Introdución
As enfermidades infecciosas implican un dos maiores problemas de saúde, causando unha gran morbilidad e alcanzando niveis de millóns de afectados cada ano 1. O aumento das viaxes, os cambios demográficos e as resistencias antimicrobianas contribúen significativamente a este fenómeno. O tratamento das enfermidades infecciosas baséase nun primeiro diagnóstico seguido pola administración da droga correspondente.
A maioría das enfermidades infecciosas son a consecuencia dunha complexa rede de interaccións que poden implicar centos de miles de factores, tanto o patóxeno eo anfitrión. Para lograr unha mellor comprensión dos procesos de enfermidades infecciosas, é fundamental realizar estudos translativos e multidisciplinarios onde se integran a cooperación do persoal involucrado nas distintas áreas de traballo.
As análises máis exhaustivas realizadas Ata agora, en canto á procura de biomarcadores e novos obxectivos para drogas e vacinas foron feitas de estudos en xenómica e transcriptomic. Nas últimas décadas, o número de estudos proteómicos en enfermidades infecciosas e ao longo do ámbito clínico para a busca de biomarcadores e novos obxectivos para a vacinación e as drogas aumentou significativamente.
A secuenciación do xenoma microbiana revolucionou o estudo dos patóxenos , non só a nivel de microbioloxía básica, senón tamén en diagnóstico, epidemioloxía, fisiopatoloxía, tratamento de enfermidades e desenvolvemento de vacinas. Ademais, a secuenciación do xenoma microbiano permitiu o estudo da súa proteína. O primeiro xenoma secuenciado foi o virus Epstein-Barr (1984), 170KBS2 e unha década máis tarde, en 1995, o xenoma da bacteria gramnegativa Haemophilus influenzae, de 1,8MB3.
Moitos estudos foron baseados en A análise dos xenes expresados en diferentes tipos de células e tecidos en diferentes contextos fisiolóxicos, principalmente mediante unha análise de ARN messenger (ARNm), sen frecuentemente existir unha correlación directa entre o contido en MRNA eo contido de proteínas. A falta de correlación entre os niveis de proteína ARNM débese ao feito de que a montaxe de proteína producida por unha determinada cantidade de ARNm depende do estado fisiolóxico da célula4. Un exemplo desta ausencia de correlación entre transcriptomic (mRNA) e proteómica (proteína) está demostrado no traballo de franco et al.5, onde se comparan dúas cepas de helicobacter pylori, un pai carcinóxeno e non carcinógeno. As análises en ARNm mostraron diferenzas entre ambas as cepas, mentres que a nivel proteico estas cepas eran diferenciables.
Proteomics é considerado o seguinte paso no estudo dun sistema biolóxico, despois da xenómica e transcriptomic. A complexidade dos estudos proteómicos é maior, xa que o xenoma dun organismo é estático, mentres que o proteome difire dunha célula a outra e entre os estados. O termo proteoma6, definido por Marc Wilkins en 1994, é unha imaxe dinámica de todas as proteínas expresadas por un determinado organismo, célula ou compartimento subcelular, nun determinado momento e baixo certas condicións, constituíndo o mapa de expresión proteica dunha célula, tecido ou dada Organismo. Un factor de complexidade adicional son as modificacións que a estrutura básica ou a secuencia da proteína (por exemplo, o procesamento proteolítico) e as modificacións post-translacionales (PTM), que serven para modificar ou modular a actividade, a función ou a localización dunha proteína en diferentes ou diferentes fisiolóxicos ou contextos metabólicos. Finalmente, outro factor de complexidade é a lúa ou multifuncionalidade, na que a mesma proteína pode realizar varias funcións7.
Proteomics, un termo tamén acuñado por Wilkins, é un novo enfoque no estudo das proteínas que evolucionou en Anos recentes grazas á integración das tecnoloxías como métodos de separación de proteínas de alto rendemento, espectrometría de masas (MS) e, sobre todo, ferramentas en bioinformática que permitiron a análise dun gran volume de datos. Grazas á súa aplicabilidade, a proteómica permite non só identificar proteínas, senón que os categorizan e clasificalos sobre a súa función e interaccións.
