tessuto post-mortem del midollo spinale dei casi ELA negli umani sporadici. Infatti, dimostriamo una sorprendente perdita nucleare della proteina SFPQ nell’era sporadica umana rispetto ai normali tessuti di controllo, che sottolinea la più ampia rilevanza di questa scoperta (Fig. 6b). Da questi risultati arriviamo alla conclusione che la perdita nucleare della proteina SFPQ è un sigillo distintivo attraverso vari modelli in vitro e in vivo che rappresentano familiari e sporadici als.

Debug Nucleare da SFPQ è una guarnizione molecolare di ALS genetica e sporadica. Analisi della posizione subcellulare di SFPQ in mn nel midollo spinale ventrale di topi tipi selvatici, VCP A232E e SOD1 G93A. Il citoplasma MN è stato identificato dalla colorazione della chat, i nuclei erano contrastati con DAPI. I dati mostrati sono la proporzione nucleare / citoplasmatica (N / C) (media ± SD) per cella di tre topi Sod1 G93A e 3 VCP A232E di tipo selvaggio. Barra scala: 20 μm. P- Welch T valori di prova su un lato. Le singole cellule animali in ogni condizione sono state raggruppate dopo aver escluso l’effetto dei singoli topi confrontando i modelli lineari completi (malattia e fattore individuale) con modelli lineari ridotti (solo la malattia) utilizzando i criteri di informazione Akaike. B Analisi della posizione subcellulare di SFPQ in mn nel midollo spinale ventrale di controlli sani e pazienti con ELA sporadica (sals).Il citoplasma MN è stato identificato dalla colorazione della chat, i nuclei erano contrastati con DAPI. Solo il MN con un nucleo visibile è stato considerato per l’analisi. Barra scala 50 μm. I dati mostrati sono un rapporto N / C (media ± SD) per cella di tre casi per gruppo

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discussione

Gli obiettivi di questo Lo studio è stato doppio: (i) risoluzione di eventi di elaborazione dell’RNA alternativi che sono alla base delle diverse fasi del MN e (II) restrizione dei meccanismi patogeni primari tra forme patologicamente divergenti di ELA (cioè, con o senza proteinopatia TDP43). Per raggiungere questo obiettivo, integremo la differenziazione diretta dei IPSC specifici del paziente in MN. ESPINALES con sequenziamento dell’RNA e completo esame bioinformatico. Mostriamo che un solido programma di giunzione è alla base dello sviluppo di MN come riassunto in Fig. 6a. Risolvendo la natura precisa dei programmi sequenziali post-trascrizioni che sono alla base delle diverse fasi della differenziazione MN, riveliamo che il tempo di questi eventi molecolari accuratamente coreografati è disturbato dalla mutazione VCP causata da ALS. Quando si analizzano i campioni MN relativi a ulteriori ALS, mostriamo anche che la storia dei geni ALS, come SOD1 e FUS, influenzare la struttura della trascrizione dei regolatori della giunzione di RNA chiave in modo simile agli obiettivi del programma Aberrant Splice nei campioni di VCP. Inoltre, mostriamo che un regolamento al calo globale dei componenti della giunzione coincide con difetti di splicing. Questo “indebolimento” del macchinario di splicing offre una spiegazione plausibile per l’IR aberrante che troviamo nell’ALS relativo alla mutazione VCP, Sod1 e FUS. La trascrizione SFPQ mostra l’intrusione trattenuta in modo più significativo, a cui la proteina SFPQ è avidamente allegata, fornendo prove di un’interazione diretta tra la proteina e la trascrizione che mantiene l’introne. Mostriamo anche che la trascrizione della ritenzione di intrusione SFPQ viene esportata nel citoplasma. Ciò si verifica in misura maggiore nel mutante VCP che coincide con il programma IR Aberrant IR. Ciò ci ha portato a esaminare la posizione cellulare della proteina SFPQ, che ha scoperto la sua perdita nucleare in ALS. SFPQ codifica un regolatore chiave della localizzazione e lo sviluppo assonale di mRNA 38. Insieme, questi risultati rappresentano l’idea che la struttura di trascrizione deregolata possa svolgere un ruolo chiave nella degenerazione assonale durante lo sviluppo dell’ela. Infatti, la SFPQ sta emergendo come un regolatore chiave della neurodegenerazione più ampiamente 34, 38, 39, 40.

I cambiamenti dinamici di come sono stati precedentemente informati nella forelebrain dei roditori tra diverse fasi di sviluppo 41, 42 . Qui abbiamo identificato modifiche non precedentemente riconosciute nella struttura della trascrizione del gene che regolano l’elaborazione e la giuntura dell’RNA nelle fasi iniziali della restrizione del lignaggio MN umano (Figura 7A). Mostriamo che un massimo rimodellamento di 3 ‘UTR, incluso l’accorciamento di 3’ UTR, precede per andare. Nello specifico, vi è una variazione di lunghezza 3 “statisticamente significativa che influisce sulle strutture del trascritto come le cellule escono dalla pluripotenza durante l’induzione neurale. Ciò precede il picco dell’accumulo di trascrizione di ritenzione di introna che viene prodotta nel modello neurale del midollo spinale ventrale. Dopo questo, il progressivo progressivo progressivo in 3 ‘, l’inclusione di esoni di cassette e la giunzione di introna caratterizzano le fasi rimanenti della differenziazione del terminale a MNS come precedentemente visualizzato 1, 6.

