METOS
- Mitosis
- microtúbulos
Resumo
O eixe mitótico consta de dous tipos de microtúbulos. Os microtúbulos dinámicos de cinetocoros capturan cinetocoros, mentres que os microtúbulos interpolares estables serven como unha columna vertebral estrutural que conecta os dous polos do eixe. Crese que ambos son indispensables para a división celular en eucariotas. Aquí mostramos que os microtúbulos interpolares son prescindibles para a segunda división da meiosis na fermentación de fisión. Mesmo cando os microtúbulos interpolares son interrompidos por un microtúbulo de representación de drogas, os polacos de eixe están separados e os cromosomas secretan o polo na segunda división da meiosis na maioría dos ciges, producindo esporas viables. A membrana da Forespora, que encapsula o núcleo na segunda división da meiosis e está guiado por proteínas de septin e de punta, é responsable da realización de eventos meióticos en ausencia de microtúbulos interpolares. Ademais, durante a segunda división fisiolóxica da meiosis sen a perturbación dos microtúbulos, a asemblea da membrana das esporas estrutura estruturalmente á separación do vencemento e a división nuclear, xerando forza suficiente para a separación do vencemento e eventos posteriores Independentemente das microtúbulas interpolares.
Introdución
Os microtúbulos teñen funcións esenciais na división celular dos eucariotas. O eixe mitótico consta de dous tipos de microtúbulos: microtúbulos de cinetocoro (ktmts) e microtúbulos interpolares (ipmts) 1, 2, 3. O KTMT repite dinámicamente a polimerización ea depolimerización dos dímeros α / β-tubulina, capturando e tirando os cachecadores cromosómicos. Pola contra, a estable IPMT servirá como a rede de tronco estrutural que conecta os dous polos 4 do eixe.
A necesidade de microtúbulos de eixo para a segregación dos cromosomas foi demostrada en moitos estudos durante as últimas décadas , o uso de medicamentos ou tratamento con frío para despolimerizar os microtúbulos, así como o uso de células mutantes defectuosas na organización de microtúbulos. O requisito de KTMTS parece evidente, xa que unha falla na unión de microtúbulos de cinetocoro pode causar aneuploidy 5. Sábese que a proteína ASE1 / PRC1 asociada aos microtúbulos agrupa o IPMT na zona media do eixe na finais da mitosis (Anafa) 6, 7, 8, 9. A disfunción de ASE1 / PRC1 non afecta a unión dos microtúbulos de cinetocoro na metafase, senón que causa un colapso do eixe na anafase, que moitas veces leva á produción de aneubloides. A aneuploidia pode levar á inestabilidade xenómica e, polo tanto, está intimamente relacionada coa tumorigenesis 10. Polo tanto, crese que ambos tipos de microtúbulos son indispensables para a segregación cromosómica correcta nos eucariotas. A maior parte deste coñecemento, con todo, baséase en estudos de células mitóticas, e enténdese pouco se esta propiedade é compartida con células meióticas.
Neste estudo, realizamos observacións de células vivas en células. Mitótico Como meítico de fisión de fermento esquizosacaromyces pombe para reevaluar a importancia biolóxica dos microtúbulos na segregación dos cromosomas. Engadimos un microtúbulo de representación de medicamentos, metil-2-benzimidazole-carbamato (MBC), a células de tipo salvaxe antes da división mitótica ou meiótica e supervisa a progresión do ciclo celular usando a microscopía de fluorescencia en tempo real (Fig. S1a complementaria. A vida de Pombe ciclo). Descubrimos que IPMT está prescindible na segunda división da meiosis (MII), contra a crenza xeral dun requisito absoluto de microtúbulos. A separación do polo de eixe e os acontecementos posteriores ocorreron normalmente mesmo en ausencia de IPMT en IMA. Ademais, identificamos que a membrana das foreporas, que encapsula o núcleo, é responsable da xeración da forza para separar os polacos en lugar dos microtúbulos. Inesperadamente, mesmo cando os microtúbulos estaban intactos, a eliminación da membrana das esporas reduciu a proporción da separación do vencemento. Propoñemos que a membrana das foreporas sexa o primeiro material non microtubular que produce a forza para a división celular en condicións fisiolóxicas.
Os microtúbulos interpolares son prescindibles no IMA.