O campo de estudo da proteómica é realmente amplo, pero podemos agruparlo en 3 subgrupos: a) Proteómica de expresión, cuxo obxectivo é identificar as proteínas presentes na mostra e obter toda a información sobre abundancias, PTM e localización subcelular; b) Proteómica estrutural, que permite a obtención da estrutura tridimensional das proteínas funcionais e c), cuxo obxectivo é coñecer a función das proteínas e coñecer as interaccións que poden facer.
Proteómico Técnicas Ofrecen unha nova e potente enfoque para o diagnóstico de patóxenos, disparos de brotes, dinámica de servidor patóxeno, control de enfermidades e desenvolvemento de drogas e vacinas.
A revisión actual está destinada a mostrar a gran variedade de Técnicas e aplicacións dispoñibles no campo das proteómicas dirixidas ao estudo das enfermidades infecciosas.
Metodoloxías proteómicas
As técnicas proteómicas implica moitas metodoloxías experimentais, como a electroforesis de 2 dimensións (2de), cromatografía líquida (LC e MS. A combinación destas técnicas cunha posterior análise bioinformática úsase para o estudo proteico dunha gran variedade de organismos. Estas técnicas son potencialmente valiosas, aínda que hai complexidades en mostras que poden afectar a súa análise e interpretación, como o grao de PTM, o rango dinámico de expresión (por exemplo, a abundancia de albúminas en máscaras de plasma, proteínas minoritarias) e problemas de detección de proteínas asociadas con membrana8.
O maior obstáculo para avanzar na área de proteómica é a dificultade de colección de patóxenos in vivo en abundancia suficiente e adecuadamente para as análises proteómicas. Mesmo sendo estas condicións axeitadas para estudos de expresión de proteínas en microorganismos patóxenos, hai casos en que non se pode realizar e a cultura axénica (in vitro) convértese na mellor opción. Multitude de patóxenos analizáronse utilizando técnicas proteómicas en condicións in vitro. Estes estudos permiten coñecer a magnitude da expresión proteica e ter unha idea global do seu proteome. Baseado únicamente no estudo do proteome baixo estas condicións pode causar a perda de información fundamental9-12, xa que non permite identificar proteínas implicadas na infección, como factores de virulencia, proteínas que permiten a evasión da resposta inmune do servidor e Proteína que permite o uso da maquinaria celular do servidor para estender. Unha simulación experimental das condicións de infección por infección é a infección das culturas celulares (simulación in vitro do ambiente de infección) ou o uso de modelos animais13,14. A desvantaxe nestes estudos reside na presenza dunha gran “contaminación” por proteínas do servidor, así como unha baixa obtida da biomasa do patóxeno.
En total, os enfoques experimentais en VIVO / EX teñen implicacións significativas con respecto a Para a identificación de novas vacinas, obxectivos para drogas, biomarkers de inflexividade e progreso da enfermidade.
A maioría das proteínas implicadas nas primeiras etapas da infección do servidor son as proteínas da superficie celular. Estas proteínas son a conexión entre a célula eo medio extracelular, polo que son o mediador principal da infección. Polo tanto, son compoñentes de gran interese para o desenvolvemento de novas vacinas e para a caracterización de novos obxectivos para as drogas. A información destas moléculas é a pouca representación en estudos proteómicos debido á súa baixa abundancia, pouca solubilidade e ao problema no seu fraccionamento sen contaminación por proteínas citoplasmáticas15,16. No caso do estudo das bacterias e fungos grampositivos, tamén é importante coñecer a composición de proteínas da parede celular e non só da membrana de plasma17.
Preparación de mostra
Obtención e preparación das mostras é un dos pasos máis relevantes nos estudos proteómicos. É de vital importancia que as mostras sexan tomadas e procesadas polo mesmo protocolo para que os resultados obtidos sexan veraces, reproducibles e que as diferenzas observadas non son o resultado do manexo.
O procesamento da mostra en O laboratorio difire segundo a orixe deste e do propósito do estudo. Nos estudos en cultura axénica, o illamento previo é necesario para a obtención da mostra de proteínas. Pola contra, cando o microorganismo analízase nun estado infeccioso, a preparación da mostra precisa dun illamento do microorganismo con respecto ás células do servidor.Os métodos máis utilizados para a separación son a centrifugación, a separación inmunominética (IMS) ea clasificación das células por citometría de fluxo (FACS).
O primeiro método, centrifugación, recoméndase para patóxenos con parede celular (plantas, Fungos, algas, arqueñas e bacterias grampositivas), a lise previa de células eucarióticas (servidor) por presión osmótica18,19 ou deterxentes como Tritonx-11413.