Diagramma schematico del modello proposto. Una caricatura che riassume il corso temporaneo degli eventi post-trascrizioni che alla base della neurogenesi motoria umana nei campioni di controllo e VCP MU. I nostri risultati suggeriscono che gli eventi predominanti di elaborazione dell’RNA in una fase iniziale della differenziazione neurale sono IR e rimodellano 3 ‘UTR. Questi eventi iniziano prematuramente nei campioni di VCP MU, ma non influenzano i principali programmi di trascrizione che sono alla base della differenziazione del MN umano. B caricatura che riassume la conseguenza funzionale di un IR aberrante nel gene SFPQ attraverso varie forme genetiche e sporadici di ALS. L’introne 9/9 di 9 KB in SFPQ è preservato in tutti i fondi mutanti ALS, che porta a una maggiore abbondanza citoplasmatica di trascrizioni interessate. La proteina SFPQ è ampiamente attaccata all’entrona conservata. La proteina SFPQ stessa viene trasferita dal nucleo al citoplasma in tutti i fondi mutanti di ALS, oltre a campioni post-mortem di pazienti sporadici con ELA.

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Utr in 3 ‘Play Le funzioni chiave nella regolazione dell’espressione genica post-trascrizionale e MRNA espresse nei tessuti cerebrali generalmente hanno UTR in 3’ più a lungo in confronto a Altri tessuti 12, 13. In effetti, viene osservato un progressivo allungamento del mRNA 3 ‘UTR durante lo sviluppo embrionale del mouse 29. Qui osserviamo una vasta variazione della lunghezza di 3 ‘UTR durante l’induzione neurale degli IPSC umani. Inaspettatamente, troviamo un accorciamento transitorio di 3 ‘UTR che precede il progressivo allungamento di 3’ UTR precedentemente riportato durante la differenziazione del terminale. La funzione molecolare di questo accorciamento rimane poco chiara, sebbene altri studi riportano un ruolo potenziale del 3 ‘Utr nella formazione di parassiti e la produzione di pluripotenza 43, 44. La natura altamente transitoria di questo processo normativo può spiegare perché ha eluso il rilevamento sperimentale fino ad oggi. Il nostro progetto sperimentale risolto nel tempo ha consentito l’identificazione di programmi trascrizionali sequenziali che sono alla base della neurogenesi del motore umano.

Sta diventando un nuovo meccanismo post-trascrizionale che regola l’espressione genica. I tipi di cellule neuronali e immunitarie hanno proporzioni più elevate di introni di introni presenti rispetto ad altri tessuti 7. Gli studi precedenti hanno mostrato progressivo durante la differenziazione del terminale dei mouse neuroni e la rilevanza delle trascrizioni che conservano l’intrusione nella regolazione dei geni specifici dei neuroni collegati funzionalmente nei modelli del mouse 6, 7. Qui forniamo prove di un aumento transitorio delle trascrizioni di ritenzione di introni nella PMN del palco che è diretta a una rete di regolatori di splicing. Riconoscendo l’interazione tra gli eventi IR e i paraspeckle nucleari, solleva la possibilità che queste trascrizioni contribuiscano alla stabilizzazione dei paraspeckle o dinamicamente dinamicamente in dette strutture nucleari per inibire la loro funzione. Gli esperimenti futuri determinano la stabilità e la posizione di tali trascrizioni.

Dimostriamo che la sincronizzazione dei programmi post-trascrizioni è disturbata in campioni con mutazioni VCP che causano la SLA, con prematura e aumentata e, in una certa misura, con una variazione di lunghezza di 3 ‘UTR. È interessante notare che i regolatori di splicing della RNA chiave selezionati dal programma Aberrante Junction in VCP MU campioni hanno anche mostrato un ampio IR nel MN che ospita mutazioni in altri geni che causano i geni, tra cui Sod1 e Fus. In particolare, abbiamo osservato una ridotta espressione dei componenti chiave della Spliceosoma che coincidono con un IR aberrante in VCP, SOD1 e FUS. Questo è coerente con uno studio recente che mostra l’associazione tra IR e ridotto reclutamento di fattori di giunzione 45. Sebbene il programma congiunto aberrante nei campioni di VCP MU potrebbe essere collegato alla degenerazione neuronale, la mancanza di cambiamenti nei programmi trascrizionali associati alla neurogenesi motoria indica che le disfunzioni nel trattamento dell’IR e della fine 3 “non influenzano lo sviluppo fondamentalmente neuronale. Questi risultati sollevano insieme l’ipotesi che l’ipotesi aberrante rappresenta sottili dimostrazioni di un modo deregolato di sviluppare i neuroni, che alla fine contribuisce alla maggiore vulnerabilità della MNA matura.

