Aquest text de Carmen Sánchez de Rivas va aparèixer originalment al número 14 (2013) de la revista CIC Network i el reproduïm en la seva integritat pel seu interès.
amb la recent desaparició de François Jacob (19 d’abril 2013), s’ha anat l’últim dels tres investigadors que van rebre el Premi Nobel de Fisiologia i Medicina el 1965 (Jacob, Monod i Lwoff). Aquest premi coronava els treballs sobre La regulació de l’expressió genètica de la síntesi d’enzims i de virus bacterians, per a molts la consagració de l’operó.
Avui, quan ja han passat més de 50 anys des de la publicació de aquests treballs, és important destacar la conjunció de sabers i interessos involucrats tant en l’elucidació de la regulació de la lisogènia, com de la síntesi d’enzims metabòliques. Van ser els estudis realitzats sobre virus bacterians (bacteriòfags), de la lisogènia i inducció de profagos, de la transferència de gens per conjugació, de la inducció cigótica, portats a terme primer per André Lwoff, després per François Jacob i Elie Wollman, els que van conduir a Monod i Jacob a associar-se per elucidar aquest complex regulador que també permetria explicar com el bacteri Escherichia coli regula els gens involucrats en la utilització de la lactosa com a font de carboni.
Durant i després de la II Guerra Mundial, es va anar reunint un grup important d’investigadors sota la protecció i l’auspici d’a Lwoff, que es van allotjar en els altells de l’Institut Pasteur (li graner) d’l’edifici de Química Biològica. Monod primer i després Jacob, es van trobar aquí després d’haver participat molt activament en la Guerra. Jacques Monod va tenir una participació molt intensa en la resistència acompanyant el Partit Comunista, tot i que poques vegades va parlar d’això. No obstant això li va implicar importants dificultats per obtenir el visat en cada viatge que feia a EE UU. Jacob, amb a penes 20 anys i només iniciats els seus estudis de Medicina, es va unir a l’General De Gaulle a Londres, va ser enviat posteriorment a combatre a l’Àfrica de el Nord i va treballar com a cirurgià. Durant el desembarcament de Normandia va resultar greument ferit. En aquest sentit, Jacob ha estat un dels pocs combatents Compagnon de la Libération nomenats pel General De Gaulle.
en 1954-55, després de diversos anys de convivència a l’altell, J. Monod va ser nomenat cap de servei i es va mudar a la planta baixa on li van adjudicar un àrea central, que s’anomenaria Service de Biochimie cellulaire. Això va permetre augmentar les possibilitats de l’ ‘graner’ i compartir les biblioteques on es realitzaven els seminaris, i un menjador. El 1958, després d’acabar 3 anys d’estudis de tècnica en Bioquímica, vaig tenir l’oportunitat de començar a treballar amb Jacques Monod. En aquell temps Monod estava entrevistant a joves, possibles ajudants, per a completar el grup que necessitaven ell i els seus col·legues en el nou departament. Monod em va contractar en el seu equip i va començar per a mi aquesta gran aventura personal de la investigació científica. Monod em va presentar a A. Lwoff perquè intercedís en el meu nomenament com a tècnica de l’IP. La figura d’Lwoff infonia un gran respecte i fins i tot un punt de por a el conjunt de tècnics i investigadors; he de dir que el seu escriptori es trobava en un racó amagat de l’altell i la porta estava protegida per les seves secretàries. No obstant això, també és cert que sempre em va rebre amb el seu gran somriure i li divertia veure en els seminaris, ja que no era habitual veure joves tècniques en aquest entorn.
Ràpidament, Monod em va introduir en l’estudi de les corbes d’inducció de la ß-galactosidasa, assaigs enzimológicos i immunològics. En aquell moment, per estudiar la ß-Gal en una gran quantitat de ceps, primer es permeabilizaban els cultius amb detergent i toluè per després afegir el substrat (ONPG) i mesurar l’enzim pel color groc de l’orto-nitro-fenol alliberat. Això ens va portar a posar a punt un buffer que permetia la major activitat reproduïble, que anomenem PM2, i posteriorment va ser rebatejat com a ‘Buffer Z …’; i també vam introduir el bicarbonat de sodi per frenar la reacció.Mesura de permeasas, de transacetylasas a les mutants, amb diferents inductors gratuïts o no, eren els elements de treball quotidians. Vaig aprendre a organitzar protocols i experiments, a redactar i analitzar els resultats per després comentar-los amb el professor Monod.
A l’migdia o un cop finalitzaven els seminaris, investigadors, tècnics i visitants de tots dos grups ens solíem reunir per menjar al ‘menjador’, que era un ampli corredor vidriat a la banda de la biblioteca. Un dels ritus era el cafè que preparava Sarah Rapkine. La majoria dels científics que estaven ‘construint’ la Biologia Molecular realitzaven diferents estances al laboratori. Entre l’altell i el nostre servei, hi havia un ascensor estret sense massa seguretat -més semblant a el muntacàrregues d’una obra en construcció-que permetia el trànsit de tubs, plaques de Petri, i idees entre els 2 equips.