No segundo método, a técnica de IMS, as partículas magnéticas conxugadas Cunha inmunoglobulina específica (IG) contra o microorganismo dos intereses úsase. Estes microorganismos poden ser facilmente enriquecidos e purificados, xerando a biomasa suficiente de proteínas prácticamente gratuítas do servidor para unha exhaustiva análise de proteesas. A vantaxe máis importante sobre a centrifugación obtense unha mostra libre de contaminantes do servidor. Pola contra, esta técnica require anticorpos específicos contra as estruturas da superficie do patóxeno.
No terceiro método, os FACT, os anticorpos específicos utilízanse para a etiquetaxe fluorescente do microorganismo obxectivo, co fin de facilitar a Separación deste respecto a outros microorganismos ou detritos da célula hóspede. Esta técnica pode separar miles de partículas por segundo, pero a acumulación de material patóxeno suficiente para a aplicación de técnicas proteómicas require unhas cantas horas de clasificación, o que o fai moi caro.
Todos estes métodos de separación deben ser optimizados Para aumentar a velocidade de procesamento da mostra e reducir o risco de dixestión parcial por proteasas, ademais de reducir a probabilidade de contaminación coas proteínas do servidor.
Os estudos proteómicos poden dirixirse ao estudo do total de proteome, subproteoma ou unha proteína concreta. A selección dunha determinada poboación de proteínas ou proteínas debe ser realizada por un fraccionamento da mostra. Entre as técnicas utilizadas para este fin, vale a pena destacar a purificación de afinidade de tándem (co-ip) 21 eo chip de escaneo de peptidoma por hla22,23.
Técnicas proteómicas
As técnicas proteómicas están divididas en cualitativas e cuantitativas. O primeiro informar sobre a expresión ou non dunha determinada montaxe de proteínas ou proteínas (presenza / ausencia), mentres que a proteómica cuantitativa permite determinar e comparar a cantidade de proteína presente na mostra.
nos estudos en proteómica , a mostra é unha mestura complexa de centos de proteínas. Por este motivo, o uso dunha técnica de separación é esencial. Estas técnicas están agrupadas en: en xel e sen xel. As técnicas de xel son aquelas nas que se usa un marco de polímeros para a separación. As técnicas libres de xel realizan a separación da mostra de proteínas en solución por diferentes tipos de cromatografía líquida (intercambio de ións, afinidade, fase inversa …). A táboa 1 mostra as vantaxes e desvantaxes das diferentes técnicas proteómicas.
Resumo de As principais vantaxes e desvantaxes das técnicas de xel e gel de gel proteómica
alta resolución
Identificación fácil e secuenciación de biomarkers
Detección de isoformas dunha proteína
Limitación por baixa abundancia e proteínas hidrofóbicas
Proteína superposición
falta de automatización, laborosa
Limitación no número de experimentos
Ausencia de diferenzas de interposición
Redución da cantidade de proteína
proceso automatizado multidimensional
alta sensibilidade e resolución
Posibilidade de cuantificación
Número ilimitado de experimentos
Redución de custos debido á ausencia de marcación
Manipulación máis pequena da mostra
ID baixa Pouco abundante
Dificultade no conxunto dos péptidos triplesinizados
Menos precisión en cuantificación sobre marcación
proceso multidimensional multidimensional
alta sensibilidade e resolución alta precisión na cuantificación
alto custo de isótopos e sintético Péptidos
Gran manexo da mostra
Proteómica cualitativa sobre xel de xel
A separación das proteínas no xel é unha ferramenta que permite a separación destes por propiedades como o tamaño (Sr), o punto isoeléctrico (PI) e / ou a conformación (xeles nativos). A separación do xel pode ser realizada por unha única propiedade (monodimensional) ou por 2 propiedades consecutivas (bidimensional). Debido á complexidade dos extractos de proteínas totais, a separación de mostras en electroforesis bidimensional (2DE) ofrece unha maior resolución. A través desta técnica, as proteínas están separadas por IP e posteriormente por MR, obtendo un mapa global do proteome da mostra.