La trascrizione della ritenzione di introna più significativa tramite i modelli VCP MU , Sod1 MU e FUS MU IPSC è stato SFPQ, che codifica una proteina che esegue funzioni chiave nei modi in uscita legati all’ELA, compresa la trascrizione, la giunzione, la trasformazione finale 3 “e la redditività di AXON 32, 33, 34. Gli esperimenti successivi hanno dimostrato che la trascrizione di ritenzione intrlar è più abbondante nel citoplasma di VCP MU rispetto alle controparti di controllo e coincide con la diminuzione nucleare della proteina SFPQ. Scopriamo anche che la proteina SFPQ è ampiamente attaccata al suo introne trattenuto. L’autoregolamentazione tra le proteine vincolanti dell’RNA (RBPS) (ad esempio TDP43) è riconosciuta e, pertanto, questa scoperta è coerente con la precedente letteratura 46, 47. In modo cruciale, troviamo la perdita nucleare della proteina SFPQ su entrambi i modelli transgenici di Sod1 e del mouse VCP, e nel cavo sporadico Sporadico Sporadic Post Mortem, suggerendo che questo rappresenta un sigillo molecolare di ALS. Pertanto, proponiamo che l’interazione tra la proteina SFPQ e la sua trascrizione che mantenesse l’introne impone la sua co-locazione aberrante nel citoplasma (figura 7b).La ridotta abbondanza della proteina SFPQ nucleare può influire sulla giunzione prima dell’mRNA, che potrebbe contribuire a difetti post-trascrizioni che noi e altri abbiamo identificato in ALS 48, 49. Presi insieme, scopriamo che l’IR nella trascrizione di SFPQ e la perdita nucleare della proteina SFPQ sono caratteristiche molecolari comuni in varie forme genetiche e sporadici di ALS.

Dichiarazionetica Etica

Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti e controlli sani in questo studio. Tutti i protocolli sperimentali sono stati effettuati in conformità con le regole e le linee guida approvate dal Comitato nazionale dell’etica della ricerca della neurologia nazionale e dell’ospedale neurochirurgia dell’UCLH e dell’Istituto di neurologia dell’UCL (09/0272).

Derivazione di fibroblasti umani e IPSC

I fibroblasti dermici sono stati coltivati in Optimm + FCS al 10%. I seguenti plasmidi episomici sono stati trasfettati per la generazione di IPSC: PCXLE HOCT4 SHP53, PCXLE HSK e PCXLE HUL (ADD ADD ADDDNGENE), come precedentemente riportato. I dettagli delle linee utilizzate in questo studio sono fornite nella tabella supplementare 1. Due delle linee di controllo utilizzate (controllo 2 e controllo 3) sono disponibili in commercio e acquistate da Corell (numero di catalogo ND41866 * C) e ThermoFisher Scientific (Cat No . Numero A18945), rispettivamente.

Cultura cellulare

I PSC indotti sono stati mantenuti in Geltrex (tecnologie Life Technologies) con un mezzo essenziale (tecnologie della vita) e passarono usando EDTA (Life Technologies , 0, 5 mm). Tutte le culture cellulari sono state mantenute a 37 ° C e 5% di anidride carbonica.

differenziazione del motoneurone

MN La differenziazione è stata effettuata utilizzando una versione adattata di un protocollo 19 pubblicato in precedenza. In breve, gli IPSC differivano per la prima volta in Neurepithelium placcatura al 100% di confluenza in medio chimicamente definito composto da DMEM / F12 Glutamax, Neurobasal, L-Glutammina, supplemento N2, aminoacidi non essenziali, supplemento di B27, β-mercaptoetanolo (Tutte le tecnologie di vita) e insulina (Sigma). Il trattamento con piccole molecole del giorno da 0 a 7 era il seguente: Dorsomorfina 1 μm (millipore), SB431542 2 μm (bioscienza tocris) e chi99021 3, 3 μm (miltenyi biotec). Il Giorno 8, lo strato neurepiteliale è stato enzimaticamente disciolto usando Dissipasse (GIBCO, 1 mg ml-1), è stato collocato in fogli rivestiti con laminina e quindi modellati per 7 giorni con acido retinoico 0, 5 μm e 1 μm di portificazione. Il 14 ° giorno, i precursori del midolo spinale mn sono stati trattati con la portura 0, 1 μm per 4 giorni di più prima del terminale differenziato durante

10 giorni in compound e 0, 1 μm (vita enzo Scienze) per promuovere l’uscita del ciclo cellulare. Ai punti di tempo pertinenti, le cellule sono state raccolte per l’estrazione dell’RNA o sono state fissate nel 4% paraformaldeide per immunomarcaje.

estrazione di RNA e sequenziamento

Il kit di semplici cellule RNA di Promega Maxwell RSC che include il trattamento con Adnasa, insieme allo strumento Maxwell RSC, è stato utilizzato per le estrazioni dell’RNA. Per la convalida del QPCR, l’RNA è stato estratto con il Mini Kit Rneasy Plus (Qiagen). Il nanodrop è stato utilizzato per valutare la concentrazione dell’RNA e il rapporto 260/280, e il Bioanalyzer Agilent è stato utilizzato per valutare la qualità. I punteggi dell’integrità dell’RNA (Rin) erano > 8 per tutti i campioni utilizzati in questo lavoro. Le librerie rnaseq sono state preparate utilizzando il kit mRNA intrecciato TRUSQ (Illumina) con 1 μg di ingresso da Poly (A) + RNA. Quindi, i prodotti sono stati purificati e arricchiti dall’amplificazione PCR per creare le librerie di CDNA finale. Le biblioteche sono state inviate per sequenziamento ad alte prestazioni, sono stati eseguiti per 75 cicli in una cella di flusso rapida, nell’installazione centrale di NGS dell’Istituto neurologia utilizzando HISEQ2500. Per l’analisi delle trascrizioni nucleari e citoplasmatiche, è stato utilizzato il kit di purificazione citoplasmatico e nucleare (Norgen Biotek Corp).

