Analisi della variazione intraspecifica di Conidiobolus Coronatus utilizzando Sequenze Rapd e STS | Malattie infettive e microbiologia clinica

Introduzione

Conidiobolus Coronatus (C. Coronatus) (Entomophhorals) è un fungo cosmopolita e patogeno di insetti di diversi ordini1; È stato trovato su legno decomposizione, rifiuti di foglia, suolo2 e anche come agente patogeno di mammiferi, incluso l’uomo, che produce rinoentomofotomicosi, che colpisce la superficie del tratto respiratorio, può danneggiare la mucosa nasale e paranazionale e persino estendersi alla pelle di Il naso, la labbro superiore e la parte anteriore-glablare33.

Il rapporto di danno umano è raro ed è limitato alle regioni con climi tropicali e alta umidità4. L’ampia distribuzione di C. Coronatus e i pochi casi di rinoethomophtosi ritornati suggeriscono che non tutti gli isolati sono patogeni per animali umani e superiori3,5.

nell’impianto di produzione di funghi (Agaricus Bisporus) Fungi Rioxal (perote, Veracruz, Messico) Un epizoottico scoppio di C. Coronatus è stato rilevato sulle mosche della specie Lycoriella Naive (L. ingenuo), considerata la principale parassita del Champignon6. Il fungo è prodotto in navi chiuse che presentano condizioni simili a un clima tropicale umido7 e in cui ci sono mosche infette da C. Coronatus. I lavoratori sono esposti a entrambi i fattori per periodi prolungati, il che implica che sono a contatto con le spore del fungo e, nonostante ciò, non ci sono serbatoi di rhinoetoomhoromycosi originati negli impianti di produzione di funghi.

La relazione tra C. Coronatus e la sua vasta gamma di host è degna di studio e può essere considerata un’indicazione di variazione intraspecifica. Sulla base di quanto sopra, l’obiettivo di questo lavoro era quello di indagare se esiste o non una variazione genetica tra isolati di C. Coronatus da lesioni umane e altre fonti (suolo, insetto, compost).

per determinare il La variabilità genetica tra isolati da diversi host è necessaria per utilizzare tecniche molecolari8. Il distanziatore interno trascritto (STIS) è il locus più popolare della ricerca miologeria basata sulle sequenze; È il più successo per l’identificazione di un gran numero di funghi, quindi è stato designato come un marker del DNA del codice a barre universale per funghi; Inoltre, la sua comprovata capacità per lo studio della variazione inter-intrassificata lo rende uno strumento molto potente9-12. Allo stesso modo, la tecnica del polimorfismo derivata dall’amplificazione casuale del DNA (Rapd) ha acquisito vari usi nello studio della diversità genetica; In funghi è stato utilizzato con successo principalmente negli studi intraesprecifici13. Queste 2 tecniche sono state implementate in 11 isolati di C. Coronatus e i loro risultati sono stati analizzati e discussi in termini di distanza genetica in base alla fonte di cui erano isolati (suolo, insetto e umano).

Materiali e métodosailimenti

11 isolati di C. Coronatus sono stati usati; 8 di loro sono stati ottenuti dalle collezioni pubbliche e 3 erano isolati da soli (Lyco 1, 4 e 5). Tutti sono stati elaborati per analizzarli con tecniche di rapd e amplificazione della regione ITS1-5.8S Radn-ITS2 (introni tra i geni Radn 28s e 18s). L’elenco di tutti gli isolati e la fonte adottati è mostrato nella tabella 1.

Los AISLAMIENTOS di C . coronatus Lyco 1, 4 y 5 è obtuvieron en la planta di PRODUCCIÓN di champiñones Hongos Rioxal (Segun método di Papierok Hajek14 y), è Detecto Donde el brote epizoótico di un sobre hongo entomopatógeno moscas de la especie L. ingenua, que fue por EL Especialista identificado Arthur A. Callaghan Como C. coronatus. TODOs così AISLAMIENTOS presentaron las Caratteristiche morfológicas propias de la especie (por ejemplo, conidios vellosos producidos solo por Esta especie). Realizaron è così postulados di Koch y con ellos que se comprobó C. coronatus fue el agente causale della enfermedad Sobre la L. ingenua.