Técnica 2 só se pode aplicar satisfactoriamente se hai un mínimo de 108 celas illadas. Esta técnica permite separar entre 3.000-5.000 proteínas únicas24, xeralmente diferenciadas nun único lugar. Non obstante, a mesma proteína pódese identificar en diferentes lugares, indicando que esta proteína ten varias isoformas que difieren en PI e / ou mr. Estas isoformas poden informar sobre os posibles PTM dunha determinada proteína. Os PTMS máis frecuentes son fosforilaciones, glicosilacións ou proteólise limitada25. Outro fenómeno menos común é a identificación de dúas proteínas no mesmo lugar, debido á súa igual PI e ao señor.
A preparación da mostra para a electroforesis bidimensional é crucial para a obtención de resultados óptimos, sendo necesario Procesos de solubilización, desintegración, desnaturalización e redución de proteínas26.
A posibilidade ofrecida por xeles 2D é a súa combinación con técnicas de etiquetado de proteínas que permiten a comparación de proteínas no mesmo xel, evitando así as variacións de interposición (entre os xeles) / experimentos). Esta técnica é coñecida como un xel bidimensional diferencial (2D-DIGE). O etiquetado por fluoróforos pódese aplicar ao estudo comparativo de 2 proteomas que permiten unha cuantificación relativa das mostras. Este marcado pode ser dirixido a conxuntos de proteínas específicas; Por exemplo, o estudo das proteínas con rexións expostas ao medio extracelular. A aplicabilidade desta técnica permitiu o estudo de Surfade27 evitando a fraccionalidade das proteínas superficiais, que adoitan ser longas e caras.
Os xeles de 2D-diga poden ser aplicados á busca de obxectivos terapéuticos analizando o in vitro Proteome contra o proteomo do patóxeno nunha situación de infección, obtendo no mesmo xel o comparativo do proteome en ambas situacións. Debido á dificultade de obter unha mostra suficiente de patóxeno nunha situación de infección, realizáronse estudos nos que se compara o proteome do microorganismo in vitro en diferentes fases de crecemento. No traballo de Hayashi et al.28, as proteínas expresadas pola Legionella Pneumophila foron estudadas en 2 fases de crecemento: exponencial e posttexponcial, observando unha alta expresión de factores de virulencia na fase posttestial. Grazas a este estudo, pódese establecer no futuro traballo no proteome de fase posttestial como unha aproximación do proteome na infección.
Unha desvantaxe significativa da segunda técnica é a limitación na capacidade de enfoque de proteína de abundancia de media a baixa abundancia debido á gran variedade de niveis de expresión proteica. As proteínas máis afectadas por esa limitación son proteínas de membrana e proteínas de baixo peso molecular, que están subrepresentadas en proteínas totais. Estas proteínas poden ser mellor detectadas por outras técnicas proteómicas29.
Técnicas gratuítas de xel
A técnica sen gel require unha primeira separación das proteínas presentes na mostra por cromatografía líquida por diferentes propiedades, definidas segundo a columna usado. Existen diferentes tipos de columnas no mercado, o máis usado sendo a fase inversa, intercambio iónico, afinidade e exclusión molecular. Posteriormente, unha análise realízase por MS para a identificación das proteínas (LC-MS / MS).
As técnicas de separación sen gel son recomendables cando a cantidade de mostra é escasa, como é o caso de Experimentos en infección nas que se obtén un baixo número de microorganismos. Nestes casos, as técnicas de MS libres de gel son axeitadas para ofrecer unha mellor sensibilidade, xa que permite monitorear 500-600 proteínas a partir de só 106 celas14 (unha cantidade 100 veces menor que en xeles de 2D). Esta técnica permite a detección de proteínas difíciles de separar en 2DE, como proteínas moi hidrofóbicas, proteínas de membrana e proteínas de Pi-Ends, como proteínas ribosómicas cun PI30-32 básico. Un exemplo claro no que se demostra esta maior sensibilidade é o traballo realizado en Mycoplasma Genitalium, un modelo de xenoma e proteome mínimo, no que a fracción rica en proteínas de membrana foi estudada por Tritton Fraccionation114. A análise desta fracción foi realizada tanto por 2 como por LC-MS, obtendo unha clara diferenza en termos de número identificado de proteínas. A través de 29, identificáronse 49 proteínas, mentres que 242 proteínas foron identificadas33 por LC-MS.
Proteomics cuantitativos
Proteomics cuantitativos é unha ferramenta útil para as análises proteómicas de LC-MS / MS34. Os métodos de cuantificación poden clasificarse nunha cuantificación relativa / absoluta ou con / sen etiquetaxe.