RNA Sequencing Data

RNA Le letture RNA sono state ottenute in una singola sequenza di 50 BP da cinque fasi diverse dalla differenziazione MN dei campioni di controllo e del VCP MU (IPSC e GIORNI 7, 14, 21 e 35); I campioni sono elencati nei dati supplementari 1. Il numero di accesso dell’espressione genica omnibus (GEO) per le librerie RNA-Seq è GSE98290.Abbiamo anche ottenuto anche letture di sequenziali RNA singole e accoppiate, letture derivate da due studi indipendenti di differenziazione neurale in vitro di HESCS (GSE20301 22 e GSE86985 23); Due studi indipendenti sulle forme familiari di ALS causato da Sod1 mutanti (n = 5; 2 Sod14V di Sod14V e 3 Controllo Isoogenico derivati dal paziente in cui è stata corretta la mutazione; HB9 ACS Purificato MNS, GSE54409 27 o FUS (N = 6; 3 FUS R521G derivati dal paziente e 3 controlli sani MNS, GSE77702 28; Due dati RNA-Seq da ESC umani condivisi da MIHA Modic; Due SPMN fetale (E-MTAB-3871; NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium) e Adult SPMN (laser -Caggiorno SPMN; GSE76514 53) Campioni.

Expression Data pre-elaborazione

Letture singole e accoppiate per ciascuno dello studio sono state inizialmente allineate alle sequenze RNA ribosomali per filtrare letture che può provenire dalla contaminazione del RNA ribosomiale utilizzando Bowtie2 (-v 0) 57. Le restanti letture sono state allineate al genoma umano (H19) usando la giuntura consapevole allineatore Tophat288 con parametri predefiniti. Tutte le librerie generate in questo studio avevano < 1% RRNA, 90% Strilledness e > 70% Exon IC Legge letture.

Quantificazione del gene e caratterizzazione non supervisionata del set di dati

La quantificazione assoluta dei geni è stata eseguita utilizzando HTSEQ Count 59. L’analisi successiva è stata eseguita con il pacchetto statistico R versione 3.3.1.1.1 (2016) e Bioconductor Libraries versione 3.3 (RORE TEAM CORE. R: una lingua e un ambiente per il computing statistico. Vienna, Austria: R Fondazione per il calcolo statistico; 2013).

Prima dell’analisi del clustering non supervisionata dei 31 campioni di differenziazione MN, abbiamo identificato geni espressi in modo affidabile per ciascuna condizione (VCP MU o controllo a 39 anni, 7, 14, 21 e 35). Per un dato campione, l’istogramma del conteggio del gene del log2 è generalmente bimodale, con le modalità corrispondenti a geni non espressi ed espressi. I geni espressi in modo affidabile sono stati identificati adattando una miscela gaussiana bicomponente ai dati del gene del conteggio stimato del tronco con il pacchetto RCLUSC 60. Un gene è stato considerato affidabile in modo affidabile in una determinata condizione se la probabilità di essa appartenente alla classe non espressa era inferiore all’1% in ciascun campione appartenente alla condizione. 15, 989 I geni sono stati selezionati in base alla loro espressione rilevata in almeno una delle 10 condizioni (cioè cinque diversi tipi di tempo di restrizione del lignaggio per il controllo e il VCP MU). Successivamente, il quantificio normalizziamo le colonne della matrice del conteggio del gene con il pacchetto R Limma 61. Clustering gerarchico non supervisionato della matrice del conteggio del gene filtrato e normalizzato è stata eseguita con la correlazione del rango di Spearman come misura della distanza e l’algoritmo di clustering completo.

Abbiamo eseguito SVD dell’espressione dei 15, 989 geni attraverso le cinque fasi distinte di differenziazione MN da controlli sani e VCP MU. Abbiamo quindi selezionato i componenti che catturano a massimamente la varianza dell’espressione genica. Per visualizzare i vettori singolari giusti \ (\ sinistra \ {{\ wavertyarrow v _k} \ destra \} \ \ \} \), abbiamo tracciato l’espressione sull’asse verticale in funzione del tempo corrispondente a ciascun campione sull’asse orizzontale e da colorare tutto Campioni corrispondenti a controlli sani Grey e quelli corrispondenti a VCPMU in Magenta. Successivamente abbiamo identificato i geni i cui profili di espressione sono correlati (correlazione di Pearson tra profilo di espressione genica individuale e vettori singoli corretti) e contribuito (proiezione di ogni singolo profilo di espressione genica su vettori singolari corretti) con il profilo di espressione del profilo di espressione del profilo di espressione del profilo di espressione del profilo di espressione Vettori singolari. Al fine di identificare i geni rappresentativi per ogni vettore singolare, i geni sono stati classificati in base a entrambi i punteggi di proiezione e correlazione. I più alti (punteggi più positivi in entrambe le proiezioni e correlazioni) e più bassi (i punteggi più negativi in entrambi i geni di correlazione e proiezione) sono stati selezionati per ciascun vettore singolare utilizzando il clustering K-Media per l’analisi di arricchimento Vai a valle.

