Soggetti
- mitosi
- microtubuli
Riepilogo
Il mandrino mitotico è costituito da due tipi di microtubuli. I microtubuli dinamici del cinetocoros catturano i cinetocoros, mentre i microtubuli interpolari stabili servono come colonna vertebrale strutturale che collega i due poli del mandrino. Si è creduto che entrambi siano indispensabili per la divisione cellulare in eucarioti. Qui mostriamo che i microtubuli interpolari sono dispensabili per la seconda divisione della meiosi nel lievito di fissione. Anche quando i microtubuli interpolari sono interrotti da un farmaco depolverante in microtubulo, i poli del mandrino sono separati e i cromosomi secernono il palo nella seconda divisione della meiosi nella maggior parte dei cigotes, producendo spore praticabili. La membrana di Forespora, che incapsula il nucleo nella seconda divisione della meiosi e è guidata da proteine sintiniche e all’avanguardia, è responsabile dello svolgere eventi meiotici in assenza di microtubuli interpolari. Inoltre, durante la seconda divisione fisiologica della meiosi senza il disturbo dei microtubuli, l’assemblea della membrana delle strutture di spore strutturalmente alla separazione del polo del mandrino e della divisione nucleare, generando una forza sufficiente per la separazione del polo del mandrino e dei successivi eventi Indipendentemente dai microtubuli interpolari.
Introduzione
I microtubuli hanno funzioni essenziali nella divisione cellulare di eucarioti. Il mandrino mitotico è composto da due tipi di microtubuli: microtubuli Kinetochore (ktmts) e microtubuli interpolari (IPMS) 1, 2, 3. Il KTMT ripetere dinamicamente la polimerizzazione e la depolimerizzazione dei dimeri α / β-tubulina, catturare e tirando i cinatocintrici cromosomici. Al contrario, IPMT stabile serve come rete trunk strutturale che collega i due poli 4 del mandrino.
La necessità di microtubuli del mandrino per la segregazione dei cromosomi è stata dimostrata in molti studi negli ultimi decenni , l’uso di farmaci o trattamento con freddo per depoliminare i microtubuli, nonché l’uso di cellule mutanti difettose nell’organizzazione di microtubuli. Il requisito Ktmts sembra evidente, dal momento che un guasto nell’Unione dei microtubuli Kinetochore può causare aneuploidy 5. È noto che la proteina ASE1 / PRC1 associata ai microtubuli raggruppa l’IPMT nella zona centrale del mandrino nella fine mitosi (anafase) 6, 7, 8, 9. La disfunzione di ASE1 / PRC1 non influisce sull’unione dei microtubuli Kinetochore nel metafase, ma provoca un crollo del mandrino nell’Anafase, che porta spesso alla produzione di aneuploidi. L’aneuploidy può portare a instabilità genomica e, pertanto, è strettamente correlata alla tumorigenesi 10. Pertanto, si ritiene che entrambi i tipi di microtubuli siano indispensabili per la corretta segregazione cromosomica negli Eucarioti. La maggior parte di questa conoscenza, tuttavia, è basata su studi di cellule mitotiche, ed è compresa poco se questa proprietà è condivisa con cellule meetiche.
In questo studio, facciamo osservazioni di cellule viventi nelle cellule. Mitotico Come meiotica del lievito di fissione Schizosaccaromyces Pombe per rivalutare l’importanza biologica dei microtubuli nella segregazione dei cromosomi. Aggiungiamo un farmaco depoling di microtubule, metil-2-benzimidazolo-carbamato (MBC), alle cellule di tipo selvaggio prima della divisione mitotica o meiotica e monitorare la progressione del ciclo cellulare utilizzando la microscopia a fluorescenza in tempo reale (figura Supplementary S1A. La vita di Pombe ciclo). Abbiamo scoperto che IPMT è dispensabile nella seconda divisione della meiosi (MII), contro la convinzione generale di un requisito assoluto dei microtubuli. La separazione del polo del mandrino e degli eventi successivi si è verificato normalmente anche in assenza di IPMT in IMA. Inoltre, identifichiamo che la membrana di Foreporas, che incapsula il nucleo, è responsabile della generazione della forza per separare i poli invece dei microtubuli. Inaspettatamente, anche quando i microtubuli erano intatti, l’eliminazione della membrana delle spore ha ridotto la proporzione della separazione del polo del mandrino. Proponiamo che la membrana di Foreporas sia il primo materiale non microtutubolare che produce la forza per la divisione cellulare in condizioni fisiologiche.
I microtubuli interpolari sono dispensabili in IMA.