Os métodos de cuantificación relativa (ICAT, ITRAQ, IPTL ou SILAC) úsanse para a comparación de proteínas ou abundancias peptídicas entre mostras. Doutra banda, a través do uso de péptidos sintéticos marcados isotópicamente, obtense unha cuantificación absoluta dos péptidos obxecto de aprendizaxe.
Proteómica cuantitativa marcando
Técnicas cuantitativas por etiquetaxe utilizando compostos isotópicos para unha análise posterior por MS, obtendo unha cuantificación relativa. A etiquetaxe de proteínas pode realizarse durante o crecemento celular ou unha vez que se realizou a extracción destes. As mostras a comparar son diferenciadas por etiquetaxe isotópica. Segundo a técnica de marcado, diferenciamos: ICAT (Isotope Code Affinity Tagging: Marca de afinidade con codificación isotópica) 35, ITRAQ (Multiplexionado Taging IsoBaric Química: Etiquetación de múltiple Isobaric) 36 e IPTL Péptido) 37.
A cuantificación relativa mediante a marcación permite a comparación de dúas poboacións segundo o seu crecemento celular por parte do silacio (etiquetado de isótopos estable por / con amininoácidos na cultura celular: aminoácidos isotópicos estables na cultura celular) .. Nesta técnica, os marcadores isotópicos non radiactivos están incorporados durante a célula de crecemento a proteínas sintetizadas non Novo38-41.
As técnicas de cuantificación significativas teñen certas limitacións, como é o aumento da complexidade na preparación da mostra ( polo tratamento independente da mostra), a necesidade dunha gran concentración disto, os altos custos dos reactivos, marcas incompletas que distorsionan o resultado ea necesidade de software específico para a cuantificación.
Proteomics cuantitativo marcación gratuíta
As estratexias de marcación gratuíta poden usarse para a cuantificación de relativa e absoluta. Estas técnicas alcanzan maior velocidade, resultados máis limpos e unha simple análise dos resultados. Por este motivo, están prometendo na cuantificación de proteínas pouco cubertas debido á súa alta sensibilidade, aínda que a aplicar certos criterios deben terse en conta: a) É necesario ter espectrómetros de masas con alta precisión e instrumentos de HPLC cun tempo seguro de retención; b) Debe aplicarse material suficiente para determinar a concentración de proteínas antes da medición por MS co obxectivo de aplicar cantidades equivalentes de péptidos e c) o número de péptidos da célula anfitrión debe ser minimizado para evitar falsos positivos.
A cuantificación das proteínas por este método xeralmente está baseada en 2 categorías: a) Medición dos cambios de intensidade dos iones, xa sexa por picos ou pola altura destes en espectrometría e b) Conde de espectros de proteínas identificadas despois da análise MS / MS42-53.
Unha mellora en proteómica cuantitativa sen etiquetaxe é a incorporación de péptidos sintéticos marcados isótopicamente como estándares internos. Estes péptidos permiten unha cuantificación absoluta (aqua: cuantificación absoluta) dos péptidos de interese 54.
Instrumentos de análise e identificación de proteínas por espectrometría de masas
A identificación das proteínas realízase máis a través de espectrómetros de masas. Estes instrumentos permiten obter ións de moléculas orgánicas, separándoas e detectándoas dependendo da súa masa / carga (m / z). Os espectrómetros de masas consisten en 3 compoñentes: fonte de ionización, analizador de masas e detector. Existen diferentes tipos de espectrómetros de masas segundo a combinación dos diferentes elementos. Os máis utilizados son:
- •
Maldi-tof (Matrix-asistido por láser / ionización-ionización de voo: eliminación / ionización por láser asistida por matriz, “tempo de voo”) : Comunmente usado para a identificación de proteínas mediante unha pegada peptídica e o estudo dos perfís de proteínas dunha mostra e as interaccións proteínas. Cómpre destacar o desenvolvemento da técnica de “imaxe”, que permite unha visualización tridimensional da distribución de metais, metabolitos, lípidos de superficie, péptidos e proteínas, directamente nos tecidos sen ter unha pre-extracción ou extracción .55.56.