Os microtúbulos foron amosados coa proteína fluorescente verde (GFP) etiquetada con α2-tubulina (ATB2), o corpo do cusco (SPB; un fúngico equivalente Centrosoma) foi marcado coa proteína fluorescente de CII ( CFP), o compoñente medio SFI1 SFI1 (SFI1-CFP) (SFI1-CFP) eo cinetocorus estaban marcados con fábrica MIS6 (MIS6-2MCH) etiquetada a partir de 2 m. Durante a mitosis normal en ausencia de MBC, os microtúbulos que nuclearon os dous SPB interactuaron para formar un robusto eixe bipolar e separar a SPB 11, 12 (Fig. 1A). Ata a metafase, a rexión de eixe central mostrou un sinal de GFP-ATB2 relativamente tenue (12 min), que reflectía o feito de que varios KTMT curtos situáronse preto de SPB, mentres que IPMT conectaba os dous SPB 4 (Fig. Adicional S1B) para un esquema). Na Anafase B (22 min), o eixo foi alargado a través da interdigición IPMT deslizándose na zona media do eixe. Observáronse propiedades similares para o eixe en Meiosis I (MI) e en Mii (Fig. 1B, Figura S1C S1C). Engadimos a MBC e observamos células que acababan de entrar en mitosis. Como era de esperarse, a nucleación dos microtúbulos do SPB foi severamente inhibida, eo SPB nunca se separou en presenza de MBC (90 min, figura 1C e Fig. S1D Suplementario), que confirma a importancia dos microtúbulos da división mitótica. Pola contra, cando os MBC foron engadidos aos cigotes antes do MII (0 min, a figura 1D), os SPBs poderían separarse, aínda que a microcubulación foi significativamente inhibida pola MBC (Fig. S1EE complementario). Un sinal GFP-ATB2 foi detectado só en torno aos polacos de eixe, o que indica que os IPmts que conectan os dous SPBs foron interrompidos (42 min). En presenza de MBC, só se detectaron microtúbulos curtos asociados a CineCochers (Fig. 1e), o que suxire que poderían servir como KTMT. Os cinetocors foron igualmente separados aos dous polos na maioría das células tratadas con MBC (ver a continuación), o que indica que os curtos microtúbulos eran suficientes para a captura e a conexión dos cinetocoros a SPB. Non só a separación de SPB ea segregación dos cromosomas, senón tamén a división nuclear realizáronse con éxito en presenza de MBC (Fig. 1F).
(a – e) Células vivos imaxes de usar celas GFP-ATB2 (microtúbulos, verde), MIS6 -2mcherry ( MIS6-2MCH, cinetoquores; vermello) e SFI1-CFP (SPB, azul). As imaxes de lapso de tempo celular que experimentan a mitosis normal (a) e a meiosis II (MII) (b) móstranse. Para as células Mii en B e D, as rexións desbotadas dos cigotes son ampliadas como imaxes de lapso de tempo. A forma das células está descrita en curvas de puntos; n = 10. (c) Engadiuse unha droga de despolimerización de microtúbulos, MBC, a unha cela que entra na mitosis (0 min), xusto antes da separación con SPB. A MBC inhibiu a formación de microtúbulos e separación do SPB ata o final da observación (90 min). (D) MBC engadiuse a unha cela que entra mii (n = 14). As puntas de frecha indican que se produciu unha separación de SPB mesmo en ausencia de IPMT. (e) Kymographs of Time Lapse of the Wydles durante Mii, sen (esquerda) e con (dereita) MBC (n ≥10). As rexións rectangulares que conteñen os eixes están recortados desde o tempo de lapso e aliñan ao longo do tempo. Spbs e cinetocoros separáronse incluso en ausencia de IPmts (dereita). A lonxitude das frechas corresponde a 5 min. (f) A división nuclear de Mii Cigotos sen (esquerda) e con (dereita) MBC foi monitoreada co marcador de envoltura nuclear Cut11-3MRFP (vermello), xunto con GFP-ATB2 (verde) (n ≥6). As rexións enmarcadas están ampliadas como imaxes de caducidade de tempo a continuación. (G) Cut7-446 Zigotos mutantes suxeitos a Mii que marcaron con GFP-ATB2 (verde), MIS6-2MRFP (vermello) e SFI1-CFP (azul) (n = 6). Durante o MII, os SPBs foron separados e o eixe bipolar foi formado a temperatura restrictiva (32 ° C), na que as células mitóticas fallaron na separación de SPB co eixe monopolar. Barras de escala, 2 μm.
imaxe de tamaño completo
Porque é posible que o efecto da MBC sexa parcial e que segue sendo unha cantidade indetectable de IPMT e podemos levar á separación de CABO Desde SPB e eventos posteriores, examine o corte Cut7 no noso sistema. Cut7 é a fisión ortogum levadura do BIMC / EG5 / Kinesin-5 Kinesin 12, 13. Cut7 conecta microtúbulos antiparais que emanan de cada SPB e deslízanse os microtúbulos cara a fóra, separando así os SPBs. Durante a mitosis, os SPBs no corte mutante sensible á temperatura CUT7-446 fallaron a ser separados a temperatura restrictiva, o que resultou na xeración de fusos monopolares 13 (Fig. S2 complementaria).En contraste, os SPBs foron separados durante Mii en Cigotos de 7 a 446 a temperatura restrictiva (Fig. 1G). Isto mostra que a separación de SPB durante MII non está baseada na interacción IPMT mediada por Cut7. Polo tanto, concluímos que IPTTS son prescindibles ao realizar eventos de fase esenciais, como a separación de SPB, a segregación dos cromosomas ea división nuclear en Mii (Fig. S3 complementaria).