I microtubuli sono stati visualizzati con la proteina fluorescente verde (GFP) etichettata con α2-tubulina (ATB2), il corpo del polo del mandrino (SPB; un centrosoma fungine equivalente) è stato contrassegnato con la proteina fluorescente cian ( CFP), il componente medio SFI1 SFI1 (SFI1-CFP) (SFI1-CFP) e il cinetocoro sono stati contrassegnati con la fabbrica MIS6 (MIS 6-2MCH) taggata da 2 m. Durante la mitosi normale in assenza di MBC, i microtubuli che nucleavano i due SPB interagirono a formare un mandrino bipolare robusto e SPP 11, 12 (Fig. 1a). Fino alla metafase, la regione centrale del mandrino mostrava un segnale GFP-ATB2 relativamente tenue (12 min), che riflette il fatto che diversi ktmt corti si trovano vicino a SPB, mentre IPMT ha collegato i due SPB 4 (fig. Ulteriore S1B) per uno schema). Nell’anafase B (22 min), il mandrino è stato allungato attraverso l’interdigitante IPMT scorrevole nella zona centrale del mandrino. Proprietà simili sono state osservate per il mandrino in meiosi I (MI) e nel MII (figura 1b, fig. Supplementary S1C). Aggiungiamo MBC e osserviamo le cellule che avevano appena inserito la mitosi. Come previsto, la nucleazione dei microtubuli della SPB è stata gravemente inibita e il SPB non si è mai separato in presenza di MBC (90 min, fig. 1c e fig. S1D supplementare), che conferma l’importanza dei microtubuli nella divisione mitotica. Al contrario, quando gli MBC sono stati aggiunti ai Cigotes prima del MII (0 min, figura 1D), gli SPB potrebbero essere separati, sebbene il microcbububoulazione fosse significativamente inibito dal MBC (Fig. S1E complementare). Un segnale GFP-ATB2 è stato rilevato solo attorno ai pali del mandrino, che indica che gli IPMT che collegano i due SPB sono stati interrotti (42 minuti). In presenza di MBC, sono stati rilevati solo i microtubuli brevi associati a cinatocintrici (figura 1E), suggerendo che potrebbero servire come KTMT. I cinetocosori sono stati ugualmente separati ai due poli nella maggior parte delle cellule trattati con MBC (vedi sotto), che indica che i microtubuli corti erano sufficienti per la cattura e la connessione dei cinetocoros a SPB. Non solo la separazione di SPB e la segregazione dei cromosomi, ma anche la divisione nucleare è stata effettuata con successo in presenza di MBC (figura 1F).
(a – e) cellule vividi Immagini di celle da indossare GFP-ATB2 (microtubuli, verde), MIS6 -2Mcherry ( Mis 6-2mch, Kinetochores; rosso) e SFI1-CFP (SPB, BLU). Le immagini della lasso di tempo celle che sperimentano la mitosi normale (A) e la meiosi II (MII) (B) sono mostrate. Per le cellule MII in B e D, le regioni scartata dei Cigotes sono ingrandite come immagini di Time Lapse. La forma delle cellule è delineata in curve di punti; n = 10. (c) È stato aggiunto un farmaco di depolimerizzazione del microtubule, MBC, a una cella che entra nella mitosi (0 min), poco prima della separazione con SPB. MBC inibiva la formazione di microtubuli e separazione da SPB fino alla fine dell’osservazione (90 min). (D) MBC è stato aggiunto a una cella che entra nel MII (n = 14). I suggerimenti della freccia indicano che si è verificata una separazione SPC anche in assenza di IPMT. (e) Kymografi del lasso di tempo dei mandrini durante il MII, senza (a sinistra) e con (a destra) MBC (n ≥10). Le regioni rettangolari contenenti gli assi sono rifinite dalle immagini del lasso di tempo e si allineano nel tempo. Spbs e cinetoches separati anche in assenza di IPMT (a destra). La lunghezza delle frecce corrisponde a 5 minuti. (f) La divisione nucleare dei cigotos MII senza (sinistra) e con (a destra) MBC è stata monitorata con il segnalino da avvolgimento nucleare CUT11-3MRF (rosso), insieme a GFP-ATB2 (verde) (n ≥6). Le regioni incorniciate sono ampliate come le immagini Time Lapse qui sotto. (G) CUT7-446 Zigot mutanti sottoposti a MII segnato con GFP-ATB2 (verde), MIS 6-2MRFP (rosso) e SFI1-CFP (blu) (N = 6). Durante il MII, le SPB sono state separate e il mandrino bipolare è stato formato a temperatura restrittiva (32 ° C), in cui le cellule mitotiche fallissero nella separazione di SPB con il mandrino monopolare. Barre della scala, 2 μm.