Los AISLAMIENTOS su 11 C. coronatus è il mantuvieron temperatura ambiente y en un preservaron Agua estéril destilada. Para su Desarrollo, è inocularon en medio Dextrosa Sabouraud agar a 25 ° C

Extracción di ADN

Si obtuvo micelio liofilizado de los 11 AISLAMIENTOS di C. coronatus Siguiendo por el método descrito Guzmán-Franco et al.15 . El ADN è extrajo Mediante el método CTAB (bromuro di hexacetiltrimetilamonio) modificado di Ahrens y Seemüller16. El Macerado è Coloco en un tubo Eppendorf cane 400μl di solución di Lisis (sodio cloruro di 0,4m, 10mm Tris-HCl, 2mM EDTA, 1% PVP) è mezcló y con un agitador vortice homogenizar para. Enseguida è agregaron 50 pi di 20% SDS, 40μl di proteinasa K (10mg / ml) y è INCUBO a 65 ° C Durante Una Hora. Después è agregaron solución 600μl del 3% CTAB (Sigma Chemicals, EE. UU.) Y è INCUBO NuevaMente Durante 45min a 65 ° C. Posteriormente è adicionó volumen ONU di cloroformo isoamílico y alcol (24: 1), y è mezcló centrifugo 10min a 14.000rpm, Donde è formaron 2 fases; la fase acuosa è Coloco en un tubo Eppendorf con un volumen y di isopropanolo è INCUBO a -20 ° C por 60min; después è 10min centrifugo a 14.000rpm. ADN el fue en resuspendido 50 pi di Agua destilada estéril; Concentración y la calidad del ADN è Estimo con un NanoDrop ND-1000 V3.7 (Thermo Scientific®, EE. UU.). Por último, el ADN è visualizó en un gel al agarosa del 1% di X 1 en TBE Buffer (Tris0,089M, Acido borico 0,089M, 0,002M EDTA) cane teñido bromuro di etidio (0,5μg affitto-1 por 10min) y con un è fotografió fotodocumentador-Gel Doc MOD. 2000 (Bio-RAD®, EE. UU.).

Amplificación RAPD

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por Sus SIGLAS en italiano) è realizó en un termociclador mio termica Cycler ™ cycler Bio-Rad modelo 580BR 09275. Si usaron tubos di 0,5ml Eppendorf; volumen el final de la mezcla fue 25μl / y PCR contenía 4μl di ADN (80ng / ml), 10x Buffer, cloruro di magnesio 3mm, 2,5mm cada di dNTP (Gene Choice), 1.5 U di Taq polimerasa (Biogenica) cada y 2 pi di iniciador (10pmol).Sono stati utilizzati iniziatori casuali della serie OPERON Technology® e della serie B di Invitrogen (Tabella 2). Da 19 iniziatori comprovati, solo quelli che hanno dato risultati riproducibili (3 amplificazioni) sono stati utilizzati nell’analisi del rapd, quindi alla fine 13.

Il programma di amplificazione era di un ciclo denaturato ION iniziale a 94 ° C per AMMIN, seguito da 38 cicli di denaturazione a 94 ° C per 30 s, ibridazione a 35 ° C per 30 s, ed estensione a 72 ° C per 1,5 minuti, seguito da un’estensione finale a 72 ° C per 5min. La dimensione dei frammenti amplificati è stata stimata utilizzando un marcatore di peso molecolare da 1 KB (Qiagen). Nell’amplificazione di ogni iniziatore, i radicani di zooftora (isolati da Plutella Xyllostella) e Cercospora Agavicola (isolati da Agave Tequilana) (figura 1), che non sono stati inclusi nell’analisi dei dati rapd. La gestione di questi isolati (crescita ed estrazione del DNA) è descritto in Guzmán-Franco et al.15 e Ayala-Escobar et al.17.