Analisi Di APA da RNA-Seq

Per l’identificazione dell’identificazione UTR alternativa a 3 “da RNA-Seq, è stata ottenuta una copertura a livello di nucleotidica a livello di nucleotidrico per ciascuno dei 31 campioni che utilizzano Genomecov dalla suite del BedTools 62. Le regioni successivamente trascritte sono state identificate utilizzando una finestra scorrevole attraverso il genoma che richiede una copertura minima di sette letture in oltre 80 posizioni per finestra di 100 BP; Le regioni limitrofe separate da regioni poco mappabili sono state unite come precedentemente descritte 13. I frammenti espressi sono stati quindi associati alla sovrapposizione di 3 ‘UTR utilizzando le ultime versioni HG19 Ensembl V75 63.Le regioni espresse isolate che non si sovrappongono a nessuna funzionalità sono state ulteriormente associate al più vicino 3 ‘UTR se (1) la funzione di annotazione più vicina non era nient’altro che un Utr 3’, (2) se la fila della regione espressa era in linea con il Filo del più vicino 3 ‘UTR e (3) se la distanza dal 3’ UTR era inferiore a 10’000 KB, che è la gamma della distanza intragenica. Le risultanti UTR estesi 3 ‘sono state sottoposte a un vasto filtraggio per escludere la potenziale trascrizione intragenica, le trascrizioni sovrapposte e gli introni trattenuti come precedentemente descritto 13. Alla fine abbiamo intersecato il segmento UTR più lungo da 3 ‘annotato con i dati RNA-Seq con una (A) annotazione del sito integrata utilizzando letture da librerie di sequenziamento di 3′-end nei campioni umani 64 per ottenere Putative Poly (A) nel segmento UTR più lungo 3’ di ogni trascrizione.

Abbiamo quindi utilizzato il numero di letture mappate a -300 NT terminale regione di ogni 3 ‘isoforme UTR come proxy per il livello di espressione ITOFORM ITOFORM 3’ per identificare le modifiche nell’uso di prossimali e politi distali (a) siti. La densità dei letture mappata nella regione del terminale -300 NT terminale di 3 ‘ITOFORM UTR è bimodale, con un picco a bassa densità che probabilmente corrisponde alla trascrizione in background cioè 3’ isoforme Utr di bassa abbondanza o 3 ‘isoforms Utr a cui letture sono state sparose, e un picco ad alta densità corrispondente ad espresso 3 ‘Intoforms UTR. Per identificare in modo affidabile espresso 3 ‘ISOFORMS UTR nello studio, una miscela gaussiana bicomponente è stata montata sui dati utilizzando il pacchetto RCLUST 60; Un isoform è stato chiamato in modo affidabile espresso se in entrambi i replicati aveva meno dell’1% di probabilità di appartenenza alla categoria di sfondo.

Al fine di identificare le trascrizioni che mostrano un marcato cambiamento nell’uso del sito POLY (A) tra le condizioni Abbiamo segnato le differenze in Poly (A) Proximale-to-distal (A) utilizzo del sito utilizzando i seguenti due punteggi:

\ (s_1 = {\ mathrm {log}} _ 2 \ sinistra ({\ frac {{\ I _ {\ MathRM {PROXIMAL}}}} {{I _ {\ MALATRM {DISTAL}}}}}} Destra) _ {\ MALATRM {COND1}} – {\ MATERM {LOG}} _ 2 \ SINISTRA ({\ FRAC { {I _ {\ MathRM {PROXIMAL}}}} {{I _ {\ MALATRM {DISTAL}}}}} \ DESTRA) _ {\ MALAMM {COND2}} \)

\ (s_2 = \ frac {{I _ {\ MathRM {PROXIMAL}}}} {{I _ {\ MATHRM {PROXIMAL}} + I _ {\ MATHRM {DISTAL}}}} _ {\ MALATRM {COND1}} – \ FRAC {{I _ {\ MALATRM {PROXIMAL}}}} {{I _ {\} MathRM {PROXIMAL}} + I _ {\ MATHRM {DISTAL}}}} _ {\ MALATRM {COND2}} \ IN \ SINISTRA \)

The Statistical Il significato delle variazioni del rapporto del sito Poly (A) prossimale-a distale tra due condizioni è stata valutata dal test del conteggio esatto di Fisher utilizzando i conteggi di lettura RAW riassunti di Promoter-Proximale Versu S promotore-distale 3 ‘Intoforms Utr originari delle condizioni. Abbiamo regolato il controllo P -Value per il falso tasso di scoperta (FDR) di 0,01. Abbiamo limitato la nostra analisi su trascrizioni Ensembl contenenti almeno due Utrs 3 ‘generati da poliaodenilazione tandem espressa in condizioni di interesse. I turni prossimali sono stati quindi selezionati quando \ (S_1 \ Le – 1 \), \ (S_2 \ LE – 15 \% \) e FDR < 0,01; Il turno distale è stato selezionato quando selezionato quando \ (s_1 \ ge 1 \), \ (s_2 \ ge 15 \% \) e fdr < 0.01.

Splicing Analisi

L’identificazione di tutte le classi di come eventi nella differenziazione MN è stata eseguita con la pipeline RNA-Seq Vast-Tools 21. Per quanto riguarda un evento da considerare differenzialmente regolato tra due condizioni, abbiamo richiesto una media minima ΔPSI (tra i replicati accoppiamenti) di almeno il 10% e che la trascrizione destinata dall’evento di splicing in questione per essere espresse in modo affidabile in tutti i campioni dal Condizioni confrontate Ie sufficiente copertura delle letture in tutti i campioni di interesse. Abbiamo condotto il prossimo Viewer Genomics Integrative Genomics (IGV)-Guidare la curazione manuale per rimuovere la copertura bassa IR ottenendo 167 eventi IR ad alta confidenza. L’analisi focalizzata IR è stata eseguita successivamente su questi 167 eventi IR per i quali è stata calcolata una percentuale di IR in quanto la frazione della mappatura delle introna si legge al numero medio di mappatura delle letture agli esoni adiacenti 5 ‘e 3’ normalizzati alla lunghezza del rispettivi introni ed esoni. Un test del conteggio di Fisher P -Value è stato ottenuto durante il test per IR differenziale tra condizioni.

