lipases et Les esterases sont des biocatalyseurs polyvalents et le type d’enzymes le plus utilisé à des fins biotechnologiques. Ophiostoma Piceae produit un stérol estérase (OPE) à haute affinité sur les triglycérides et les esters de stérol, capable d’hydrolyser des mélanges naturels efficacement de ces composés à partir d’extractifs en bois. En raison de ces propriétés, l’utilisation de cette enzyme a été proposée pour diminuer le problème de dépôt de pitch dans la pulpe de bois franc et du bois de résineux. La séquence de protéines matures de l’OPE a été exprimée avec succès dans les souches Mut + et Pichia Pastoris, qui diffèrent par leur capacité à métaboliser le méthanol comme inducteur d’expression, ce qui entraîne des niveaux d’activité plus élevés que ceux obtenus dans des cultures O. Piceae Erlenmeyer. De plus, la production d’enzyme recombinante (OPE *) a été mise à l’échelle au bioréacteur fonctionnant dans des processus de lot et de lots nourris à l’aide des deux souches. Dans toutes les conditions testées, les niveaux d’activité étaient supérieurs à ceux obtenus dans le ballon ErlenMeyer, atteignant l’activité maximale (30 U / ml) avec une souche MUTS fonctionnant dans une stratégie de co-alimenteur de sorbitol lors de la culture des lots nourris.
Le cinétique La caractérisation de la protéine recombinante a montré une enzyme améliorée avec une efficacité catalytique apparente supérieure à celle de l’enzyme natale (~ 8 fois) pour tous les substrats dosés (p-nitrophénol, glycérol et esters de cholestérol). Ni le plus grand niveau de n-glycosylation ni la présence de résidus de méthionine oxydés dans la région de liaison de substrat de OPE * ne semblent être responsables de cette amélioration. Les études de dichroïsmes circulaires ont montré des changements dans leurs spectres, mais une analyse des données (méthode K2D à partir de Dichroweb) a entraîné une teneur identique à -hélice (0,46) et à la feuille (0,23) pour les deux protéines, donc aucun changement dans leur structure secondaire n’a été révélée. La principale différence a été trouvée dans la séquence N-terminale de l’OPE * qui contenait 6-8 résidus de plus que l’OPE. Celles-ci ont été dérivées du vecteur utilisé pour l’expression protéique couplée à un traitement inefficace du pré-proppide de facteur de mise en accouplement de Saccharomyces cerevisiae utilisée pour la sécrétion. Cela affecte l’état d’agrégation détecté dans la OPE * (inférieur à celui rapporté en OPE) améliorant son efficacité catalytique. Les nouvelles applications biotechnologiques de cette enzyme ont été étudiées depuis: i) il est capable de désacétyber acétate de polyvinyle (PVAC), l’un des composés identifiés dans les collants formés lors de la production de papier recyclé, ce qui a été confirmé à l’aide de la spectroscopie FTIR, de l’analyse de la spectrométrie de masse et de la titrimétrie. Les résultats obtenus dans les conditions testés étaient comparables à ceux obtenus avec l’obtention spécifiquement commercialisée pour cet objectif Optizyme® 530. II), il synthétise des esters dans les supports organiques et a été utilisé dans la synthèse des esters phytostérol, comme produits nutraceutiques. Dans ce cas, l’influence du substrat et de la concentration enzymatique et l’effet de différents solvants organiques avec et sans eau dans les réactions ont été étudiés. Les résultats ont montré que des enzymes de O. Piceae semblent avoir une activité synthétique similaire, encore mieux dans certaines conditions, à l’enzyme commerciale de C. rugosa utilisée; Obtenir une production globale d’esters STERYL de 60 à 80% dans les 24 heures en fonction de l’excès de molaire du substrat, de fait breveté. En ce qui concerne son application industrielle potentielle, l’enzyme natale a été immobilisée avec succès grâce à des groupes époxy activés dans le nouveau support Dilbeads ™. Le biocatalyseur immobilisé a montré de meilleures stabilités importantes à des valeurs élevées de pH et de températures que l’enzyme soluble et a pu hydrolyser la cholestimer oléate pendant plusieurs jours lorsqu’il était emballé comme bioréacteur. Enfin, différentes expériences de cristallisation ont été effectuées avec une enzyme natale. Cependant, son comportement d’agrégation élevé n’a pas permis d’obtenir des cristaux de bonne qualité pour la diffraction des rayons X.