analisi dei dati rapd

la presenza o l’assenza di modelli di rapd Le bande erano considerate come un carattere indipendente e analizzate visivamente dalle fotografie di gel di agarosia; La presenza è stata registrata con 1 e l’assenza con 0. Con questi risultati è stata costruita una matrice binaria dove sono stati trovati i polimorfismi da ciascuno degli iniziatori. Da questa matrice di somiglianza e il semplice coefficiente di accoppiamento, è stato costruito un dendrogramma; Per generare e visualizzare le relazioni è stata utilizzata Ntsys 2.0. Per ottenere un dendrogramma di una maggiore solidità, sono stati eseguiti 1.000 repliche bootstrap (BS) con Winboot.

Amplificazione delle regioni ITS1-5.8 ADNR-STS2 del DNA ribosomiale per gli 11 isolati di C. Coronatus utilizzando i suoi 5 universali Iniziatori (5’GraagtaaaaGtcGtaAagg) e STS 4 (5’TCCCCGCTTattGataTGC) 18. Le amplificazioni sono state realizzate in tubi Eppendorf di 0,5 ml e il volume finale del campione per reazione era di 25μl. Ogni reazione conteneva 2μL di DNA (80ng / μl), cloruro del magnesio del tampone 10x, 2,6 mm, 2,5 mm di ciascun DNTP (scelta genica), 1.5 U / μl di polimerasi TAQ, 2μL di ciascun iniziatore (20 pmol). I tubi di testimonianza contenevano acqua distillata sterile invece del DNA.Il programma di amplificazione era un ciclo di denaturazione iniziale a 95 ° C per 5min, quindi 35 cicli di naturalizzazione a 95 ° C per 30 s, ibridazione a 50 ° C per snella, estensione a 60,3 ° C di 1,5 minuti e un’estensione finale a 72 ° C per 5min. La dimensione dei frammenti amplificati è stata stimata utilizzando marcatori di peso molecolare da 1 KB e 100 PB.

Per trovare differenze al livello dei nucleotidi tra gli isolati, i prodotti PCR-STS sono stati inviati per la sua pulizia e sequenziamento al Azienda di macroogene (Corea). Il sequenziamento è stato eseguito in entrambe le direzioni utilizzando Iniziatori universali 4 e 518.

Analisi dei dati della sua regione

Le sequenze 11 STI sono state modificate manualmente con BIOEDIT e FINCTV 1.3. L’allineamento di sequenze multiple è stato eseguito con Clusal W. Le sequenze sono state depositate nella NCBI Genbank (Tabella 1). Per costruire un albero filogenetico più affidabile, aggiuntivo alle 11 sequenze di Coronatus ottenute in questo studio, sono state utilizzate 3 sequenze di C. Coronatus e una delle NCBI Genbank Conidibolo Thrombooides (Tabella 1).

La selezione Di C. Thromboides come gruppo esterno è stato realizzato da un esplosione (NCBI Genbank) con le 11 sequenze di C. Coronatus e un’analisi di parsimonia, i cui risultati hanno perso che è strettamente correlato a C. Coronatus ma è diverso nella sua regione.

con MEGA5 Un albero filogenetico è stato costruito con i metodi massimi di parsimonia, il vicinato (NJ) e l’evoluzione minima; Negli ultimi 2 è stato utilizzato il modello Tamura-Nei. Valutare la fiducia delle relazioni filogenetiche; La solidità dei nodi è stata stimata dall’analisi BS con 2.000 repliche.

Per analizzare ulteriormente la diversità genetica degli isolati, le sequenze STI sono state raggruppate in base al suo substrato o ospite: 1) insetto, 2) terreno , 3) Umano e 4) Compost; Con il programma MEGA5, un conteggio è stato un conteggio per determinare il numero di siti variabili all’interno di ciascun gruppo e tra tutti i gruppi, così come la regione in cui erano (its1-5.8s Radn-STS2) (Tabella 3). Per queste 2 valutazioni, il gruppo esterno non è stato considerato.