Análisis diferencial de la expresión génica.

Per analisi di espressione genica differenziale abbiamo corso Kallisto 54 e Sleuth 55. Kallisto è stato utilizzato per (1) Costruisci un indice di trascrizione dall’ensembl GRC38 Release 85 Homo Sapiens Transcriptome (-K 31), (2) Pseudo-allinea L’RNA-Seq legge il Transcriptome e (3) quantificare gli abbondanti della trascrizione (-b 100-Single -L -L 275 -S 50-RF-STRONDED). Avanti abbiamo identificato geni differenzialmente espressi con Sleuth. L’analisi successiva è stata eseguita con la versione statistica R versione 3.3.1 (2016) e le biblioteche bioconduttori Versione 3.3 (RORE TEAM CORE. R: una lingua e un ambiente per il computing statistico. Vienna, Austria: R Fondazione per il calcolo statistico; 2013). Prima di selezionare geni differenzialmente espressi, abbiamo identificato geni espressi in modo affidabile.Kallisto produce l’abbondanza della trascrizione, e così abbiamo calcolato l’abbondanza di geni riassuntando il conteggio grezzo stimato delle isoforme costituenti per ottenere un singolo valore per gene. Per un dato campione, l’istogramma del conteggio del gene / trascrizione del tronco è generalmente bimodale, con le modalità corrispondenti a geni non espressi ed espressi. I geni / trascritti espressi in modo affidabile sono stati identificati accordando una miscela gaussiana a due componenti per la trascrizione del conteggio del conteggio del conteggio di Log2 e i dati geni r con il pacchetto Mclust 60; È stato aggiunto un pseudocontare 1 prima della trasformazione del log2. Un gene è stato considerato affidabile in modo affidabile in una determinata condizione se la probabilità di essa appartenente alla classe espressa era superiore a 0,1 in ogni campione appartenente alla condizione. Infine, i geni che mostravano un’espressione differenziale di Twofold del registro e un P -Value < 0,05, e che sono stati espressi in modo affidabile in mutante o di controllo VCP o condizioni di controllo erano considerati in modo significativo.

Analisi di arricchimento Vai

Go Analisi dell’arricchment è stata eseguita utilizzando il classico test di Fisher con il pacchetto Topgo Bioconductor 65. Sono stati considerati solo termini passati contenenti almeno 10 geni annotati. Un P -Value di 0,05 è stato utilizzato come livello di significato. Sul figure, i migliori termini Vai significativi sono stati selezionati manualmente rimuovendo i termini e i termini di GO ridondanti che contengono meno di cinque geni significativi.

Análisis de Red

Informazioni su interazione proteica sperimentali-proteine stato recuperato dal database delle stringhe 66 e visualizzato in Cytoscape 67, 68.

Mappatura dei dati Eclip

I dati Eclip RAW sono stati scaricati da Codifica 36, 37. Prima dell’allineamento, la rimozione dell’adattatore a due stadi è stata eseguita utilizzando CULATAPAT in base alla procedura operativa standard ECLIP ECLIP. Un approccio a due stadi è stato utilizzato anche per l’allineamento. Innanzitutto, Bowtie2 è stato utilizzato per rimuovere le letture allineando a RRNA o TRNA. Poi, la stella è stata utilizzata per allineare le retti restanti a Grch38, con solo letture di mappatura in modo univoco mantenute. I duplicati PCR sono stati crollati in base agli unici identificatori molecolari e sui luoghi di mappatura. La posizione di crosslink a risoluzione nucleotidica è stata calcolata come coordinata che precede immediatamente l’evento di troncamento della trascrizione inversa.

trascrizione inversa, QPCR e convalida IR

La trascrizione inverso è stata eseguita utilizzando il primo filo di ritorno Kit di sintesi di cDNA (termofissore scientifico) utilizzando 1 μg di rna totale e esaminatori casuali. Il QPCR è stato eseguito utilizzando il mix di powerUP SYBR Green Master Mix (ThermoFisher Scientific) e il sistema Agilent MX3000P QPCR o il sistema PCR di QuantiStudio 6 Flex PCR (Biosystems applicati). I primer utilizzati sono elencati nella tabella supplementare 2. L’amplificazione specifica è stata determinata dall’analisi della curva di fusione e dall’elettroforesi di gel di agarosio dei prodotti PCR. Sono state utilizzate coppie di primer con efficienza del 90-110%. Per ciascuna convalida IR per schermare tre primer sono state utilizzate le coppie di primer: (1) Primer Coppia F1 R1 (abbondanza di introna, attraverso la giunzione di Exon-Exon) è stata utilizzata per analizzare i livelli di espressione genica; (2) Primer Coppia F2 R2 (un primer su un exon fiancheggiando l’introne da analizzare, l’altro sull’introna) è stato utilizzato per valutare i livelli di IR; e (3) PRIMER PACIA F3 R2 (entrambi i primer sugli esoni fiancheggiano l’introne di interesse, se possibile progettato attraverso lo svincolo di Exon-Exon) è stato utilizzato per misurare i livelli della trascrizione. I campioni Rt-Minus sono stati utilizzati come controlli negativi. I livelli di IR (Primer Pair F2R2) sono stati normalizzati sul livello di espressione di ogni singolo gene (paio di primer f1r1). I livelli di espressione genica sono stati misurati utilizzando il metodo DDCT utilizzando tre geni di pulizia (GAPDH, POLR2B e UBE2D3).