Segregación normal de cromosomas en ausencia de Ipmts en Mii
As células mitóticas tratadas cunha alta dose de MBC xeralmente resultan nun fenotipo de “corte” letal, que mostra unha citocinesis forzada con cromosomas non cocidos 14, 15, 16. Para determinar se a división IPMT independente observada durante o IMA podería resultar nunha segregación anormal dos cromosomas, as centrómetros do cromosoma II (CEN2) con GFP (o sistema CEN2 – GFP 17) foron etiquetados e as células foron filmadas para facer kymographs .. Durante a mitosis na ausencia de MBC, un único punto SFI1-CFP dividiuse no inicio mitótico (Fig. S4A suplementaria). Simultáneamente, os céntricos CEN2 – GFP comezaron a oscilar entre os dous spbs á metafase. Os puntos CEN2 – GFP foron entón separados cara a cada SPB (ANAFASE A), ea distancia inter-SPB aumentou, reflectindo a alongación do eixe (Anafase B) 17, 18. Unha cinética similar foi observada durante Mii (WT Mii, -mbc, Fig. 2A). Cando a MBC foi engadida ao comezo mitótico, os SPBs deixaron de dividir e o CEN2-GFP cesou cesou a oscilar (Fig. S4B complementaria), o que provocou un fracaso na segregación dos cromosomas. En contraste, o 80% dos cigotes Mii tratados con MBC segregados de dous polaco CEN2- GFP (WT MII, + MBC, Fig. 2A, B), que indica de novo que o MII é moito menos sensible á MBC que a mitosis e a IM .
(a) kymographs de As células salvaxes (WT) e MAD2 sufriron que experimentan Mii en ausencia (-) ou presenza (+) de MBC (n ≥14). Os centromeres do cromosoma II foron marcados con GFP (CEN2-GFP), eo seu SPB foi controlado con SFI1-CFP (vermello). MBC foi engadido antes da separación de SPB. A lonxitude das frechas corresponde a 5 min. (b) A exactitude da segregación dos cromosomas durante a IMS en tipo salvaxe e MAD2 foi cuantificada (TIN non vinculada, n ≥14). Tamén se amosan imaxes típicas para a segregación de CEN2-GFP igual e desigual. (c) A duración do MII foi medido ao controlar os sinais CUT11-3MRFP. Cut11-3MRFP formou focos no SPB na entrada de Mii e desapareceu ao comezo da anafase. As liñas do diagrama de caixa e os bigotes pequenos son o valor máximo, o percentil 75, a mediana, o percentil 25 eo valor mínimo (n ≥16). Os asteriscos indican valores atípicos. (d) Localización de MAD2 durante Mii en ausencia (esquerda) ou presenza (dereita) de MBC (n ≥10). Mad2-MCherry (Mad2-MCH, RED) foi monitorizado con MIS6-2GFP (verde) e SFI1-CFP (azul). O tempo en que os focos de Mad2 apareceron por primeira vez nos cinecarios é designado como 0 min. A adición de MBC mantivo a Mad2 nos cinetocoras durante máis de 12 minutos, momento no que o Foci Mad2 trasladouse a SPB en ausencia de MBC. Barras de escala, 2 μm. (e) A duración da ubicación de MAD2 nos cinetocoros con ou sen MBC foi determinada a partir das observacións en d. Teña presente que a localización de Mad2-Barry en SPB, o que significa que hai unha liberación de activación do punto de control, non se conta aquí. As liñas no diagrama de caixa e os bigotes pequenos son o valor máximo, o percentil 75, a mediana, o percentil 25 eo valor mínimo (n ≥10). Os asteriscos indican valores atípicos. (f) A progresión meiótica da cultura síncrona Diploid Pat1-114 foi monitoreada contando o número de núcleos por célula en cada punto de tempo. A meiosis foi inducida polo cambio de temperatura (a 0 h). MBC engadiuse cando a poboación de células binucleadas (Post-Mi) estaba a un máximo (ás 3,3 h). (g) a viabilidade das esporas das células diploides PAT1-114 tratadas con ou sen MBC como en F foi examinado por análise de tetrade (n > 300).