RISUALURI RAPD

Gli iniziatori hanno selezionato 48 bande amplificate con una variante polimorfica del 22 al 100%; 34 gruppi polimorfi sono stati ottenuti, con conseguente 70,83% del polimorfismo; Sono stati ottenuti da 2 a 9 bande per iniziatore (Tabella 2). La figura 1 mostra i modelli del vassoio ottenuti dall’amplificazione con l’iniziatore A18 e la differenza genetica tra l’isolamento valutato da diverse fonti è visto.

il dendrogram costruito dall’analisi dei modelli di Bande ottenuti con i 13 iniziatori Rivela la formazione di 4 gruppi principali (A, B, C e D) con somiglianza del 40%. I risultati indicano un alto livello di diversità genetica. La stabilità dei raggruppamenti ottenuti è stata valutata con un’analisi BS con 1.000 repliche (Fig. 1). Gruppo A include 8 isolati divisi in 2 sottogruppi, I e II; Sottogruppo I contiene gli isolati ottenuti da L. Naive Lyco 1, Lyco 4 e Lyco 5 (Lyco 1 e Lyco 4 hanno la somiglianza del 100%); Sottogruppo II è costituito dallo staff 4: 004 isolati del pavimento, personale 15: 008, personale 1: 037, personale 10: 027 e personale 04: 427 (Personale 4: 004, Personale 15: 008 Avere la somiglianza del 100%). Il Gruppo B include solo l’isolamento ARSAF 1884 prelevato da Mocis Latit, con somiglianza dell’80%. Il Gruppo C comprende solo l’isolamento del NARSF 512 da Nilaparvata Lugens, con somiglianza del 50%. Nel gruppo D da solo è l’isolamento ATCC 32865 da lesioni umane, con somiglianza del 40%, e questo presenta la massima distanza genetica dal resto degli isolati (figura 2).

Analisi della sua regione

I suoi iniziatori utilizzati18 amplificati un frammento di 666 BP (gli spazi sono stati considerati come siti informativi) corrispondenti al regioni ITS1-5.8S Radn-ITS2 nell’11 Valutazione dell’isolamento. La lunghezza di ciascuna delle regioni era omogenea in tutti gli isolati: ITS1 223 BB; 5.8s Radn, 155 BP; ITS2, 288 BP. L’allineamento e l’analisi delle sequenze con il programma MEGA5 di ITS1-5.8S RADN-ITS2 di C. Coronatus Isolates (Tabella 1) mostra 69 siti variabili tra i 14 isolati. Di questi, 40 si trovano in ITS1, rendendolo nella regione più polimorfica, sia di tutti i gruppi che degli isolati di ciascun gruppo. La regione di 5.8S è la più conservata, poiché ha solo 3 siti variabili tra i 14 isolati. Nell’interno di ciascun gruppo c’erano anche differenze nel numero di siti variabili totali, il Gruppo viene da insetti con il numero più alto (29) e il gruppo di esseri umani il più omogeneo (5) (Tabella 3).

La variabilità della sua regione ha fornito informazioni sui modelli di diversificazione di C. Coronatus. Un albero filogenetico è stato costruito con i metodi statistici della massima parsimonia, il vicinato (NJ) e l’evoluzione minima e l’utilizzo di C. Thromboides come gruppo esterno. Lo stesso risultato è stato ottenuto con i 3 approcci sia nella topologia che nel supporto dei rami (valore BS); La sua regione chiaramente differenziata C. Coronatus di C. Thrombooides (specie strettamente correlate). La figura 3 mostra il risultato dell’albero dell’analisi NJ.