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Perché è possibile che l’effetto del MBC sia parziale e che rimane una quantità non rilevabile di IPMT e possiamo portare alla separazione Cabo Dai eventi SPB e successivi, esaminare il mutante CUT7 nel nostro sistema. CUT7 è l’ortogiorno di fissione lievito del BIMC / EG5 / Kinesin-5 Kinesin 12, 13. CUT7 collega i microtubuli Antiparale che emana da ciascun SPB e scivolano i microtubuli verso l’esterno, separando così gli SPB. Durante la mitosi, gli spbs nel taglio mutante sensibile alla temperatura7-446 non sono stati separati a temperatura restrittiva, che ha portato alla generazione di mandrini monopolari 13 (fig. S2 supplementare).Al contrario, gli SPB sono stati separati durante il MII in Cigotos da 7 a 446 a temperatura restrittiva (figura 1G). Ciò dimostra che la separazione di SPB durante il MII non è basata sull’interazione IPMT mediata da CUT7. Pertanto, concludiamo che IPMTS sono dispensabili quando si eseguono eventi di fase essenziali, come la separazione SPF, la segregazione dei cromosomi e la divisione nucleare in MII (fig. S3 complementare).
Normale segregazione dei cromosomi in assenza di IPMTS IN MII
Le cellule mititiche trattate con un’alta dose di MBC generalmente provocano un fenotipo letale “tagliato”, che mostra una citochinesi forzata con cromosomi crudi 14, 15, 16. Per determinare se la divisione IPMT indipendente osservata durante l’IMA potrebbe comportare una separazione anormale dei cromosomi, sono stati etichettati i centrometri del cromosoma II (CEN2) con GFP (il sistema CEN2 – GFP 17) e le cellule sono state girate per creare i kymografi . Durante la mitosi in assenza di MBC, un singolo punto SFI1-cfp è stato suddiviso nell’avvio mitotico (Fig. S4A supplementare). Allo stesso tempo, il CEN2 – GFP si concentra cominciando a oscillare tra le due spbe della metafase. I punti CEN2 – GFP sono stati quindi separati verso ciascun SPB (Anafase A), e la distanza inter-spb è aumentata, riflettendo l’allungamento del mandrino (Anafase B) 17, 18. Un simile cinetica è stato osservato durante il MII (WT Mii, -MBC, Fig. 2a). Quando MBC è stato aggiunto all’inizio del mitotico, gli Spbs hanno smesso di dividere e il CEN2-GFP focalizzato cessò di oscillare (Fig. S4B complementare), che ha causato un fallimento nella segregazione dei cromosomi. Al contrario, l’80% dei cigoti dell’OMS MII trattati con MBC Segregatato a due poli CEN2-GFP (WT MII, + MBC, figura 2a, B), che indica di nuovo che il MII sia molto meno sensibile alla MBC rispetto alla mitosi e all’im .
(a) kymografi di Le celle di tipo selvaggio (WT) e PAD2 sono state sottoposte a chi prova MII in assenza (-) o presenza (+) di MBC (n ≥14). I centruomeri del cromosoma II sono stati contrassegnati con GFP (CEN2-GFP), e il suo SPB è stato controllato con SFI1-CFP (rosso). MBC è stato aggiunto prima della separazione SPC. La lunghezza delle frecce corrisponde a 5 minuti. (b) L’accuratezza della segregazione dei cromosomi durante IMS in Wild-Type e MAD2 è stata quantificata cellule (stagno non accoppiata, n ≥14). Le immagini tipiche sono anche mostrate per la segregazione di uguali e ineguali CEN2-GFP. (c) La durata del MII è stata misurata al momento del monitoraggio dei segnali CUT11-3MRFP. CUT11-3MRFP Faretti formati nella SPB all’ingresso di MII e sono scomparsi all’inizio dell’Anafase. Le linee del diagramma della scatola e dei baffi ridotti sono il valore massimo, il percentile 75, la mediana, il percentile 25 e il valore minimo (n ≥16). Gli asterischi indicano valori atipici. (d) Posizione di Mad2 durante il MII in assenza (a sinistra) o presenza (a destra) di MBC (n ≥10). Mad2-Mcherry (Mad2-mch, rosso) è stato monitorato con MIS6-2GFP (verde) e SFI1-CFP (blu). Il tempo in cui i riflettori PAD2 sono apparsi per la prima volta nelle cinatocintrici è designato come 0 min. L’aggiunta di MBC ha mantenuto MAD2 nei cinetocoras per più di 12 minuti, a quel punto il focolaio Mad2 si è spostato a SPB in assenza di MBC. Barre di scala, 2 μm. (e) La durata della posizione di Mad2 nei cinetocoros con o senza MBC è stata determinata dalle osservazioni in d. Tieni presente che la posizione PAD2-MCARRY in SPB, il che significa che un rilascio di attivazione del punto di controllo, non viene contato qui. Le linee nel diagramma della scatola e i baffi ridotti sono il valore massimo, il percentile 75, la mediana, il percentile 25 e il valore minimo (n ≥10). Gli asterischi indicano valori atipici. (f) La progressione meiotica della coltura sincrona diploide Pat1-114 è stata monitorata contando il numero di nuclei per cella in ogni momento. La meiosi è stata indotta dal cambiamento di temperatura (a 0 h). MBC è stato aggiunto quando la popolazione di cellule binucleate (post-MI) era al massimo (a 3,3 ore). (g) la redditività delle spore delle cellule diploidi PAT1-114 trattate con o senza MBC come in F è stata esaminata dall’analisi della tetrata (n > 300).