Imaxe de tamaño completo
Na mitosis e IM, o punto de control do conxunto de fusos (SAC) funciona para controlar a conexión dos microtúbulos ao cinetocorus. Os compoñentes do SAC, incluíndo MAD2, recoñecen cineteadores unidos e inhiben a activación do complexo promotor / ciclosoma de anafase, de xeito que as células poden esperar en metafase ata que a unión mellora 19. Durante a mitosis, a MBC causa defectos no eixo e SAC activo 15, 20. É posible que a actividade do SAC sexa necesaria para IPMT Independent IMI causada pola MBC.Deste xeito, controlamos o comportamento CEN2-GFP no mutante de eliminación MAD2 (MAD2 δ). En ausencia de MBC, os zigotos mad2 baixo experimentaron unha segregación cromosómica normal como nos cigotes de tipo salvaxe (MAD2 δ mii, -mbc, fig. 2A, b). Cando a MBC foi engadida ao comezo do MII, ~ 60% da exposición MAD2 Zigotes mostrou unha desigual segregación de CEN2-GFP, que foi significativamente maior que a segregación desigual ~ 20% que ocorreu en ciges de tipo salvaxe (figura 2b). Os Cigotos de tipo salvaxe tratados con MBC durante Mii mostraron un atraso ao comezo da Anafase II (Fig. 2C). Isto foi cancelado eliminando a MAD2, que indica que o atraso foi debido á activación do SAC (Fig. 2C). Segundo isto, Mad2-Mcherry mostrou unha localización prolongada de cineocoros en cigarros de tipo salvaxe en presenza de MBC (Fig. 2D, e). Estes resultados indican que, durante o MII en presenza de MBC, Mad2-SAC asegura a correcta vinculación dos microtúbulos aos cinetocadores, o que suxire que os restantes microtúbulos curtos que sobreviviron despois da adición do MBC realmente servir como ktmts e que o seu adecuado A adxunto a cinetocoros desactiva a vixilancia MAD2-SAC (Fig. S3E, F) complementaria. Estes resultados tamén indican que é improbable que a división independente do IPMT sexa un desajuste desregulado que conduce a unha segregación aleatoria dos cromosomas e do destacamento do núcleo de forma inadecuada, como as mutacións de corte letal.
a continuación, nós Avaliar se o tratamento con MBC durante o MII podería afectar a viabilidade das esporas. O mutante PAT1-114 foi usado para inducir a meiosis sincronizada 21, 22, 23. A MBC engadiuse ás 3,3 horas despois da indución da meiosis, cando a poboación celular con dous núcleos (é dicir, post-mi) estaba a un máximo (~ 90%, figura 2f). A MBC provocou unha redución da viabilidade das esporas ao 50% da das células tratadas simuladas (Fig. 2G). Este valor pode reflectir a fidelidade da segregación cromosómica: a frecuencia da segregación fiel da CEN2-GFP en células MCI tratadas con MBC foi do 80% (Fig. 2b), que implica que sería a frecuencia estimada da mesma segregación dos tres cromosomas 51% ((0.8) 3 = 0.512), que é comparable á viabilidade das esporas observadas na presenza de MBC.
A membrana FORESPORA é responsable do MII sen ipmts.
Dado que o IPMT foi prescindible para os eventos MII, pregúntanos o que podería servir como o piar estrutural para separar as SPBs e manter a estrutura bipolar independentemente do IPMT. Como Mii está acoplado á esporulación (o evento terminal na meiosis correspondente á gametogénesis nos eucariotas superiores), sospeitamos que algún sistema citoesquelético relacionado coa esporulación podería estar involucrado nos eventos independentes de IPMT. Un candidato podería ser a membrana de esporas, que é un precursor da membrana plasmática da esporas que rodea os núcleos durante o MII 24. A membrana das esporas foi mostrada coa proteína T-SNARE etiquetada con GFP PSY1 / SYNTAXIN 1 (GFP-PSY1) 25. Como se informou anteriormente, a membrana dos antepormes comezou a reunirse ao redor das SPBs en forma de media lúa despois de que foron separadas por IPMT (15 min, figura 3a). A membrana gradualmente encapsulou os núcleos como a Anafase II progresou (36 min e 72 min). Non obstante, nos Cigotos tratados con MBC, a separación de SPB sen IPMT ocorreu simultaneamente co inicio do crecemento da membrana das esporas (30-35 min, Fig. 3A). A membrana de esporas continuou crecendo e finalmente rodeaba os dous núcleos, o que resultou na súa división (100 min). Isto levounos á hipótese que, en ausencia de IPmts, a membrana da Forespora pode servir como esqueleto estrutural, cuxo crecemento ao exterior podería xerar unha forza que separa SPBs e restrinxe o núcleo.
(a) imaxes de células vivas de cigotos mii que portan gfp-psy1 (Spore membrana, verde) e CFP-ATB2 (vermello) en ausencia de MBC (arriba) (n = 18). MBC foi engadido antes da aparición de Mii (abaixo) (n = 18). A separación de SPB ocorreu de forma concomitante co inicio da montaxe da membrana das esporas. (B) Mii foi filmado por Spo15 que transportaba células que transportan GFP-ATB2, Miss6-2mcherry (Miss6-2Mch) e SFI1-CFP en presenza de MBC (n = 10). Os SPBs non se separaron ao final da observación (94 min). (c) o dobre mutante spo15 δ Cut7-446 que leva GFP-ATB2, Miss6-2Mcherry e SFI1-CFP están suxeitos a Mii a temperatura restritiva.O dobre mutante exhibiu o fenotipo do eixe monopolar (n = 8), indicando que a membrana de Foresporama ten un papel crucial na formación do eixe bipolar durante Mii en células Cut7-446. (d) Patróns de segregación das cromatías das irmás durante Mii en cigarros de tipo salvaxe e Meu14 δ SPN6 monitorizado monitorizado por CEN2- GFP con SFI1-CFP (proba de T-T-Tails de dúas colas, n ≥14). Tamén se amosan imaxes típicas para a segregación de CEN2-GFP igual e desigual. (e) A división nuclear durante Mii de Cigotos de tipo salvaxe e Meu14 δ SPN6 δ foi monitoreada por Cut11-Mcherry (Cut11-MCH); As células foron clasificadas como sometidas a división normal, división anormal ou sen división (n ≥18). Tamén se amosan imaxes típicas de cada categoría. (f) O anel anterior do borde formado no núcleo foi amosado con Meu14-Mcherry (Meu14-MCH) (n ≥ 24). (Cara arriba, esquerda) en ausencia de MBC, os aneis de bordo de ataque formáronse despois da separación de SPB. (Cara arriba, dereita) en presenza de MBC, os aneis anteriores de bordo formados a partir de cada SPB foron contactados entre si, que se mantivo durante a separación de SPB (indicado por un spb marcador, Cut12-CFP) e crecemento da membrana de esporas (mostradas con GFP). -Psy1). Tamén se amosan os debuxos esquemáticos dos núcleos (laranxa) e os aneis do bordo de ataque (vermello). (Parte inferior) O complexo de setembro foi mostrado con SPN6-MCherry (n ≥ 8). (Abaixo á esquerda) en ausencia de MBC. (Abaixo á dereita) en presenza de MBC. Os debuxos tamén se amosan para núcleos (laranxa) eo complexo septine (vermello). Barras de escala, 2 μm.
Imaxe de tamaño completo
Se a membrana de forasporms conduce a separación de SPB en ausencia de IPMT, a inhibición simultánea da membrana das foresporas ea formación de microtúbulos fará que sexa difícil. Para probar esta posibilidade, usamos o spo15 δ mutante, no que os SPBs non se modifican correctamente e a membrana do Foresporama non se monta como 27. A separación de SPB nunca foi observada nas células tratadas de Spot Spo15 tratadas con MBC (94 min, figura 3b), que demostra que, de feito, foi a membrana da Forespora que impulsou a separación de SPB en ausencia de IPMT. Ademais, non se observou ningunha segregación de cromosomas ou división nuclear. Do mesmo xeito, a separación de SPB que tivo lugar durante o MII nos CUT7-446 Cigotes foi bloqueada pola eliminación de Spot Spot (Fig. 3C). Polo tanto, a membrana da Forespora compón os defectos estruturais do eixe bipolar causado por unha perda ou fracaso de IPMT no deslizamento dos microtúbulos antiparais. Tanto as células tratadas de SpotA5 tratadas con células MBC (Fig. 3b) como SPO15 7 Cut7-446 Cells (Fig. 3C) Non se puido separar SPBs, segregar cromosomas e dividir o núcleo, aínda que esas células tiñan microtúbulos remanescados ao redor do SPB. Estas observacións mostran que estes eventos meióticos independentes de IPMT só son controlados pola membrana de esporas, pero non polo que restante KTMT.
o anel de punta e o complexo septin.
O crecemento O bordo da membrana de Strand está rodeado pola estrutura do bordo de ataque, que contén proteínas como Meu14 (REFS 28, 29) e é apoiado polo complexo de setembro 30 (SPN2, SPN5, SPN6 e SPN7). Tanto a estrutura de punta como o complexo de setembro son necesarios para navegar polo crecemento da membrana das esporas na dirección correcta 30. Nós bloquear a función de ambas as estruturas, utilizando dobres mutante MEU14 ô SPN6 Dis para desorientar ao crecemento da membrana de esporas. As células tratadas MEU14 δ SPN6 tratadas con MBC poderían separar SPB durante Mii ata certo punto, probablemente porque a membrana da Forespora podería ser ensamblada inicialmente sen septinas e Meu14. Estas células, con todo, fracasaron a miúdo na segregación das irmás cromátidas por igual e na execución da división nuclear (fig. 3D, e).
significativamente, os aneis anteriores formaron un dos dous spb e fixeron e Mantivo contacto físico entre si cando os SPBs separáronse en ausencia de IPMT (Fig. 3F). O complexo de setembro mostrado por SPN6-Mcherry tamén apareceu simultaneamente coa aparición de aneis de bordo de ataque para aliñar a membrana de esporas (Fig. 3F). Estes resultados xuntos proporcionan probas xenéticas e visuais de que a membrana forespora está correctamente orientada polo anel do bordo de ataque xera unha tensión interpolada, que de feito conduce a unha separación constante de SPBs, a segregación dos cromosomas e constricción nuclear. O anel do bordo de ataque que contén MEU14 está respaldado con F-Actin 31.Cando a polimerización da actina foi inhibida con latrunculina a presenza da MBC, o anel do bordo de ataque non contratou e fracasou na segregación dos cromosomas e da división nuclear, aínda que se produciu unha separación de SPB (Fig. S5 complementaria). .. Este fenotipo é similar ao de Meu14 δ SPN6, validando a proporción funcional do anel de bordo de ataque e actina.
Contribución da membrana forespora ao Mii fisiolóxico.
Todos os resultados anteriores suxiren que a membrana das esporas funciona como un dispositivo estrutural que axuda ao eixe. Para probar se a mecánica-mediada pola membrana das esporas tamén contribúe ao Mii fisiolóxico, no que os microtúbulos non están perturbados, usamos o spot mutante δ, que non forma a membrana da esporas. Aínda que Spot5 non é esencial para a progresión do MII 27, centrámosnos / centrámonos particularmente na fidelidade da separación de SPB seguindo un compoñente do complexo de poros nucleares, Cut11-3MRFP. Esta proteína está situada nos SPBs cando se incrusta no sobre nuclear ao comezo da fase m 32 (Fig. 4A) e xa non están asociados a eles ao comezo da anafase. Para cada núcleo, rexistramos o tempo de separación de SPB indicado pola división de aproximación Cut11-3MRFP única. Sorprendentemente, o spo15 durante as células durante Mii ocasionalmente mostrou a desaparición dun único punto de Cut11 sen separación, o que suxire que a separación de SPB non ocorreu en Mii (Fig. 4A e Táboa 1). Non se observou ningunha falla na separación de SPB durante a mitosis e as células MI en Spo15 δ (Fig. 4A e Táboa 1). Polo tanto, a membrana das esporas, polo menos en parte, contribúe á separación eficiente de SPB durante o MII fisiolóxico.
(a) O comportamento de CUT11-3MRFP foi filmado en tipo salvaxe e spo15 nas células ao comezo da mitosis e MII (n ≥ 26 ). En células de tipo salvaxe (WT), Cut11-3MRFP estaba constitutivamente situado no sobre nuclear e formou focos adicionais en SPBs na entrada mitótica / mii; Esta situación continuou a través da separación de SPB (visible como dous focos) e desapareceu ao comezo da anafase. Non obstante, nas células Spot δ no Mii Inlet, o Foci Cut11-3MRFP desapareceu ocasionalmente sen dividirse, indicando unha falla na separación de SPB ao comezo da anafase (26-29 min). (b) Lapso de tempo Kymographs que amosan a cinética do eixe durante Mii en células de tipo salvaxe, SPN6 δ e Meu14 δ SPN6 ((n ≥8). Un dos dous puntos Cut12-CFP (SPB) en cada punto de tempo aliñado na parte inferior da imaxe para enxágüe un aumento na distancia inter-spb. A lonxitude das frechas corresponde a 5 min. Barras de escala, 2 μm (c) A cinética de SPB representaba graficamente en tipo salvaxe, SPN6 δ e MEU14 Δ SPN6 observadas células observadas en b observada. Cada liña representa a cinética para un único núcleo (N ≥8).
a imaxe a tamaño completo
táboa de tamaño completo
Para investigar máis a fondo se o crecemento da membrana de esporas contribúe á separación de SPB durante o MII fisiolóxico, seguimos a cinética da distancia inter-spb (marcada por Cut12-CFP). A distancia inter-spb aumentou con un xeito gradual durante o Mii en células salvaxes, como ocorreu durante a mitosis (Fig. 4b, c). En contraste, o crecemento desorientado da membrana das esporas no MEU14 δ SPN6 foi as células frecuentemente asociadas a unha fluctuación na distancia inter-spb (Fig. 4b, c). Unha fluctuación similar pero menos notable foi observada no single mutante SPN6 (Fig. 4B, C), que indica que Meu14 e SPN6 operan na guía da membrana das esporas nunha ruta paralela 30 (Fig. 5a para un esquema). O A taxa de separación de SPB no MEU14 δ SPN6 podería as células podería ser de forma transitoriamente máis rápida que a das células salvaxes (Fig. 4C), probablemente porque o crecemento desorientado da membrana foresporase forzou unha rápida separación de SPBs. Estes resultados mostran que a dinámica da membrana de esporas contribúen efectivamente á cinética da separación de SPB durante Mii baixo condicións fisiolóxicas. Ademais, Meu14 δ SPN6 mostrou que as células mostraron unha división anormal ata o 20% dos núcleos de Mii, suxerindo a importancia da adecuada organización de a membrana de esporas para unha constricción precisa do núcleo.
(a) Ilustración esquemática da función de sepinas e proteínas de punta (LEP) na montaxe da membrana das esporas.Os septos e os LEPs teñen un papel importante na orientación da membrana das esporas. No tipo salvaxe (WT), a bordo de crecemento da membrana silvicultura é delimitada por LEPS que inclúen MEU14 para orientar axeitadamente e constrage a membrana de Forespora. O meiotic Complexo Septine (SPN2, SPN5, SPN6 e SPN7) guía a dirección do crecemento do bordo. Os Septins e os LEPs controlan cooperativamente a xestión do crecemento da membrana Forespora. O fenotipo de esporulación pobre é máis prominente cando o SPN6 combinado combínase con Meu14; Polo tanto, o dobre mutante Meu14 δ SPN6 foi usado neste estudo como unha cepa que carece de septin e LEP. Nas células MEU14 δ SPN6, a membrana de esporas non pode encapsular adecuadamente o núcleo, levando á produción de esporas defectuosas. (b) Este estudo propón un novo papel para sepina e LEPs na segregación de cromosomas e división nuclear durante o MII. En ausencia de IPmts (WT + MBC), a membrana Forespora, que comeza a montar a partir de SPBs, divide os SPBs. A membrana de esporas é entón guiada por estruturas que conteñen septin e LEP rodean o núcleo. Cando a MBC engádese ás células MEU14 δ SPN6 ((Meu14 SPN6 δ + MBC), a montaxe da Membrana de Forespora está desorientada e non se produce a segregación dos cromosomas ou a división nuclear. Como o SPB que emaning dos microtúbulos está conectado á membrana das esporas , a súa montaxe descoordinada pode afectar a eficiencia e fidelidade da Unión de Microtúbulos KinetoChore. Ademais, as septinas e LEP restrinxen o núcleo libre de IPMT xerando unha forza que normalmente se usa para encapsular o núcleo despois da división nuclear mediada por IPMT en tipo salvaxe .
Discusión de tamaño completo
Discusión
Demostramos a función sen precedentes da membrana de esporas na separación de SPB, a segregación dos cromosomas e do División nuclear durante o IIM. Propoñemos que, na fase inicial de Mii, a membrana forestal en desenvolvemento xera unha forza de separación do SPB de SPBs coincidindo con HA. Está fóra da membrana nuclear e, a continuación, apoia o eixe bipolar para unha segregación eficiente dos cromosomas. En ausencia de IPMT, as estruturas de bordo de progreso desenvolvidas a partir dos dous SPB chocan, ea súa forza de repulsión xera unha tensión física entre SPBs (Fig. 5). O aparello de división mediado pola membrana de esporas, reforzado pola estrutura do bordo de ataque e septin, pode facilitar a segregación por igual aos cromosomas ea constricción do sobre nuclear, incluso en ausencia de IPMT. Curiosamente, Mad2-SAC foi obrigado a garantir o momento adecuado da segregación dos cromosomas en ausencia de IPMT, o que implica que a constricción nuclear mediada pola membrana de esporas podería ser regulada polo complexo promotor da anafase / ciclosoma. Baseado na capacidade da membrana espora para compensar a ausencia de IPMT durante a IAS, cremos que as funcións cruciais do IPMT son as seguintes: Anclora os polacos do eixe ao sobre nuclear para garantir a forza da segregación dos cromosomas e dividir o núcleo en anafase.
$ config non atopado
A división celular sen o homólogo da tubulina FTSZ prodúcese en cepas de bacterias subtilis de Bacillus que son defectuosas na organización da parede celular 33. Recientemente informouse de que unha división nuclear independente dos microtúbulos (fisión nuclear) ocorre na mitosis de S. Pombe cando a citocinesis (formación da parede celular na saída mitótica) é inhibida artificialmente, aínda que non está claro como é xera forza. Neste estudo, aclaramos a mecánica para xerar a forza necesaria para a división nuclear sen IPMT durante o MII: o contacto físico dos bordos da membrana esporas é o pivote. En contraste cos estudos anteriores á mitose, a resistencia mediada pola membrana de esporas aparentemente contribúe ao mii fisiolóxico.
Especulamos que a referida maquinaria mediada por máquinas pode ser desenvolvido como un sistema de copia de seguridade para a segregación de Cromosomas durante o Mii, no que a estrutura do eixo pode non ser tan robusta como é durante a mitosis ou a IM. O eixe meótico está construído primeiro durante o IM e despois desmantelamento, seguido da reconstrución durante o Mii. En particular, Mii é unha “meiosis prácticamente aberta” na que as proteínas nucleares están dispersas do núcleo durante afafase 34, 35. Estas situacións poden implicar que a organización do eixo pode ser menos eficiente no ima que na mitosis.Doutra banda, Mii debe estar acoplado coa encapsulación dos núcleos dos irmáns pola membrana das esporas. Polo tanto, a membrana forespora pode ter necesaria a capacidade de xerar unha forza que axuda as funcións do eixe. A estrutura da membrana que implica a vangarda e as proteínas de choque adquiriron unha función dobre: a encapsulación do núcleo e a asistencia da segregación dos cromosomas. É interesante observar as semellanzas e diferenzas entre esta estrutura ea matriz de cadea, que se supón que debe manter a estrutura do eixe en eucariotas superiores, como esqueleto feito de materiais que non son microtúbulos 36. Unha organización membranosa que inclúe a folla B demostrouse recentemente que funciona como unha matriz de eixe que rodea todo o eixe de prometafase para manter a súa estrutura 37, 38, 39. Non obstante, ademais de ser un andamio estrutural, a membrana forespora pode xerar unha forza para a separación de SPB e división nuclear. Os eucariotas superiores poden ter desenvolvido unha maquinaria dependente de microtúbulos como o dispositivo de xerador de forza vantaxoso e a matriz de eixe membranal pode ter diferenciado como unha estrutura de apoio.
cepas de léveda e procedementos xenéticos.
As cepas utilizadas neste estudo están listadas na táboa complementaria S1. Os métodos estándar baseados na PCR para a orientación do xene 4, 40 foron usados para construír xeradores de xenes e cepas marcadas con proteínas fluorescentes con marcadores de selección Gene Cassettes, excepto GFP-PSY1 Strain 26, que foi construído pola integración dun plásmido que contén GFP-PSY1 Fusion Construction (un agasallo de T. Nakamura). A. Yamamoto 17 proporcionou a cepa CEN2 – GFP. Resumidamente, as secuencias repetitivas de LACHCO foron inseridas preto da rexión centromera do cromosoma II (CEN2), que foi recoñecida por unha proteína de Fusion Lace-GFP de Nuclear-GFP. Para a inducción da meiosis, observáronse as células homotélicas H 90 no medio de agar de esporulación para todos os experimentos, agás a proba de viabilidade de esporas que se mostra na figura 2f, g (ver a continuación).
Sincronización da meiosis e Proba de viabilidade das esporas.
Para a proba de viabilidade de esporas (Fig. 2F, g), usamos un sistema para inducir a meiosis sincronizada usando o diploide (H – H -) PAT1-114 + MAT-PC Separe 41, determinando así cando a poboación binucleada estaba no seu pico (e, polo tanto, ao engadir MBC). Para controlar a progresión meiótica co número de núcleos, as células foron manchadas con 4 ‘, 6-diamino-2-fenilindol despois de arranxar nun 50% de metanol. A viabilidade das esporas foi examinada pola análise de tetrade. As esporas xermináronse no medio rico en extracto de levadura. A viabilidade é a media de tres experimentos independentes.
Microscopía
Para obter imaxes de células mitóticas de células en directo, células de crecemento logarítmico cultivadas en medio definido sintético rico en tiamina a 30 ° C durante ≥ 13 h. Para obter imaxes de células de células vivas en meiosis, os cigotos utilizáronse situados no medio de agar de esporulación a 25 ° C para ≥8 h. As células vivas foron observadas no medio mínimo de Edimburgo con ou sen unha fonte de nitróxeno para analizar o ciclo mitótico ou a meiosis, respectivamente. As imaxes das células vivas foron realizadas como se describiu 4 nun sistema de DeltaVision-Softworx (precisión aplicada) usando un microscopio (IX71, Olympus) equipado con fluorescein isotiocianate, Mcherry e filtros CFP (tecnoloxía de Chroma), APO N × 60 (NA, 1.42) ) Ou un aceite de aceite de aceite de aceite de aceite × 100 (NA, 1.40) OIL (Olympus), unha cámara de HQ2 CoolSnap (fotométrica) e un controlador de temperatura (control de precisión) a 25 ° C, excepto figos 1G e 3C e figuras complementarias S2 e S3E , F (32 ° C foron utilizados para o mutante sensible á temperatura Cut7-446 e NUF2-1). A sección Z foi realizada en intervalos de 0,4 ou 0, 5 μM e as imaxes foron tomadas cada 1 a 5 min. As imaxes foron deconadas e creouse unha proxección Z-pila coa suma ou o máximo do método. O cambio de temperatura dos mutantes sensibles á temperatura realizouse polo menos 1 h antes da observación.
Tratamento de drogas
En imaxes de células vivas, imaxes por primeira vez foron tomadas sen MBC. Entón MBC (Sigma-Aldrich) foi engadido a unha concentración final de 50 μg ML -1 en todos os experimentos. Latrunculina A (Invitróxeno) foi engadido a unha concentración final de 50 μm polo menos 1 h antes de obter imaxes de células vivas.
Estatísticas
Unha proba de tion t usábase colas implicadas para análises estatísticas .