- •
Seldm-tof (Surface mellorada por láser ionización de ionización de ionización de voo: Desorción / ionización por láser de superficie mellorada, “tempo de voo”): este instrumento usa a mesma tecnoloxía que A MALDI-TOF que incorpora a funcionalización da placa (intercambio de ións, fase inversa, anticorpos, ADN, outras proteínas, etc.) en que se carga a mostra. A comparación das proteínas mantidas na placa entre diferentes mostras pódese usar para a busca de biomarkers57.
- •
ESI (ionización electrospray: ionización por electrospray): este dispositivo é especialmente útil Para a secuenciación do péptido, xa que permite a ionización das macromoléculas por fragmentándoas polos enlaces peptídicos (sindicatos máis débiles), obtendo así a secuencia de aminoácidos56.58.
Bioinformática
Proteómica As análises xeran unha gran cantidade de datos a analizar. O desenvolvemento de ferramentas bioinformáticas, como a introdución de novos algoritmos, foi fundamental para manipular os devanditos conxuntos de datos. Este campo permite e facilita a manipulación de datos a grande escala, desenvolvendo programas e ferramentas de busca axeitadas. Estas ferramentas foron aplicadas con gran éxito no procesamento de datos de MS, tanto na análise peptídica (identificación de proteínas), pegada de fragmentación peptídica (identificación da secuencia peptídica) e en nova secuenciación.
Hai unha multitude de Programas que permiten a identificación en sílice de proteínas. Nos estudos proteómicos en enfermidades infecciosas hai programas que permiten a identificación e caracterización dos epitopios do patóxeno que interactúan co sistema inmunitario do servidor, o inmunoma. As interaccións de patóxeno non son coñecidas en profundidade en moitas das enfermidades infecciosas, polo que os estudos bioinformáticos poden dirixir o estudo destas interaccións.
Aproteoma de microorganismos
Os estudos do proteome total dos microorganismos patóxenos son moi valiosos En termos de información que se obtén a partir da expresión proteica nunha condición dada. Noutros estudos é máis interesante obter información de certas subproteomas, como as proteínas expostas na membrana ou saben que as proteínas desencadean a resposta inmune no servidor. Paga a pena destacar o papel dos PTMs na interacción entre o patóxeno eo servidor, polo que se debe ter en conta o seu estudo en microorganismos patóxenos.
membrana, superficie e segredo
O subproteoma de membrana constitúe un conxunto de Proteínas relacionadas coa infección. Existen técnicas para a detección das proteínas expostas na superficie celular (surfoma), así como a etiquetaxe específica por fluoróforos na escavación 2D e a céspede de cela. A técnica de afeitar celular utilizouse de forma satisfactoria en varios patóxenos humanos grampartivos como en estreptococcus59 ou Staphylococcus aureus60, aínda que a súa aplicabilidade aínda non se coñece a súa aplicabilidade nas bacterias gram-negativas.Estas bacterias teñen unha envoltura celular menos ríxida e menos resistentes que as grampositivas, de xeito que o “afeitado” compromete a integridade da membrana e causa a lise celular. Como alternativa a estas técnicas, os protocolos de extracción de proteínas de membrana existentes foron mellorados a través de diferentes deterxentes ou illamento de membrana61, como é o caso do uso do buffer de carbonato para a eliminación de proteínas solubles en contaminación nas mostras.
As proteínas secretas constitúen un importante subproteoma e poden desencadear a lisis das células anfitrionas por toxinas, que poden influír na adhesión, colonización e invasión, así como a desviación da resposta inmune de Host62-66. Este importante grupo de proteínas pérdese durante o procesamento de bacterias intactas67.68. As proteínas das vesículas de membrana externa (OMV) son un subproteoma moi importante en patóxenos, xa que desencadean reaccións inmunoxénicas potentes cando se liberan polo microorganismo ao medio extracelular. As vesículas producidas por Neisseria Meningitidis foron utilizadas polo seu efecto inmunotrotector contra este patóxeno69.70.
