Análise da variación intraspecífica de Conidiobolus Coronatus usando secuencias RAPD e STS | Enfermidades infecciosas e microbioloxía clínica

Introdución

Conidiobolus Coronatus (C. Coronatus) (Entomophththhthorals) é un fungo de insectos cosmopolita e patóxeno de diferentes ordes1; Atopouse en decisión de madeira, lixo, solo2 e tamén como patóxeno de mamíferos, incluído o home, que produce rinoentomoftoomicosis, que afecta a superficie do tracto respiratorio, pode danar a mucosa nasal e paranasal e ata estenderse á pel de O nariz, o beizo superior e a área frontal-glablar3.

O informe de danos humanos é raro e está restrinxido a rexións con climas tropicais e alta humidade4. A extensa distribución de C. Coronatus e os poucos casos de reorted rinoetomoftosis suxiren que non todos os illados son patóxenos para animais humanos e superiores3,5.

Na planta de produción de cogomelos (Agaricus Bisporus) Fungi Rioxal (Perote, Veracruz, México) Detectouse un brote epizoótroico de C. Coronatus sobre moscas da especie Lycoriella inxenuo (L. inxenuo), considerado a pragas principal do champignon6. O cogumelo é producido en buques pechados que presentan condicións similares a un clima tropical húmido7 e no que hai moscas infectadas por C. Coronatus. Os traballadores están expostos a ambos os factores por períodos prolongados, o que implica que están en contacto coas esporas do fungo e, a pesar diso, non hai encoros de rhinoetomhoromicosis orixinados nas plantas de produción de cogomelos.

A relación entre C. Coronatus ea súa ampla gama de anfitrións son dignos de estudo e pódese considerar unha indicación da variación intraspecífica. Baseado no anterior, o obxectivo deste traballo foi investigar se existe ou non a variación xenética entre illados de C. Coronatus de lesións humanas e outras fontes (solo, insecto, composto).

para determinar a A variabilidade xenética entre illados de diferentes hosts é necesaria para usar técnicas moleculares8. O espaciador interno transcrito (STIS) é o locus máis popular da investigación mística baseada en secuencias; É o máis exitoso para a identificación dunha gran cantidade de fungos, polo que foi designado como un ADN do código de barras universal para fungos; Ademais, a súa capacidade comprobada para o estudo da variación inter-intraspecífica convértea nunha ferramenta moi poderosa9-12. Do mesmo xeito, a técnica de polimorfismo derivada da amplificación aleatoria do ADN (RAPD) adquiriu varios usos no estudo da diversidade xenética; En Fungi foi usado con éxito principalmente en estudos intiresespecificos13. Estas dúas técnicas foron implementadas en 11 illados de C. Coronatus e os seus resultados foron analizados e discutidos en función da distancia xenética segundo a fonte de que estaban illados (solo, insecto e humano).

materiais e métodosiliments

11 illados de C. Coronatus foron utilizados; 8 deles foron obtidos a partir de coleccións públicas e 3 foron illados por si mesmos (Lyco 1, 4 e 5). Todos foron procesados para analizalos con técnicas de RAPD e amplificación da rexión de Radn-ITS2 da súa 1-5.8S (intróns) entre os xenes de Radn 28s e os 18s). A lista de todos os illados ea fonte que se tomaron móstrase na táboa 1.

Os Aislamientos C . coronatus Lyco 1, 4 y 5 é obtuvieron en la planta de producción de champiñones Hongos Rioxal (Segun metodo de Papierok Hajek14 y), é DETECTO Donde el brote epizoótico de un sobre Hongo entomopatógeno moscas da especie L. ingenua, que fue por El Especialista identificado Arthur A. Callaghan Como C. coronatus. Todos tan Aislamientos presentaron las características morfolóxicas propias da especie (Ejemplo POR, conídios vellosos producidos solo por This especie). Realizaron é tan postulados de Koch y con ellos Que se comprobó C. coronatus fue El axente causal da enfermedad sobre la L. ingenua.

Os Aislamientos de 11 C. coronatus é o mantuvieron temperatura ambiente y en un preservaron agua estéril destilada. Para su desarrollo, é inocularon En medio Dextrosa ágar Sabouraud a 25 º C.