Análisis del Ciclo Celular

L’analisi del ciclo cellulare è stata eseguita mediante citometria del flusso secondo Protocolli standard. In breve, le cellule sono state dissociate utilizzando accutasi o tripsina (tecnologie di vita), lavate e fissate in sospensione utilizzando il 70% di etanolo freddo. Le cellule sono state macchiate usando lo ioduro di propidio (PI, 50 μg ML -1, Sigma Aldrich) in presenza di rnase A (10 μg / ml, sigma alderich). Le cellule sono state analizzate utilizzando un calibur BD Facs (BD Bioscience). I doppietti sono stati esclusi dall’analisi e 10, 000 eventi sono stati raccolti nel cancello a cellule singole per campione. I dati del ciclo cellulare sono stati analizzati utilizzando il modulo Multiicycle di FCS Express 6 (software De Novo).

Animali, modelli transgenici e lavorazione dei tessuti

Tutti gli esperimenti animali descritti in questo studio sono stati trasportati Fuori dalla licenza dell’Hard Office del Regno Unito, e sono stati approvati dal pannello di revisione etica dell’Istituto di Neurologia. Sono state utilizzate le seguenti linee mouse transgeniche: (1) topi SOD1 G93A (B6SJL-TG (Sod1 * G93A) 1GUR / J, Jackson Laboratories) (2) Mutante eccessivamente umano VCPA232E sono stati generati da J. Paul Taylor et al, st Ospedale di ricerca dei bambini Jude, Memphis, TN, USA e sono descritti in Custer et al, 2010 69 e allevato allo sfondo del nero C57 nero 6 (C57 / B6).Sfondo misto C56BL / 6-SJL Wild-Type (Jackson Laboratories) è stato utilizzato come controllo. Per la collezione di tessuti, gli animali sono stati iniettati con anestesia terminale (sodio Pentobarbital sodio, euthatal) e sono stati perforati in via transcidentalmente con paraformaldeide del 4%. La regione lombare del midollo spinale è stata rimossa e post-fissata con paraformaldeide del 4% e crioprotetto durante la notte con saccarosio del 30%; Cryosections in serie 10 o 20 μm sono stati tagliati per la colorazione immunofluorescenza.

Tessuto post-mortem umano

Sezioni di tessuto surgelato a scatto derivate da midoi spinali lombari di tre età e sessuali I pazienti sporadici ALS, la durata della malattia 1, 2 e 2 anni, rispettivamente, e tre età e genere abbinati i soggetti di controllo con nessuna storia di malattia neurologica (n = 3 pazienti e 9 sezioni; mezzi di età: 68 + 6.55 e 69,5 + 2,12 anni ; Vedi tabella supplementare 3). I tempi di ritardo del congelamento a scatto sono stati anche paragonabili tra i gruppi (ritardo: 25 + 5.29 e 29.33 + 9.29 h, per i pazienti con controllo e sals, rispettivamente). I campioni del midollo spinale sono stati ottenuti dalla Banca del tessuto Neuroresource, dall’Istituto UCL di Neurologia, Londra, Regno Unito. I campioni sono stati donati alla Banca dei tessuti con il consenso informato del donatore dei tessuti scritti in seguito a revisione etica dal comitato NHS NRESS Londra-Central-Central e immagazzinato in una licenza del settore della ricerca dell’Autorità del tessuto umano del Regno Unito (HTA).

Immunolabelling e Imaging

Per immunocitochimica e immunoistochimica, i campioni sono stati bloccati nel 10% di siero di capra normale (NGS) o del 10% del normale siero di asino (NDS) come appropriato e permeabilizzato in 0,3% tritone X-100 (Sigma-Aldrich; in PBS) a temperatura ambiente (RT) per 1 ora. L’immunolabelling è stato eseguito con anticorpi primari in NGS (5%) e Triton X-100 (0,1% in PBS) a 4 ° C durante la notte seguiti da anticorpi secondari specifici per specie per 1 ora in RT e DAPI Counterstain Nuclear (100 ng / ml) per 10 minuti a RT. Per il fissaggio e la permeabilizzazione dei campioni post-mortem umani in metanolo freddo (-20 ° C, 20 min) è stato eseguito prima dell’immunostrazione. Gli anticorpi primari sono stati diluiti come segue: Coniglio Anti Olig2 (Millipore, AB9610) 1: 200; Mouse Anti SMI32 (Bioscienze Cambridge, SMI-32R-500) 1: 1000; Capra Anti Chat (Millipore, AB144P) 1: 100; Coniglio Anti Pax6 (Biolegend, 901301) 1: 300; Mouse e coniglio Anti SFPQ (ABCAM, AB11825 e AB38148, rispettivamente) 1: 100; Mouse e Coniglio Anti Beta-Tubuliniii (Biolegend, 801201), Mouse Anti Lim3 (DSHB, 67.4E12) 1:50; Pollo Anti NKX2.2 (DSHB, 74.5A5) 1:50. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale a scansione laser 710 (ZEISS) o il sistema di screening ad alto contenuto di Opera Phenix (Perkin Elmer). Per l’analisi delle immagini, i fiji o il sistema di analisi dell’immagine Columbus (Perkin Elmer) sono stati utilizzati.