Le distanze genetiche tra gli isolaulamenti sono rappresentate dalla lunghezza del ramo dei gruppi che si formano. Gruppi A, B e C sono stati formati. Gruppo A include 10 isolati diviso in sottogruppi I e II; Sottogruppo I contiene Lyco 1, Lyco 4 e Lyco 5 isolati (ottenuto L. ingenuo), FSU 784 (ottenuto dal compost di funghi) e P1 (ottenuto da insetti). Nel sottogruppo II sono lo staff 4: 004, personale 15: 008, personale 10: 027, personale 1: 037 e personale 04: 427 (ottenuto dal suolo); Il valore BS del nodo che unisce i sottogruppi I e II è basso (44%), ma il valore BS del nodo che unisce gli isolati del sottogruppo I è del 79% e il sottogruppo II è dell’88%. Il Gruppo B include gli isolati ASOF 512 e ARSF 1884 (isolati di insetti homoptere e coleoptera, rispettivamente) e infine, nel Gruppo C sono gli isolati ATCC 32865 e VPCI-126P (presi dalle lesioni umane). Questo gruppo presenta la più grande distanza genetica rispetto ad altri isolati e il suo valore BS è del 98%.

Discussione

I risultati di questo lavoro mostrano la evidente variazione genetica tra l’isolamento di C. Coronatus valutato, raggruppato secondo la sua origine in: 1) insetto, 2) compost, 3) suolo e 4) umano.

Sebbene i principi della tecnica con sequenze STI differiscano da quelli della tecnica del Rapd19,20, è rispettato Ciò indica SOLL21, chi sostiene che per i risultati ottenuti con un metodo da considerare valido, devono essere confermati con almeno una tecnica diversa. I nostri risultati sono coerenti con entrambe le tecniche basate su: 1) Vi è una variazione intraspecifica in isolati valutati; 2) I isolati umani presentano la più grande divergenza genetica rispetto al resto degli isolati; 3) La maggiore distanza genetica tra i gruppi di isolamento è data tra quelli da umani e Lycos (isolati di L. ingenuo).

Anche se risulta come quelli di Ribes et al.5, Valle et al al .3 e Wieloch et al.4 Suggerisci che non tutti gli isolati sono patogeni per l’umano e che, a sua volta, questa è un’indicazione della variazione intraspecifica del fungo, non ci sono studi che lo supportano. Questo lavoro è il primo a valutare e dimostrare che vi è una variazione intraspecifica a livello molecolare di C. Coronatus relativo alla fonte di cui sono state prese.

Studi simili hanno valutato la variazione in altri entomophtorales con rapd e Amplificazione dei suoi 22,23. Proprio come i nostri risultati mostrano una chiara distanza genetica tra isolati da diverse fonti, FARGUSE et al.9 e Morton et al.24 hanno riportato la relazione tra variazione genetica e host.

Ci sono studi del complesso di fusarium, Ciò anche se non è un entomophrim, condivide con C. Coronatus la caratteristica di infettare una vasta gamma di host, incluso l’umano. Zhang et al.25 cercarono la variazione intraspecifica senza successo in 471 isolati prelevati da umani, suolo, animali, aria da ospedali e piante. La ragione di ciò è che il fusarium è un fungo multi-ospitato26, che implica che lo stesso isolamento può infettare un gran numero di organismi di varie phyla.

Ogni microorganismo ha un insieme di funzionalità che funzionano come fattori di virulenza nei suoi ospiti; Tuttavia, è sconosciuto fino a che punto condividono i meccanismi di infezione in diversi gruppi ospiti. Una causa di ciò è l’assenza di modelli che consentono di analizzare la virulenza tra i gruppi infetti27. Tenendo conto delle varie fonti in cui c. Coronatus è stato trovato e i nostri risultati che mostrano chiaramente la variazione intraspecifica tra isolando, riteniamo che C. Coronatus poteva servire come modello per valutare i meccanismi di virulenza che lo rendono specifico per ciascuno di ciascun gruppo di organismi a cui attacca.