EXTRACCION de ADN

obtuvo micélio liofilizado de los 11 Aislamientos de C. coronatus Siguiendo por El método descrito Guzman-Franco et al.15 . El ADN é extrajo Mediante El Método CTAB (bromuro de hexacetiltrimetilamonio) modificado de Ahrens y Seemüller16. El macerado e poño en un tubo Eppendorf can 400 de solución de lisis (cloruro de sodio 0,4m, 10 mm Tris-HCl, EDTA 2 mm, 1% de PVP) é mezcló y con un axitador de vórtices para homogenizar. Enseguida é agregaron 50 ul de SDS a 20%, 40 ul de proteinasa K (10 mg / ml) y é íncubo a 65 ° C durante una Hora. Después é agregaron solución 600μl dun 3% de CTAB (Sigma Chemicals, EE. UU.) Y é íncubo NuevaMente Durante 45 minutos a 65 º C. Posteriormente é engadir un Volumen de cloroformo isoamílico y alcohol (24: 1), y é mezcló centrífugo 10 min a 14.000rpm, Donde está formaron 2 fases; la fase acuosa é poño en un tubo Eppendorf con un Volumen y de isopropanol é íncubo a -20 ° C por 60min; Después é 10min centrífugo para 14.000rpm. ADN El fue En resuspendido 50 de auga destilada estéril; concentración y la Calidad del ADN é Estimo con un NanoDrop ND-1000 v3.7 (Thermo Scientific, EE. UU.). Finalmente, el ADN é visualizo en un xel de agarosa ai de 1% de X 1 En tapón TBE (Tris0,089M, ácido bórico 0,089M, EDTA 0,002M) bromuro can teñido de etidio (0,5μg rent-1 por 10min) y con un é fotografió fotodocumentador-Gel Doc MOD. 2000 (Bio-Rad®, EE. UU.).

amplificación RAPD

A reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) é realizo en un termociclador meu Thermal Cycler ™ termociclador Bio-Rad modelo 580BR 09275. É usaron tubos de 0,5 ml Eppendorf; Volumen El finais de la mezcla fue 25? L / y PCR contenía 4 ul de ADN (80 ng / Jil), de tapón 10x, cloruro de magnesio 3 mm, 2,5mm Each de dNTP (Gene elección), 1,5 U de Taq polimerasa (Biogênica) y Cada 2 ul de Iniciador (10 pmole).Os iniciadores aleatorios da serie Operon Technology® e a serie B de Invitróxeno (Táboa 2) foron utilizados. A partir de 19 iniciadores comprobados, só os que deron resultados reproducibles (3 amplificacións) utilizáronse na análise RAPD, polo que ao final 13.

Resulturals rapd

Os iniciadores seleccionados amplificaron 48 bandas cunha variación polimórfica de 22 a 100%; Obtivéronse 34 bandas polimórficas, obtendo un 70,83% do polimorfismo; Obtivéronse 2 a 9 bandas por iniciador (Táboa 2). A Figura 1 mostra os patróns da bandexa obtidos pola amplificación co iniciador A18 e véxase a diferenza xenética entre o illamento evaluado a partir de diferentes fontes.

O Dendrogram construído a partir da análise dos patróns de Bande obtidos cos 13 iniciadores revela a formación de 4 grupos principais (A, B, C e D) cun 40% de semellanza. Os resultados indican un alto nivel de diversidade xenética. A estabilidade das agrupacións obtidas foi evaluada cunha análise BS con 1.000 réplicas (Fig. 1). Grupo A inclúe 8 illados divididos en 2 subgrupos, I e II; Subgroup que contén os illados obtidos de L. inxenuo Lyco 1, Lyco 4 e Lyco 5 (Lyco 1 e Lyco 4 teñen un 100% de semellanza); Subgrupo II está formado por Staff 4: 004 illados de chan, do persoal 15: 008, persoal 1: 037, de persoal 10: 027 e 04: 427 Staffs (Staff 4: 004, Persoal 15: 008 ten 100% de similaridade). Grupo B inclúe só o illamento de Arsaf 1884 tomado de Mocis Latipe, cun 80% de semellanza. O grupo C inclúe só o illamento do NARSF 512 de Lugens Nilaparvata, cun 50% de semellanza. No grupo D só é o illamento ATCC 32865 das lesións humanas, cun 40% de semellanza, e presenta a maior distancia xenética do resto dos illados (Figura 2).

Figura 2.

Dendrogram construída a partir da análise de fragmentos de ADN de 11 illados de C. Coronatus amplificado con 13 iniciadores Rapd. Os números en cada punto dos nodos representan os valores de bootstrap.

Análise da súa rexión

Os seus iniciadores usados18 amplificaron un fragmento de 666 BP (os espazos foron considerados como sitios informativos) correspondentes ao Rexións ITS1-5.8S Radn-its2 nos 11 illamento avaliado. A lonxitude de cada unha das rexións foi homoxénea en todos os illados: o seu 323 bb; Radn 5.8s, 155 BP; ITS2, 288 BP. O aliñamento e análise das secuencias co MEGA5 Programa do OS1-5.8S RADN-its2 de C. Coronatus Island (Táboa 1) mostra 69 sitios variables entre os 14 illados. Destes, 40 atópanse no seu número, o que o fai na rexión máis polimórfica, tanto de todos os grupos como os illados de cada grupo. A rexión 5.8S é a máis conservada, xa que só ten 3 sitios variables entre os 14 illados. No interior de cada grupo tamén houbo diferenzas no número de sitios variables totais, o grupo sen insectos co número máis alto (29) eo grupo de humanos máis homoxéneo (5) (Táboa 3).

A variabilidade da súa rexión proporcionou información sobre os patróns de diversificación C. Coronatus. Unha árbore filoxenética foi construída cos métodos estatísticos de máxima parsimonia, unirse ao veciño (NJ) e unha evolución mínima e utilizando C. Thromboides como grupo externo. O mesmo resultado obtívose cos 3 enfoques tanto na topoloxía como no apoio das ramas (valor BS); A súa rexión claramente diferenciada C. Coronatus de C. Thrombooides (especie estreitamente relacionada). A Figura 3 amosa o resultado da árbore do análise NJ.

Figura 3.

Árbore filogénica baseada na secuencia do seu Rexión de C. Coronatus, usando o método NJ. C. Thromboides foi usado como grupo externo. Os números próximos aos nodos representan valores de bootstrap expresados como porcentaxe de 2.000 repeticións.

(0,16MB).

V id = “

As distancias xenéticas entre as illas están representadas pola lonxitude da rama dos grupos que están formados. Formáronse grupos A, B e C. Grupo A inclúe 10 illados divididos en subgrupos I e II; Subgrupo I contén Lyco 1, Lyco 4 e Lyco 5 illados (obtidos L. inxenuo), FSU 784 (obtido a partir de compost de cogomelos) e P1 (obtido de insecto). No subgrupo II son o persoal 4: 004, persoal 15: 008, persoal 10: 027, persoal 1: 037 e persoal 04: 427 (obtido do solo); O valor BS do nodo que une subgrupos I e II é baixo (44%), pero o valor BS do nodo que une os illados do subgrupo I é do 79% eo subgrupo II é do 88%. Grupo B inclúe os asof 512 e 1884 ARSF illados (illados de homoptere e coleópteros insectos, respectivamente) e, finalmente, o grupo C son os ATCC 32865 e VPCI-126P illados (tomadas dende lesións humanas). Este grupo presenta a maior distancia xenética con respecto a outros illados eo seu valor BS é do 98%.

Discusión

Os resultados deste traballo mostran a variación xenética evidente entre o illamento de C. Coronatus avaliado, agrupado segundo a súa orixe en: 1) Insect, 2) Compost, 3) SOIL E 4) HUMANO.

Aínda que os principios da técnica con secuencias STI difiren das da técnica RAPD19,20, complétase con O que Soll21 indica, que afirma que para os resultados obtidos cun método a considerar válido, deben ser confirmados con polo menos unha técnica diferente. Os nosos resultados son consistentes con ambas técnicas baseadas en: 1) Hai variación intraspecífica en illados avaliados; 2) Os illados humanos presentan a maior diverxencia xenética con respecto ao resto dos illados; 3) A maior distancia xenética entre os grupos de illamento é dada entre os humanos e os lycos (illados de L. inxenuo).

Aínda que os resultados como os de Ribes et al.5, Valle et al al .3 e Wieloch et al.4 Suxerir que non todos os illados son patóxenos para o humano e que, á súa vez, esta é unha indicación da variación intraspecífica do fungo, non hai estudos que o apoian. Este traballo é o primeiro en avaliar e demostrar que hai variación intraspecífica a nivel molecular de C. coronatus relacionado coa fonte de que foron tomadas.

Estudos similares avaliaron a variación noutros entomoftorales con RAPD e Amplificación do seu22,23. Do mesmo xeito que os nosos resultados mostran unha distancia xenética clara entre illados de diferentes fontes, Fargues et al.9 e Morton et al.24 informou a relación entre a variación xenética e o servidor.

Hai estudos do complexo de fusarium, Iso aínda que non sexa un entomofrim, comparte con C. Coronatus a característica de infectar unha ampla gama de anfitrións, incluído o humano. Zhang et al.25 buscou variación intraspecífica sen éxito en 471 illados tomados de humanos, solo, animais, aire de hospitais e plantas. O motivo diso é que o fusarium é un fungos multi-hospedado26, o que implica que o mesmo illamento pode infectar unha gran cantidade de organismos de varios phyla.

Cada microorganismo ten un conxunto de funcións que funcionan como factores de virulencia nos seus anfitrións; Non obstante, descoñécese en que medida condiciona os mecanismos de infección en diferentes grupos anfitrións. A causa disto é a ausencia de modelos que permiten analizar a virulencia entre grupos infectados27. Tendo en conta as distintas fontes nas que se atopou C. Coronatus e os nosos resultados que mostran claramente a variación intraspecífica entre illar, consideramos que C. Coronatus podería servir como modelo para avaliar os mecanismos de virulencia que o fan específico para cada un de cada grupo de organismos aos que ataca.

Aínda que os nosos resultados mostren unha clara diferenza a un nivel molecular entre illados de C. Coronatus de fontes humanas e outras, neste traballo non se presentan de ningún resultado morfolóxico ou fisiolóxico os illados para comprobar se as diferenzas xenéticas son traducidas a diferenzas fenotípicas; Non obstante, hai as nosas propias observacións (só con algúns illados) e outros autores que nos axudan a inferir, ademais de aumentar a posibilidade de que exista algún illamento que non sexa patóxeno humano. Hall et al.28 Considere que a capacidade de desenvolver a 37 ° C é un criterio para avaliar o potencial dos fungos como patóxenos humanos; Mier et al.29 traballou nunha cepa de humanos e desenvolvida a 37 ° C, mentres que Papierok et al.2 estudou 10 cepas, das cales só unha de orixe humana e unha hanseniella illada unguiculula creceu a 37 ° C; O resto veu de insectos de varias ordes. No noso caso, observouse o efecto da temperatura sobre Lyco aislados 1, 4 e 5, atopando que non había ningún desenvolvemento a 37 ° C (datos non presentados). Ademais, observamos que o illamento ATCC 32865 (tomado do ser humano) levou case 4 días máis para cubrir un prato Petri de diámetro de 85 mm con respecto aos obtidos a partir de insectos (datos que non se amosan) e tiñan un algodón, rugosidade e tonalidades. Características que non foron presentadas no outro illamento avaliado. Estas características tamén sustentan as diferenzas entre o illamento dos seres humanos eo resto, que poderían atribuírse á fonte da que se obtivo e suxire que isto pode ser un factor que xera distancias xenéticas. Os resultados de López-Martínez et al.30 tamén suxiren variación intraspecífica e que non todos os illados son patóxenos de mamíferos; Realizaron probas en ratones, hamsters e cobaias cunha cepa de C. Coronatus tomada de Aenolamia de Posgra e aínda que había unha invasión inicial en todos os animais, desapareceu 15 días despois da inoculación, o que indica que o fungo non puido establecer cada un infecta. O anterior destaca a ausencia de patoxenicidade desta tensión particular en mamíferos.

Deste xeito, os nosos resultados sobre a distancia xenética con STS e RAPD entre o illamento ATCC 32865 (humano) e as tomadas de insectos, xunto co Características fisiolóxicas e morfolóxicas dos illados de Lycos descritos anteriormente, suxiren que estes non son patóxenos para o humano; Esta podería ser a razón pola que, a pesar de que os traballadores están en contacto co fungo, non hai informes de lesións humanas por C. Coronatus en plantas productoras de cogomelos.

Os nosos resultados non son concluíntes para suxerir O uso de C.Coronatus no control biolóxico dos insectos; É necesaria a investigación para determinar, como ocorreu coa tensión 251 do Fungus Purpleocillium lilacinus que se usa actualmente para o control biolóxico dos nematodos, aínda que o fungo se informa como patóxeno de humanos e animais. Esta tensión é a única que non produce pahecilotoxina, que é o axente causante de danos nos humanos31. Cómpre mencionar que para C. Coronatus, a Coronatina Metabolita-1 xa estaba identificada nas larvas de Galleria Mellonella e, aínda que é necesario determinar o seu modo de acción, sería interesante investigar se este metabolito é capaz de causar alteracións En humans4.

O tamaño da mostra eo número de hosts / substratos deste traballo foron limitados, o que podería afectar a análise da diversidade xenética e do número de ramas que se formaron nas árbores filogenéticas. Recoméndase realizar probas con maior número de illados e incluír estudos de morfoloxía e fisioloxía. A pesar destas limitacións, os nosos resultados coas técnicas RAPD e STS proporcionan información sobre a diversidade intraspecífica de C. Coronatus relacionada co servidor / substrato.

Conflito de interese

Os autores declaran que non hai conflito de intereses.