Western blotting

western blotting è stato eseguito in base ai protocolli standard (Biorad). I lisati di celle intere sono stati ottenuti da pellet cellulari snap-congelati utilizzando il buffer di lisi gratuito di Lisis-M EDTA (Roche). La concentrazione di proteine è stata determinata da Pierce BCA Assay (Thermofisher Scientific) e utilizzato per massimizzare il carico uguale attraverso i gel (~ 9 μg per corsia). L’elettroforesi è stata eseguita sul gel proteico del 4-12% CRITERION ™ XT BIS-TRIS (Biorad) a tensione costante (200 V, un’ora) e seguita da trasferimento di proteine a una membrana nitrocellulosa (Biorad). Il blocco è stato eseguito in PBS, 0,1% Tween, il latte secco del 5% polvere (meraviglia) a RT per un’ora seguita da un’incubazione primaria anticorpale durante la notte a 4 ° C. Gli anticorpi primari sono stati diluiti in PBS, dello 0,1% Tween, il latte secco del 5% in polvere come segue: Mouse Anti SFPQ (ABCAM, AB11825) 1: 250; Coniglio Anti TLS / FUS (ABCAM, AB84078) 1: 500; Coniglio Anti DDX39 (Sigma Aldrich, SAB2700315) 1: 500, Coniglio Anti Dars (ABCAM, AB182157) 1: 1000; Mouse Anti GLN1 (anticorpi online, AA 1-373) 1: 1000; Coniglio Anti TDP-43 (ABCAM, AB133547) 1:10, 000; Mouse Anti GAPDH (Tecnologie della vita, CLONE 6C5, AM43000) 1: 5000. Per le membrane di rilevamento sono state incubate con anticorpi fluorescenti a infrarossi specifici per specie (IRDYE, LICOR) per un’ora a RT e IMaged utilizzando un sistema di imaging di Odyssey FC (LICOR).

Disponibilidad de Datos

Il numero di accesso GEO per le librerie RNA-Seq di nuova generazione è GSE98290 (//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.Ci?ACC = GSE98290). Abbiamo anche ottenuto anche letture di sequenziali RNA singole e accoppiate, letture derivate da due studi indipendenti di differenziazione neurale in vitro di HESCS (GSE20301 22 e GSE86985 23); Due studi indipendenti sulle forme familiari di ALS causato da Sod1 mutanti (n = 5; 2 Sod14V di Sod14V e 3 Controllo Isoogenico derivati dal paziente in cui è stata corretta la mutazione; HB9 ACS Purificato MNS, GSE54409 27 o FUS (n = 6; 3 FUS R521G derivati da paziente con comando MNS, GSE77702 28; Due dati RNA-Seq da ESC umani condivisi da MIHA Modic; Due SPMN fetal (E-MTAB-3871GENE espressione omnibus; NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium; // www .ebi.ac.Regno Unito / ArrayExpress / Experiments / E-MTAB-3871 /) e SPM Adult (SPMN catturato laser; GSE76514 52, 53) Campioni. Ulteriori informazioni e richieste di risorse e reagenti dovrebbero essere dirette e saranno soddisfatte dal contatto piombo, Rickie Patani ().

Expresiones de Gratitud

Gli autori desiderano ringraziare i pazienti per donazioni di fibroblast. Ringraziamo anche Miha Modic per aver condiviso i dati HESC RNA-Seq, Martina Hallegger e Roberto Simone per il loro input relativo al Primer Design, ANOB M Chakrabarti per la condivisione di file di eclip allineati. Ringraziamo Benjamin Clarke, Mhoriam Ahmed e membri dei laboratori di Schiavo e Greensmith per un prezioso supporto tecnico. Grazie a Selina Wray per aver gentilmente fornito l’accesso alle linee IPSC mutanti VCP. Questo lavoro è stato supportato dal Francis Crick Institute, che riceve il suo finanziamento principale da Cancer Research UK (FC010110), il Consiglio di ricerca medica del Regno Unito (FC010110) e il Wellcome Trust (FC010110). Riconosciamo che Wellcome Trust Finding to RP, a NML e JU, un premio MRC Emedlab Medical Bioinformatics Infrastructure Award a NML (MR / L016311 / 1), l’UCL Grand Challenge Award (CEH), una Fellowship di ricerca post-dottorato Marie Curie (657749- Neurooutr) e una compagnia di mobilità postdoc avanzata della Swiss National Science Foundation (P300Pa_174461) a RLNML è un leader di Winton Group in riconoscimento del sostegno della Fondazione caritatevole di Winton verso la creazione del Francis Crick Institute. Riconosciamo la piattaforma DPUK / MRC per la fornitura dell’Opera Phenix per l’analisi IPSC ad alta velocità e il generoso supporto dal National Institute for Health Research University College London Ospedali Centro di ricerca biomedica.

Materiale Suplementario Electronaco.

1. información suplementaria

2. descripción de archivos suplementarios adicionales

3. DATOS SUPLEMENTEOS 1