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In mitosi e IM, il punto di controllo del gruppo mandrino (SAC) funziona per monitorare la connessione dei microtubuli al cinetocorus. I componenti del sacco, tra cui Mad2, riconoscono i cinetocreggi uniti e inibiscono l’attivazione del complesso / ciclosoma del promotore Anafase, in modo che le cellule possano aspettare in metafase fino a quando l’Unione migliora 19. Durante la mitosi, MBC causa difetti nel mandrino e sul sac attivo 15, 20. È possibile che l’attività sac sia necessaria per IPMT indipendente IMI causata da MBC.In questo modo, monitoriamo il comportamento CEN2-GFP nel mutante di rimozione MAD2 (Mad2 Δ). In assenza di MBC, lo Zigotos Mad2 ha sperimentato una normale segregazione cromosomica come nei cigotes di tipo selvaggio (Mad2 Δ MII, -MBC, figura 2a, B). Quando MBC è stato aggiunto all’inizio del MII, ~ 60% della fiera MAD2 Zigotes ha mostrato una segregazione ineguale di CEN2-GFP, che era significativamente superiore alla segregazione ineguale ~ 20% che si è verificata in cigotes di tipo selvaggio (figura 2b). I cigotos di tipo selvaggio trattati con MBC durante il MII hanno mostrato un ritardo all’inizio dell’Anafase II (Fig. 2c). Questo è stato cancellato eliminando Mad2, il che indica che il ritardo era dovuto all’attivazione del sacco (Fig. 2c). Secondo questo, Mad2-Mcherry ha mostrato una posizione prolungata di cinetocoros in sigarei di tipo selvaggio in presenza di MBC (Fig. 2D, E). Questi risultati indicano che, durante il MII in presenza di MBC, Mad2-SAC garantisce il corretto legame dei microtubuli alle cinatocintrici, suggerendo che i restanti microtubuli corti sopravvissuti dopo l’aggiunta del MBC fungono effettivamente come Ktmts e che il tuo adeguato L’attaccamento a Kinetotocores disattiva la sorveglianza mad2-sac (fig. s3e, f) supplementare. Questi risultati indicano inoltre che è improbabile che la divisione indipendente di IPMT sia una mancata corrispondenza deregolata che porta a una separazione casuale di cromosomi e il distacco del nucleo inopportunamente, come le mutazioni di taglio letale.
Avanti, noi Valutare se il trattamento con MBC durante il MII potrebbe influenzare la redditività delle spore. Il mutante PAT1-114 è stato utilizzato per indurre la meiosi sincronizzata 21, 22, 23. MBC è stato aggiunto a 3,3 ore dopo l’induzione della meiosi, quando la popolazione cellulare con due nuclei (cioè post-MI) era al massimo (~ 90%, figura 2F). L’MBC ha causato una riduzione della redditività delle spore al 50% di quella delle cellule trattate simulate (figura 2G). Questo valore può riflettere la fedeltà della segregazione cromosomica: la frequenza di fedeli segregazione di CEN2-GFP nelle cellule MCI trattata con MBC è stata dell’80% (figura 2b), che implica che la frequenza stimata della stessa segregazione dei tre cromosomi sarebbe 51% ((0,8) 3 = 0,512), che è paragonabile alla redditività delle spore osservate in presenza di MBC.
La membrana Forespora è responsabile per il MII senza IPMS.
(a) immagini a cellule vividi da cigotos MII che Portan GFP-PSY1 (Spore membrana, verde) e CFP-ATB2 (rosso) in assenza di MBC (sopra) (n = 18). MBC è stato aggiunto prima dell’aspetto di MII (in basso) (n = 18). La separazione SPC si è verificata in concomitanza con l’inizio dell’assemblea della membrana delle spore. (B) Mii è stato girato da Spo15 celle di trasporto che trasportano GFP-ATB2, Miss6-2Mcherry (Miss 6-2mch) e SFI1-CFP in presenza di MBC (n = 10). Gli SPB non si erano separati alla fine dell’osservazione (94 min). (c) il doppio mutante SPO15 Δ CUT7-446 che porta GFP-ATB2, MISS6-2MCheRRY e SFI1-CFP è sottoposto a MII a temperatura restrittiva.Il doppio mutante ha esposto il fenotipo del fenotimo del mandrino monopolare (n = 8), che indica che la membrana del foresporama ha un ruolo cruciale nella formazione del mandrino bipolare durante il MII nelle cellule CUT7-446. (d) Modelli di segregazione delle sorelle Chromaties durante il MII in sigarei di tipo selvaggio e MEU14 Δ SPN6 monitorato monitorato da CEN2- GFP con SFI1-CFP (test a T-T-Tails a due code, n ≥14). Le immagini tipiche sono anche mostrate per la segregazione di uguali e ineguali CEN2-GFP. (e) la divisione nucleare durante il MII dei cigotos di tipo selvaggio e MEU14 Δ SPN6 Δ è stato monitorato da CUT11-MCHERRY (CUT11-MCH); Le cellule sono state classificate come soggette a normale divisione, divisione anormale o senza divisione (n ≥18). Sono anche mostrate le immagini tipiche di ciascuna categoria. (f) L’anello anteriore del bordo formato sul nucleo è stato visualizzato con meu14-mcherry (MEU14-MCH) (n ≥ 24). (Su, a sinistra) In assenza di MBC, gli anelli di attacco formati dopo la separazione SPC. (Su, a destra) In presenza di MBC, gli anelli di bordo anteriore formati da ciascun SPB sono stati contattati l’uno con l’altro, che è stato mantenuto durante la separazione di SPB (indicata da un pennarello SPB, CUT12-CFP) e crescita della membrana di Spore (visualizzate con GFP). -PSY1). Vengono anche mostrati i disegni schematici dei nuclei (arancioni) e gli anelli del bordo d’attacco (rosso). (Parte inferiore) Il complesso sepino è stato visualizzato con SPN6-Mcherry (n ≥ 8). (Giù a sinistra) in assenza di MBC. (Verso destra a destra) in presenza di MBC. I disegni sono anche mostrati per i nuclei (arancione) e il complesso del settino (rosso). Barre di scala, 2 μm.
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Se la membrana delle forme spinge la separazione SPB in assenza di IPMT, l’inibizione simultanea della membrana di Foresporas e la formazione di microtubuli lo renderà difficile. Per testare questa possibilità, utilizziamo il mutante SPO15 Δ, in cui gli SPB non vengono modificati correttamente e la membrana del Foresporama non si assegna in loro 27. La separazione di SPB non è mai stata osservata nelle cellule trattate SPO15 trattate con MBC (94 min, fig. 3b), che dimostra che, infatti, era la membrana di Forespora che ha aumentato la separazione di SPB in assenza di IPMT. Inoltre, non è stata osservata alcuna segregazione di cromosomi o divisione nucleare. Allo stesso modo, la separazione SPB che ha avuto luogo durante il MII nei cigote di CUT7-446 è stata bloccata dalla rimozione SPO15 (figura 3C). Pertanto, la membrana di Forespora costituisce i difetti strutturali del mandrino bipolare causato da una perdita IPMT o da un fallimento nella scorrimento dei microtubuli Antiparale. Entrambe le cellule trattate SPO15 trattate con cellule MBC (figura 3b) come celle SPO15 7 CUT7-446 (figura 3C) non sono riuscite a separare Spbs, cromosomi segregati e dividere il nucleo, sebbene tali celle avessero microtubuli residui attorno allo SPB. Queste osservazioni dimostrano che questi eventi meiotici indipendenti IPMT sono controllati solo dalla membrana spore, ma non dal restante ktmt.
L’anello all’avanguardia e il complesso di settin.
La crescita Il bordo della membrana del filo è delimitato dalla struttura del bordo di attacco, che contiene proteine come Meu14 (Refs 28, 29) ed è supportata dal complesso SEPTIN 30 (SPN2, SPN5, SPN6 e SPN7). Sia la struttura all’avanguardia che il complesso sepino sono necessarie per navigare nella crescita della membrana delle spore nella direzione corretta 30. Blochiamo la funzione di entrambe le strutture usando il doppio mutante MEU14 Δ SPN6 DIS di disorientare la crescita della membrana spore. Le cellule trattate da MEU14 Δ SPN6 trattate con MBC potrebbero separare SPB durante il MII in una certa misura, probabilmente perché la membrana di Forespora potrebbe essere assemblata inizialmente senza settinas e meu14. Queste cellule, tuttavia, spesso fallissero nella segregazione delle sorelle cromatidi ugualmente e nell’esecuzione della divisione nucleare (Fig. 3D, E).
Significativamente, gli anelli antraciti formati da entrambi gli SPB e mantenuto il contatto fisico l’uno con l’altro quando gli SPB sono separati in assenza di IPMT (figura 3F). Il complesso Septine visualizzato da SPN6-Mcherry è apparso simultaneamente con l’aspetto degli anelli di attacco per allineare la membrana spore (figura 3f). Questi risultati forniscono una prova genetica e visiva che la membrana di Forespora orientata correttamente dall’anello del fronte di attacco genera una tensione interpolata, che in effetti porta a una costante separazione degli spbs, la segregazione dei cromosomi e del nucleare della costrizione. L’anello del bordo di attacco contenente MEU14 è supportato con F-Actin 31.Quando la polimerizzazione dell’actin è stata inibita con latrunculazione A in presenza di MBC, l’anello del bordo di attacco non ha contratto e fallito nella segregazione dei cromosomi e della divisione nucleare, sebbene sia avvenuta una separazione di SPB (fig. S5 complementare). . Questo fenotipo è simile a quello di MEU14 Δ SPN6, convalidando il rapporto funzionale dell’anello di attacco e dell’actin.
contributo della membrana di Forespora al MII fisiologico.
Tutti i risultati sopra suggeriti che la membrana delle spore funziona come un dispositivo strutturale che aiuta il mandrino. Per verificare se la metropolitana mediata dalla membrana delle spore contribuisce anche al MII fisiologico, in cui i microtubuli non sono disturbati, usiamo il mutante SPO15 Δ, che non forma la membrana della spora. Sebbene SPO15 non sia essenziale per la progressione di MII 27, ci concentriamo in particolare sulla fedeltà della separazione SPC monitorando un componente del complesso del poro nucleare, CUT11-3MRFP. Questa proteina si trova negli spbs quando è incorporata nella busta nucleare all’inizio della fase M 32 (figura 4a) e non è più associata a loro all’inizio dell’Anafase. Per ogni nucleo, registriamo il tempo di separazione SPB come indicato dalla singola divisione di approccio CUT11-3MRFP. Sorprendentemente, la SPO15 durante le cellule durante il MII a volte mostrò la scomparsa di un singolo punto CUT11 senza separazione, il che suggerisce che la separazione di SPB non si è verificata in MII (Fig. 4a e Tabella 1). Nessun errore è stato osservato nella separazione di SPB durante la mitosi e il MI nelle celle SPO15 Δ (figura 4a e tabella 1). Pertanto, la membrana delle spore, almeno in parte, contribuisce alla separazione efficiente di SPB durante il MII fisiologico.
(A) Il comportamento del taglio11-3MRFP è stato filmato in tipo selvaggio e SPO15 a celle all’inizio della mitosi e MII (n ≥ 26 ). Nelle celle di tipo selvaggio (Wt), CUT11-3MRFP erano costitutivamente situate nella busta nucleare e formavano focolai aggiuntivi in spbs all’ingresso mitotico / MII; Questa posizione ha continuato attraverso la separazione SPB (visibile come due faretti) e scomparve all’inizio dell’Anafase. Tuttavia, nelle celle SPO15 Δ dell’ingresso MII, i foci CUT11-3MRFP occasionalmente sono scomparsi senza essere divisa, indicando un guasto nella separazione dello SPB all’inizio dell’Anafase (26-29 min). (b) Kymografi di lasso di tempo che mostrano la cinetica del mandrino durante il MII in celle di tipo selvaggio, SPN6 Δ e MEU14 Δ SPN6 ((n ≥8). Uno dei due punti CUT12-CFP (SPB) in ogni punto del tempo allineato nella parte inferiore dell’immagine per risciacquare un aumento della distanza inter-spb. La lunghezza delle frecce corrisponde a 5 minuti. Barre di scala, 2 μm. (c) La cinetica di SPB è stata rappresentata in modo grafico in tipo selvaggio, SPN6 Δ e MEU14 Δ SPN6 osservato le cellule osservate osservate in b. Ogni linea rappresenta la cinetica per un singolo core (n ≥8).
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Tabella Tabella
Per indagare più accuratamente se la crescita della membrana spore contribuisce alla separazione di SPB durante il MII fisiologico, monitoriamo la cinetica della distanza inter-spb (contrassegnata da CUT12-CFP). La distanza inter-spb è aumentata con un modo graduale durante il MII in celle di tipo selvaggio, come è successo durante la mitosi (Figura. 4b, c). Al contrario, la crescita disorientata della membrana spore nella Meu14 Δ SPN6 è stata spesso associata a una fluttuazione nella distanza inter-spb (figura 4b, c). Una fluttuazione simile ma meno evidente è stata osservata nel singolo mutante SPN6 (figura 4b, c), che indica che MEU14 e SPN6 operano nella guida della membrana spore su una rotta parallela 30 (fig. 5a per uno schema). Il Il tasso di separazione dello SPB nel MEU14 Δ SPN6 potrebbe essere in grado di essere transitoriamente più veloce di quello delle celle di tipo selvaggio (figura 4C), probabilmente perché la crescita disorientata della membrana della prevista membrana in esse ha costretto una rapida separazione degli spbs. Questi risultati mostrano che le dinamiche della membrana spore contribuiscano efficacemente alla cinetica della separazione SPB durante il MII in condizioni fisiologiche. Inoltre, MEU14 Δ SPN6 ha mostrato le cellule ha mostrato una divisione anormale fino al 20% dei nuclei di MII, suggerendo l’importanza dell’organizzazione adeguata di la membrana spore per una costrizione precisa del nucleo.
(a) Illustrazione schematica della funzione di settinas e proteine all’avanguardia (Lep) nell’assemblea della membrana spore.Settini e Leps hanno un ruolo importante nell’orientamento della membrana delle spore. Nel tipo selvatico (Wt), il bordo di crescita della membrana forestale è delimitato da Leps che include Meu14 a guidare adeguatamente e costringere la membrana di Forespora. Il complesso sepino meiotico (SPN2, SPN5, SPN6 e SPN7) guida la direzione della crescita del bordo. I Settenti e le EPS controllano in modo cooperativo la gestione della crescita della membrana di Forespora. Il povero fenotipo di sporalazione è più prominente quando la combinazione di SPN6 è combinata con MEU14; Pertanto, il doppio mutante MEU14 Δ SPN6 è stato utilizzato in questo studio come sforzo che manca di Septin e LEP. Nelle cellule MEU14 Δ SPN6, la membrana delle spore non può incapsulare adeguatamente il nucleo, portando alla produzione di spore difettose. (b) Questo studio propone un nuovo ruolo per Septinas e Leps nella segregazione dei cromosomi e della divisione nucleare durante il MII. In assenza di IPMT (WT + MBC), la membrana di Forespora, che inizia ad assemblare dagli spbs, divide le spbe. La membrana delle spore viene quindi guidata da strutture contenenti Septin e lep per circondare il nucleo. Quando MBC viene aggiunto a cellule MEU14 Δ SPN6 ((MEU14 SPN6 Δ + MBC), l’assemblaggio della membrana di Forespora è disorientato e la segregazione dei cromosomi o della divisione nucleare non viene prodotta. Poiché il SPB che emana dai microtubuli è collegato alla membrana delle spores , il suo assemblea non coordinato può influenzare l’efficienza e la fedeltà dell’Unione Kinetochore Microtubuli. Inoltre, Settinas e Lep limitano il nucleo gratuito IPMT generando una forza che viene normalmente utilizzata per incapsulare il nucleo dopo la divisione nucleare mediata da IPMT in Wild-Type .
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Discussione
Abbiamo dimostrato la funzione senza precedenti dalla membrana delle spore nella separazione di SPB, la segregazione dei cromosomi e il Divisione nucleare durante l’IIM. Proponiamo che, nella fase iniziale del MII, la membrana forestale in via di sviluppo genera una forza di separazione da SPB dagli SPB abbinati a HA. È fuori lungo la membrana nucleare, quindi supporta il mandrino bipolare per una separazione efficiente dei cromosomi. In assenza di IPMT, le strutture del bordo del progresso si sono sviluppate dai due SPB Bollides, e la loro forza di repulsione genera una tensione fisica tra Spbs (Fig. 5). L’apparato di divisione mediato dalla membrana delle spore, rafforzato dalla struttura del bordo dell’attacco e del Septin, può facilitare la segregazione ugualmente dei cromosomi e della costrizione della busta nucleare, anche in assenza di IPMT. È interessante notare che Mad2-SAC era tenuto a garantire il momento adeguato della segregazione dei cromosomi in assenza di IPMT, il che implica che la costrizione nucleare mediata dalla membrana spore potrebbe essere regolata dal complesso promotore dell’Anafase / ciclotomatico. Sulla base della capacità della membrana spore di compensare l’assenza di IPMT durante gli IAS, riteniamo che le funzioni cruciali dell’IPMT siano le seguenti: ancora i poli del mandrino alla busta nucleare per garantire la forza di segregazione dei cromosomi e dividere il nucleo in Anafase.
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La divisione cellulare senza omologo di tubulina FTSZ è prodotta in ceppi di bacillus subtilis batteri difettosi nell’organizzazione della parete cellulare 33. È stato recentemente riferito che una divisione nucleare indipendente dei microtubuli (fissione nucleare) si verifica nella mitosi di S. Pombe quando la citochinesi (formazione della parete cellulare all’uscita mitotica) è inibito artificialmente, sebbene non sia chiaro come Genera forza. In questo studio, abbiamo chiarito la meccanica per generare la forza necessaria per la divisione nucleare senza IPMT durante il MII: il contatto fisico dei bordi della membrana spore è il perno. In contrasto con gli studi precedenti per la mitosi, la forza mediata dalla membrana spore apparentemente contribuisce al MII fisiologico.
Chiediamo che detti macchinari mediati da macchinari potrebbero essere stati sviluppati come sistema di backup per la segregazione di I cromosomi durante il MII, in cui la struttura del mandrino potrebbe non essere robusta come è durante la mitosi o l’IM. L’asse meiotico è costruito prima durante l’IM e poi smontato, seguito dalla ricostruzione durante il MII. In particolare, MII è una “meiosi virtualmente aperta” in cui le proteine nucleari vengono disperse dal nucleo durante Anafase 34, 35. Queste situazioni possono comportare che l’organizzazione del mandrino potrebbe essere meno efficiente in IMA che in mitosi.D’altra parte, il MII dovrebbe essere accoppiato con l’incapsulamento dei nuclei dei fratelli dalla membrana delle spore. Pertanto, la membrana di Forespora potrebbe aver bisogno della capacità di generare una forza che aiuta le funzioni del mandrino. La struttura della membrana che coinvolge le proteine all’avanguardia e Septin ha acquisito una doppia funzione: l’incapsulamento del nucleo e l’assistenza della segregazione dei cromosomi. È interessante osservare le somiglianze e le differenze tra questa struttura e la matrice di stringa, che dovrebbe mantenere la struttura del mandrino in maggiori eucarioti superiori, come scheletro in materiali che non sono microtubuli 36. Un’organizzazione membranosa che include il foglio B è stata recentemente dimostrata che funziona come una matrice del mandrino che circonda tutto il mandrino di Prometafase per mantenere la sua struttura 37, 38, 39. Tuttavia, oltre ad essere un impalcature strutturale, la membrana Forespora può generare una forza per la separazione della divisione SPB e Nucleare. Eukaryotes superiori potrebbero aver sviluppato un macchinario a carico di microtubulo come dispositivo di generatore di forza vantaggioso e la matrice del mandrino membraniale può essere differenziata come struttura di supporto.