Anche se i nostri risultati mostrano una chiara differenza a un livello molecolare tra isolati di C. Coronatus da fonti umani e di altre fonti, in questo lavoro non vengono presentate risultati morfologici o fisiologici gli isolati per verificare se le differenze genetiche sono tradotte in differenze fenotipiche; Tuttavia, ci sono le nostre osservazioni (solo con alcuni isolati) e altri autori che ci aiutano a dedurlo, oltre a sollevare la possibilità che vi sia un isolamento che non è un patogeno umano. Hall et al.28 ritengono che la capacità di sviluppare a 37 ° C sia un criterio per valutare il potenziale dei funghi come agenti patogeni umani; Mier et al.29 ha lavorato in una tensione da umani e sviluppati a 37 ° C, mentre Papierok et al.2 studiarono 10 ceppi, di cui solo una di origine umana e una Hanseniella isolata Miriapodo Unguiculata crebbe a 37 ° C; Il resto è venuto dagli insetti da vari ordini. Nel nostro caso, è stato osservato l’effetto della temperatura su Lyco Isolati 1, 4 e 5, trovando che non c’era sviluppo a 37 ° C (dati non presentati). Inoltre, abbiamo osservato che l’isolamento ATCC 32865 (prelevato dall’umano) ha richiesto quasi 4 giorni di più per riempire un diametro di 85 mm di diametro di tuta di Petri rispetto a quelli ottenuti dagli insetti (dati non mostrati) e avevano un cotone, bassa ruvidità e tonalità Gisaceous, Caratteristiche che non sono state presentate nell’altro isolamento valutato. Queste caratteristiche sostengono anche le differenze tra l’isolamento degli esseri umani e il resto, che potrebbero essere attribuiti alla fonte di cui è stato ottenuto e suggerisce che questo può essere un fattore che genera distanze genetiche. I risultati di López-Martínez et al.30 suggeriscono anche una variazione intraspecifica e che non tutti i isolati sono patogeni di mammiferi; Hanno effettuato test in topi, criceti e porcellini della cavia con una tensione di C. Coronatus presi da Postica Aenolamia e sebbene c’era un’invasione iniziale in tutti gli animali, scomparve 15 giorni dopo l’inoculazione, il che indica che il fungo non era in grado di stabilire ognuno infettali. Quanto sopra evidenzia l’assenza di patogenicità di questo particolare sforzo nei mammiferi.

In questo modo, i nostri risultati sulla distanza genetica con STS e Rapd tra l’isolamento ATCC 32865 (umano) e quelli presi degli insetti, insieme al Caratteristiche fisiologiche e morfologiche degli isolati di Lycos sopra descritti, suggeriscono che questi non sono patogeni per l’umano; Questo potrebbe essere il motivo per cui, nonostante il fatto che i lavoratori siano in contatto con il fungo, non ci sono rapporti di infortuni umani da parte di C. Coronatus nelle piante produttrici di funghi.

I nostri risultati non sono conclusivi da suggerire L’uso di C.Coronatus nel controllo biologico degli insetti; La ricerca è necessaria per determinarla, come è accaduta con lo sforzo 251 del fungo Lilacinus Provoglocillium che è attualmente utilizzato per il controllo biologico dei nematodi, anche se il fungo è riportato come agente patogeno di umani e animali. Questo ceppo è l’unico che non produce pahecilotossina, che è l’agente causale del danno nell’umans31. Vale la pena ricordare che per C. Coronatus, la metabolita Coronatin-1 era già identificata in larve di Galleria Mellonella e, sebbene sia necessario determinare la sua modalità di azione, sarebbe interessante indagare se questo metabolite è in grado di causare alterazioni In Humans4.

La dimensione del campione e il numero di host / substrati di questo lavoro sono stati limitati, che avrebbero potuto influenzare l’analisi della diversità genetica e il numero di rami che sono stati formati negli alberi filogenetici. Si consiglia di eseguire test con un numero maggiore di isolati e includere studi di morfologia e fisiologia. Nonostante queste limitazioni, i nostri risultati con le tecniche di Rapd e STS forniscono informazioni sulla diversità intraspecifica di C. Coronatus relative al host / substrato.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi.