Lipas e As esterases son biocatalizadores versátiles eo tipo máis utilizado de enzimas con fins biotecnolóxicos. O Ophiostoma Piceae produce unha esterase esterol (OPE) con alta afinidade sobre triglicéridos e ésteres esteriles que son capaces de hidrolizar mesturas de forma eficiente destes compostos de extractores de madeira. Debido a estas propiedades, propúxose o uso desta enzima para diminuír o problema de deposición de tonalidade en madeira dura e pulpina de madura. A secuencia de proteínas maduras da OPE foi expresada con éxito en Mut + e Muts Pichia Pastoris Stepes, que difieren na súa capacidade de metabolizar o metanol como inductor de expresión, obtendo máis altos niveis de actividade que os obtidos nas culturas de O.. Piceae Erlenmeyer. Ademais, a produción de enzima recombinante (OPE *) foi escalada a Biorreactor que operaba en procesos por lotes e alimentado usando ambas cepas. En todas as condicións ensaio os niveis de actividade foron máis altos que os obtidos no frasco Erlenmeyer, alcanzando a máxima actividade (30 u / ml) con estirpe de Muts que operan nunha estratexia de co-alimentación de Sorbitol durante o cultivo de Fed-lote.
O cinético A caracterización da proteína recombinante mostrou unha enzima mellorada cunha maior eficiencia catalítica aparente que a enzima nativa (~ 8 veces) para todos os substratos emerxentes (P-nitrophenol, glicerol e ésteres de colesterol). Nin o maior nivel de n-glicosilación nin a presenza de residuos de metionina oxidados na rexión vinculante do substrato de OPE * parecen ser responsables desta mellora. Os estudos de dicroísmo circular mostraron cambios nos seus espectros, pero a análise de datos (método K2D de dichroweb) resultou nun contido idéntico de -helix (0.46) e -folla (0.23) para ambas as proteínas, polo que non se revelaron cambios na súa estrutura secundaria. A diferenza principal atopouse na secuencia N-terminal de OPE * que contiña 6-8 residuos máis que ope. Estes foron obtidos a partir do vector utilizado para a expresión da proteína xunto cun procesamento ineficiente do factor de apareamento -pre-pro-péptido desde Saccharomyces cerevisiae utilizada para a secreción. Isto afectan o estado de agregación detectado en OPE * (inferior ao informado no OPE) mellorando a súa eficiencia catalítica. Novas solicitudes biotecnolóxicas para esta enzima foron estudadas desde: i) É capaz de desacreditar o acetato de polivinilo (PVAC), un dos compostos identificados nos adhesivos formados durante a produción de papel reciclada, o que foi confirmado usando a espectroscopia FTIR, a análise de espectrometría de masas e titrimetría. Os resultados alcanzados baixo as condicións de ensaiadas foron comparables aos que se comercializaron específicamente para este obxectivo optizyme® 530. II) sintetizan os ésteres en medios orgánicos e utilizouse na síntese de ésteres fitoterol, como produtos nutracéuticos. Neste caso, estudáronse a influencia do substrato e a concentración de enzimas e do efecto de diferentes disolventes orgánicos con e sen auga nas reaccións. Os resultados mostraron que as enzimas de O. Piceae parecen ter unha actividade sintética similar, aínda mellor baixo algunhas condicións, á enzima comercial de C. Rugosa usada; Obtendo unha produción global de ésteres de STYLL de 60-80% dentro de 24 horas dependendo do exceso molar de substrato, feito que foi patentado. En relación coa súa potencial aplicación industrial, a enzima nativa foi inmobilizada con éxito a través de grupos epoxi activados no novo transportista de Dilbeads ™. A biocatalización inmobilizada mostrou mellores estabilidades significativas a valores de pH e temperaturas altas que a enzima soluble e foi capaz de hidrolizar a folicia de colectividade ao longo de varios días cando estaba embalado como un biorreactor. Finalmente, fixéronse diferentes experimentos de cristalización con enzima nativa. Con todo, o seu comportamento alta agregación non permitiu a obtención de cristais de boa calidade para difracción de raios X. Of Las lipasas y esterasas fillo biocatalizadores versaTiles y el TIPO más utilizado de enzimas para multas biotecnolóxicos. El Hongo OphiStoma Piceae Produce un Esterol Esterasa (OPE) con Alta Afinidad Sobre Triglicéridos y ésteres de Esterol Siendo Capaz de Hidrolizar Eficazmese Mezclas Naturales de Estos Compuestos A Partir de Extractos de Madera. Debido a Estas propiedades, se ha Propuesto o uso de esta enzima para disminuir o problema de la deposición de pitch en la fabricación de pasta de madera procedente de coníferas y frondosas. La Secuencia da Proteína Madura de la Ope se ha Expresado con éxito en CEPAS MUT + Y Muts de Pichia Pastoris, Que difiren en su Capacidad de metabolizar Metanol Como Inductor de la Expresión, Dando Como Resultado Niveles más Altos de Actividad Que os obtenidos en Cultivos en Erlenmeyer de O. Piceae.Ademais, a produción da enzima recombinante (OPE *) foi escalada a Biorreactor que operaba en discontinuas discontinuas usando ambas cepas. En todas as condicións probadas, os niveis de actividade foron maiores que os previamente obtidos no frasco Erlenmeyer, alcanzando a máxima actividade (30 U / ml) coa tensión de Muts que operan nunha estratexia con sorbitol como co-substrato durante a cultura discontinua alimentada. A caracterización cinética da proteína recombinante mostrou unha enzima mellorada cunha maior eficiencia catalítica aparente que a enzima nativa (~ 8 veces) para todos os substratos probados (ésteres de p-nitrofenol, glicerol e colesterol). Nin o máis alto nivel de n-glicosilación nin a presenza de residuos de metionina oxidados na rexión de vinculación ao OPE * Substrato parecen ser responsables desta mellora. Os estudos de dicroísmo circular mostraban cambios nos seus espectros, pero a análise de datos (o método K2D de Dichroweb) resultou nun contido idéntico en hélices α (0.46) e β (0,23) para as dúas proteínas que indican a ausencia de cambios na súa estrutura secundaria. Non obstante, a principal diferenza neles atopouse na secuencia N-terminal do OPE * que contén 6-8 residuos en lugar de OPE. Estes residuos procederon do vector utilizado para a expresión da proteína eo procesamento ineficiente do factor α de Saccharomyces cerevisiae usado para a secreción. Isto afecta ao estado de agregación detectado en OPE * (menor que o que se describe no OPE) que mellora a súa eficiencia catalítica.
Dado o seu potencial, estudáronse novas aplicacións biotecnolóxicas para esta enzima: i) Desaotate do acetato de polivinilo (PVAC), Un dos compostos identificados nos adhesivos formados durante a produción de papel reciclado. A capacidade da enzima para levar a cabo tal reacción foi confirmada pola espectroscopia Ftir, análise de espectrometría de masas e titulares; Así, os resultados obtidos, baixo as condicións de proba, mostran unha actividade similar á da enzima optizyme® 530 comercializada para este fin. II) Síntese de ésteres en medios orgánicos, é específicamente os ésteres phytoresterol, como produtos nutracêuticos. Neste caso, estudouse a influencia da concentración de enzimas e substrato e do efecto de diferentes disolventes orgánicos xunto coa presenza e a ausencia de auga nas reaccións. Os resultados obtidos permitiron patentar o emprego da enzima a tal efecto por ser similar aos alcanzados coa enzima comercial de C. Rugosa empregada en comparación e aínda mellor nalgunhas circunstancias. Unha produción total de esteredes esteroles do 60% en 24 horas foi observada cando unha pequena substancia foi utilizada ao aumentar o 80% con excesos máis antigos. Pensando no seu posible uso industrial, a enzima nativa foi inmobilizada con éxito a través de grupos epoxi activados nun novo apoio chamado Dilbeads ™. O biocatalyst inmobilizado demostrou ser significativamente máis estable en valores e temperatura de pH altos que a enzima soluble e mantivo a capacidade de hidrolizar o oleado de colesteril durante varios días cando foi empaquetado como un biorreactor. Finalmente, leváronse a cabo diferentes experimentos de cristalización coa enzima nativa. Non obstante, a tendencia elevada que mostra a forma de formar agregados impediu a obtención de cristais de boa calidade para estudos de difracción de raios X.