Biofilms
Biofilms están formados por unha robusta biocapa de microorganismos e matriz extracelular. Esta estrutura permite células que compoñen a unión a superficies artificiais ou bióticas, o que dificulta a eliminación dos microorganismos que compoñen IT71. Os bacterianos bacterianos representan unha antiga estratexia de supervivencia procariótica. Donlan72 definiu o biofilm como unha comunidade microbiana sesile, caracterizada por células que se adheriron irreversiblemente a un substrato ou interface, ou algúns con outros, incrustados nunha matriz de substancias de polímeros extracelulares que produciron exhibindo un fenotipo alterado en relación coa taxa de Crecemento e transcrición xenética. O biofilm proporciona bacterias incrustadas nestas vantaxes significativas contra as flutuacións ambientais de humidade, temperatura e pH e reserva de nutrientes73. Por este motivo, as diferenzas na abundancia de proteínas entre as células cultivadas en biofilm e as células celulares das plantas foron estudadas a través da segunda técnica con manchas de prata en Candida Albicans. Como resultado desta comparación, observouse que as células cultivadas en biofilm tiñan unha menor capacidade anti-oxidativa ademais de ter a proteína PIL1P, a proteína sensible ao tratamento cun determinado tipo de antifungales74. Este resultado permitiu atopar un obxectivo e tratamento efectivo contra o estado máis resistente destes leveduras.
Identificación de microorganismos e sensibilidade á antimicrobiana
A identificación de microorganismos que causan a infección polo mínimo posible. Polo tanto, un amplo campo de investigación é a busca de técnicas de identificación alternativas ao fenotípico / metabólico, que requiren, ademais do illamento do microorganismo, entre 18-24 horas máis para a identificación desta. Unha opción para a identificación rápida dos microorganismos é a optimización do MS. Na revisión de Jordana-Lluch et al.75, o uso desta técnica e os avances obtidos ata agora explícase en detalle.
A aplicación do MS na identificación de microorganismos require só o illamento e unha media de 5 minutos; Non obstante, neste proceso, non se obtén datos sobre sensibilidade antimicrobiana. Para obter esta información, a realización das probas de sensibilidade de microorganismos é necesaria, pero as probas requiren un tempo engadido. Estudos realizáronse utilizando o MS para detectar a presenza de betalactamasas, diferenciar entre s.aureus sensibles e resistentes á minicilina e mesmo detectar factores de patoxenicidade76-79.
Busca biomarcadores en fluídos corporais
Os biomarcadores facilitan o desenvolvemento de ferramentas de diagnóstico específicas, controlando a resposta á terapia ou o progreso da enfermidade80. Cando analizamos mostras biolóxicas (de procedencia de modelos humanos ou animais), a dificultade reside na creación de grupos homoxéneos para garantir unha boa correlación de resultados. Por este motivo, a estandarización da clasificación das mostras é esencial.
A comparación dos fluídos entre pacientes e controis pode permitir a identificación de proteínas diferenciais. Estas proteínas poden usarse máis tarde como un método de diagnóstico rápido. Un estudo deste tipo realizouse co virus Hepatitite (HEV), no que o plasma ea orina de pacientes infectados foron analizados por mostras de control de 2D-excents. Demostrouse que máis de 30 proteínas foron expresadas diferencialmente en pacientes con aguda HEV con respecto aos controls81.Estes resultados demostran o potencial das proteómicas na busca de biomarcadores.
As proteínas diferenciales obtidas en comparación entre pacientes con diferentes graos da enfermidade poderían ser utilizados para determinar o pronóstico do paciente.
Immunoma
A inmunoproteómica é unha ferramenta potencialmente útil no campo da procura de biomarcadores para enfermidades infecciosas, especialmente en situacións nas que o patóxeno é difícil de cultivar en vitro82-85. Seldi a tecnoloxía foi aplicada moi recentemente na identificación de biomarcadores para discernir as cepas de helicobacter pylori asociados a diferentes estados de enfermidade86. Deste xeito identifícanse as “sinaturas” de anticorpos en serum83.84.
A identificación e caracterización das proteínas antigénicas é un requisito para o desenvolvemento das vacinas, xa que teñen un gran interese como alternativa terapéutica ao tratamento. Para a investigación da inmunorreacción de anticorpos humanos ou anticorpos de modelos animais contra proteínas microbianas, a combinación de 2DE e inmunoblotting representa o método de elección. Os extractos totais de proteínas do microorganismo patóxeno están separados por 2ª e as proteínas inmunorreactivas detéctanse por inmunobras 2D con soro de pacientes infectados, en comparación co patrón obtido con SERA control87. As proteínas que xeran un sinal diferencial entre ambos grupos identificáronse por pegada peptídica.
A expresión proteica varía segundo o Estado e condición de crecemento dos microorganismos. Por este motivo, é aconsellable realizar as inmunoblottings con extracto de proteínas do microorganismo cultivado en vivo, para evitar variacións transcriptionistas, translacionais e postgraductivas entre os cultivos in vivo.