Las Lipasas Y Esterasas Son Biocatalizadores Versátiles Y el Tipo Más Utilizado de Enzimas Para Fines Biotecnológicos. El Hongo Ophiostoma Piceae Produire un Estérol Esterasa (OPE) CON ALTA AFINIDAD SOBRE TRIGLICÉRIDOS YSSTES DE ESTEROL SIENDO CAPAZ DE HIDROLIZAR EFICAZMENTE MEZCLAS NATURELES DE L’ESTOS COMPUESTOS A PARTIR DE EXTRACTOS DE MADERA. Debido A Estas Propiedades, SE Ha Propuesto El Uso de Esta Enzima Para Déminaire El Problème de la Dépôt de Pile en La Fabricación de Pasta de Madera Procede de Coníferas y Frondosas. La Secuencia de la Proteína Madura de la Ope Se Ha Expresado con Éxito En Cépas Mut + Y Muts de Pichia Pastoris, Que Diffieren En su Capacidad de Métabolizar Metanol Como Inductor de la Exprésión, Dando Como Résultat des Nivelles Más Altos de Actividad Que Los Obtenidos en Cultivos en Erlenmeyer de O. Piceae.De plus, la production de l’enzyme recombinante (OPE *) a été mise à l’échelle au bioréacteur fonctionnant de manière discontinue à l’aide de deux souches. Dans toutes les conditions testées, les niveaux d’activité étaient supérieurs à ceux obtenus précédemment dans le ballon Erlenmeyer, atteignant l’activité maximale (30 U / ml) avec la souche MUTS fonctionnant dans une stratégie avec Sorbitol en tant que co-substrat lors de la culture discontinue. La caractérisation cinétique de la protéine recombinante a montré une enzyme améliorée par une efficacité catalytique apparente plus élevée que l’enzyme natale (~ 8 fois) pour tous les substrats testés (esters de p-nitrophénol, de glycérol et de cholestérol). Ni le niveau le plus élevé de n-glycosylation ni la présence de résidus de méthionine oxydés dans la région de liaison au substrat OPE * ne semblent être responsables de cette amélioration. Les études de dichroïsmes circulaires ont montré des changements dans leurs spectres, mais une analyse des données (méthode K2D de Dichroweb »s K2D) a entraîné une teneur identique dans des hélices α (0,46) et des feuilles β (0,23) pour les deux protéines indiquant l’absence d’évolution de sa structure secondaire. Cependant, la principale différence d’entre eux a été trouvée dans la séquence N-terminale de la OPE * contenant 6-8 résidus plutôt que sur la OPE. Ces résidus sont venus du vecteur utilisé pour l’expression de la protéine et le traitement inefficace du facteur α de Saccharomyces cerevisiae utilisée pour la sécrétion. Cela affecte l’état d’agrégation détecté dans OPE * (inférieur à celui décrit dans OPE) qui améliore son efficacité catalytique.
Compte tenu de son potentiel, de nouvelles applications biotechnologiques ont été étudiées pour cette enzyme: i) Désaotate d’acétate de polyvinyle (PVAC), L’un des composés identifiés dans les Stickies formés lors de la production de papier recyclé. La capacité de l’enzyme à effectuer une telle réaction a été confirmée par spectroscopie FTIR, analyse de la spectrométrie de masse et titrage; Ainsi, les résultats obtenus, dans les conditions de test, montrent une activité similaire à celle de l’enzyme Optizyme® 530 commercialisée à cette fin. ii) Synthèse d’esters dans les supports biologiques, en particulier les esters phytorestérololes, tels que les produits nutraceutiques. Dans ce cas, l’influence de la concentration de l’enzyme et du substrat et l’effet de différents solvants organiques ainsi que la présence et l’absence d’eau dans les réactions ont été étudiées. Les résultats obtenus ont permis de breveter l’emploi de l’enzyme à cette fin en étant similaires à ceux obtenus avec l’enzyme commerciale de C. Rugosa employé en comparaison et encore mieux dans certaines circonstances. Une production totale d’esters esters de 60% en 24 heures a été observée lorsqu’une petite substance a été utilisée en augmentant 80% avec des excès plus anciens. En pensant à son utilisation industrielle possible, l’enzyme indigène a été réussie immobilisée par des groupes époxy activés dans un nouveau support appelé Dilbeads ™. Le biocatalyseur immobilisé s’est avéré de manière significativement plus stable à des valeurs et de la température élevées que l’enzyme soluble et retenue la capacité d’hydrolyser l’oléate de cholestéril pendant plusieurs jours lorsqu’il était emballé comme bioréacteur. Enfin, différentes expériences de cristallisation ont été effectuées avec l’enzyme indigène. Cependant, la tendance élevée montrant pour former des agrégats empêchait l’obtention de cristaux de bonne qualité pour des études de diffraction à rayons X.