ceppi di lievito e procedure genetiche.
I ceppi utilizzati in questo studio sono elencati nella tabella complementare S1. I metodi standard basati su PCR per l’orientamento genico 4, 40 sono stati utilizzati per costruire generatori di geni e ceppi contrassegnati da proteine fluorescenti con cassette di selezione dei marcatori di selezione, ad eccezione del ceppo GFP-PSY1 26, che è stato costruito dall’integrazione di un plasmide contenente GFP-PSY1 Costruzione di fusion (un regalo da T. Nakamura). A. Yamamoto 17 ha fornito il ceppo CEN2 – GFP. In breve, le sequenze ripetitive di Lachco sono state inserite vicino alla regione Centromera del Chromosome II (CEN2), riconosciuta da una co-proteina di fusione di fusione di laurea-GFP-GFP-GFP. Per l’induzione della meiosi, le cellule homateliche H 90 sono state osservate nel mezzo agar sporadulazione per tutti gli esperimenti, ad eccezione del test di fattibilità dei sporati mostrati in FIG. 2F, G (vedi sotto).
Sincronizzazione della meiosi e Test di redditività delle spore.
Per il test di vitalità della spora (figura 2f, g), utilizziamo un sistema per indurre la meiosi sincronizzata utilizzando il PC diploide (H – / H -) PAT1-114 + PC Strare 41, determinando così quando la popolazione binucleata era al suo picco (e quindi quando si aggiunge MBC). Per controllare la progressione meiotica con il numero di nuclei, le cellule sono state macchiate con 4 ‘, 6-diamino-2-fenildolo dopo il fissaggio nel 50% di metanolo. La redditività delle spore è stata esaminata dall’analisi della tetrata. Le spore sono state germogliate nel mezzo ricco di estratto di lievito. La fattibilità è la media di tre esperimenti indipendenti.
microscopia
microscopia
Per ottenere immagini delle cellule mitotiche della cella vivente, le celle di crescita logaritmica coltivate in medio sintetico mezzo ricco di tiamina a 30 ° C durante ≥ 13 h. Per ottenere immagini delle cellule cellulari viventi in meiosi, i cigotos sono stati utilizzati situati nel mezzo agar sporodulazione a 25 ° C durante ≥8 h. Le cellule viventi sono state osservate nel mezzo minimo di Edimburgo con o senza fonte di azoto per analizzare rispettivamente il ciclo o la meiosi mitotica. Le immagini delle cellule viventi sono state eseguite come descritto 4 in un sistema Deltavision-Softworx (precisione applicata) utilizzando un microscopio (IX71, Olympus) dotato di fluoresceina isotiocyanato, mcherry e filtri CFP (tecnologia Chroma), APO N × 60 (NA, 1.42 ) o un olio di uova dell’olio SAPO × 100 (NA, 1.40) Olio (Olimpo), una fotocamera HQ2 coolsnap (fotometrica) e un regolatore di temperatura (controllo di precisione) a 25 ° C, ad eccezione delle figure 1G e 3C e figggi supplementari S2 e S3E , F (32 ° C sono stati utilizzati per il mutante sensibile al taglio della temperatura 7-446 e NUF2-1). La sezione Z è stata effettuata a intervalli di 0,4 o 0, 5 μm, e le immagini sono state prese ogni 1 a 5 minuti. Le immagini sono state decontaccate e una proiezione Z-Stack è stata creata con la somma o il metodo massimo. La variazione della temperatura per i mutanti sensibili alla temperatura è stata eseguita almeno 1 h prima dell’osservazione.
trattamento farmacologico
In immagini cellulari viventi, immagini per la prima volta sono stati presi senza MBC. Quindi MBC (Sigma-Aldrich) è stato aggiunto in una concentrazione finale di 50 μg ml -1 in tutti gli esperimenti. Latrunculina A (Invitrogen) è stata aggiunta a una concentrazione finale di 50 μm di almeno 1 ora prima di ottenere immagini cellulari viventi.
Statistiche
A TION T Test è stato utilizzato code non cleaning per le analisi statistiche .