A inmunoproteómica é útil para proporcionar propostas xeral Diagnóstico ou para a selección de biomarcadores83. Ademais, esta metodoloxía pode ser facilmente aplicada a múltiples infeccións humanas e veterinarias de gran importancia debido á súa incidencia e gravidade88-96.
Vacinas e drogas
A selección de obxectivos para drogas e / ou vacinas é esencial para A obtención dun resultado óptimo no control e / ou tratamento dunha enfermidade infecciosa. Os criterios a ter en conta para seleccionar un obxectivo son: a) que é esencial para a infectividade e proliferación do patóxeno no servidor; b) que ten unha baixa redundancia no patóxeno, aínda que ten unha alta redundancia nas pistas do anfitrión, sempre que os efectos tóxicos poidan ser mitigados; c) que é expresado amplamente e de forma consistente nos tecidos de infección e nos diferentes pacientes da poboación, e d) que sexa tratable terapéuticamente usando pequenas moléculas como siRNA, anticorpos ou outras modalidades farmacéuticas.
A vacina inversa é unha técnica utilizada na busca de novos obxectivos. Este enfoque permite unha selección a favor das proteínas con potencial inmunoxénico. Os datos obtidos do proteome durante a infección poden ser explotados como base para o desenvolvemento de novas quimioterapias e vacinas antimicrobianas. Unha baixa proporción destas proteínas pódese usar como obxectivo para a quimioterapia antimicrobiana97 ou como antíxeno para vacunas de protección98. Algúns patóxenos nos que se levou a cabo o estudo do inmunoma: Chlamydia pneumoniae, Haemophilus Influenza, Neisseria Meningitidis, Helicobacter Pylori, Bacillus Anthracis, Streptococcus agalactiae, Mycobacterium Tuberculosis e Mycobacterium Bovis98-111.
Conclusión
La Proteómica É unha ferramenta verdadeiramente útil no estudo das enfermidades infecciosas, proporcionando unha visión global. As análises proteómicas permiten a realización dun estudo básico da enfermidade, facilitando a busca de marcadores de infección ou virulencia. Posteriormente, os resultados obtidos teñen unha aplicabilidade translacional dirixida ao diagnóstico e pronóstico da enfermidade, ademais de permitir o desenvolvemento de novas terapias antimicrobianas e o avance da vacina.
Técnicas proteómicas non só permiten a identificación de novos marcadores, pero pode ser implantada como técnicas de diagnóstico rápido, podendo o tratamento directo con maior velocidade evitando in vitro culturas, que esixen tempos de incubación longos, retardando o diagnóstico, así como xerar falsos negativos nestes microorganismos viables pero non cultivadas.
Esta revisión mostra como proteómica é unha poderosa ferramenta de investigación. Ata o día de hoxe, moitos expertos consideran que as técnicas de proteómica son útiles no descubrimento de proteínas de interese clínico, como biomarcadores, pero a súa aplicabilidade de asistencia é baixa.O resultado obtido no traballo de investigación baseado en proteómicos está adaptado a técnicas convencionais como Elisa, pero estas non se mantén como ferramentas de diagnóstico. Esta revisión ten como obxectivo mostrar aos expertos das novas técnicas de campo clínico dispoñibles para resolver as dificultades que se producen día tras día.
Actualmente, a proteómica é unha área valorada pola súa utilidade clara, aínda que aínda hai moito de traballo que realiza en áreas como enfermidades infecciosas. Para mellorar a súa utilidade no futuro, debemos concienciar entre todo o persoal involucrado no campo da asistencia sanitaria da súa importancia, así como integrar os resultados dos estudos de toda “omica”. Este último aspecto é de gran importancia, xa que, por exemplo, o coñecemento do xenoma dun microorganismo é de vital importancia para a interpretación dos resultados proteómicos.
Outro aspecto limitante da microbioloxía clínica é o illamento do microorganismo para a identificación posterior. Eliminando este paso, tanto a xenómica como a proteómica mellorarían a súa aplicabilidade na identificación do patóxeno nunha infección. Polo tanto, estas melloras permitirían a aceptación das técnicas proteómicas no ambiente de atención para a detección e diagnóstico en enfermidades infecciosas, reducindo o tempo e os custos.
Conflito de interese
Os autores declaran non ter ningún conflito de intereses.