Tots els matins , Jacob solia passar ràpidament pel nostre laboratori abans de tancar-se amb les seves tècniques, Martine i Danièle, per analitzar els colors de les colònies en les plaques de Petri, resultants de l’eficiència de degradació de la lactosa, dels ceps sotmeses a mutàgens com UV , RX …, i repicar, aïllar i programar amb detall els següents experiments. Després de visualitzar les seves plaques, seleccionava una gran quantitat de ‘mutants’ que després ‘baixaven’ al nostre laboratori. Madeleine Jolit (l’altra tècnica de Monod) s’encarregava de l’mapeig de les mateixes. Jo analitzava els enzims de sistema en diverses condicions de creixement. Les dades eren analitzats i comptabilitzats en funció de la inducció o no i repetits. Una nomenclatura apropiada dels ceps i mutants ens permetia saber si es tractava de soques HFR (donadores) o F-receptores per a la conjugació; de ceps salvatges per al operó lactosa o mutants d’UV o RX en algun dels seus gens, auxótrofas, etc. Jacob, a què dèiem Le grand François, tornava a la tarda al nostre laboratori per a ‘controlar’ resultats i discutir-los amb Monod. El seu escriptori es comunicava amb el laboratori i en aquest horari solíem compartir el te amb Madeleine, David Perrin, Gérard Buttin, i altres convidats. Només romania aliè el silenciós Shiro Naono, que no compartia ni l’idioma ni els costums culinàries, i menys encara ‘nostre te’, però ens regalava el seu millor somriure com oriental ben educat.
Les discussions eren intenses, i David intervenia contínuament. A poc a poc, Monod solia desplegar un mapa sobre l’escriptori on s’ubicaven les mutants i les activitats enzimàtiques, induïdes o no. El ‘model’ apareixia i s’analitzava quins experiments i construccions faltaven per ser més convincent. L’aïllament de plasmidis F’permitió obtenir merodiploides estables per al operó Lac, construir fusions de Lac a altres operons i avançar amb el model. Moltes tardes, Jacob es passejava amb certa impaciència esperant els resultats: L’aparició de l’groc en els tubs de l’experiment en curs! Els ‘experiments de segle’ eren quotidians i tots crèiem en ells, fins que després de diverses hores o dies de treball ens convencien que el resultat no era l’adequat i el mateix quedava “enterrat a l’armari de resultats no explicables”. Jacob desapareixia quant albirava que el resultat era negatiu. Molts dies ens venia a convèncer de la importància de l’experiment, ‘copiant’ a Monod que tenia com a principi explicar-nos tant les metes dels experiments com les bases de les tècniques i aparells utilitzats.
Recordo que moltes nits jo tornava a laboratori, abans que tanquessin l’entrada principal de l’Institut, bé per acabar algun experiment, canviar mostres en el comptador de centelleig, repicar cultius, etc. Llavors escoltava el pas de l’serè que venia apagant el gas i els llums, deixant sonar el seu rest de claus que torbaven el silenci de la nit; semblava un personatge de novel·la sinistra. Mai vaig haver de saltar la reixa per entrar com molts dels meus companys, però sí vaig entrar en més d’una ocasió a través de l’accés de l’hospital.
En aquell temps, a més dels seminaris que es realitzaven de forma quotidiana, un divendres a l’mes tots ens desplaçàvem a la biblioteca de l’Institut de Physico chimie, al barri llatí, on es realitzaven seminaris més importants (Club de Physiologie cellulaire) amb la presència de convidats estrangers. Monod va voler des del principi que jo estigués present en tots els seminaris i després em feia un examen i jo li escrivia un informe d’aquest.
Recordo les classes de genètica que Jacob va dictar al Collège de France, que eren un veritable plaer per la seva qualitat, imaginació i humor.La classe inaugural de Monod al Collège de France, el 1967, on va presentar el seu primer assaig sobre l’anàlisi filosòfica de la ciència, va aixecar molta controvèrsia i va impactar tant a científics com a filòsofs.
“Com 1 científic s’atreveix parlar de Filosofia? ” Aquest va ser l’inici de les seves noves preocupacions, que va plasmar en el seu llibre Le hasard et la necessite, encara avui tema d’anàlisi i discussió en classes de Filosofia. La presència de Monod en els seminaris era alhora apreciada i temuda, ja que tenia la facultat d’incomodar a qualsevol que fes alguna pregunta que ell considerés absurda o poc elaborada. la seva mirada deixava ‘clavat’ a un en la seva cadira i les seves reflexions podien arribar a ser desqualificadores. d’altra banda, la seva capacitat d’anàlisi, de síntesi, li permetia ‘explicar’ a l’expositor l’abast dels seus resultats, els experiments que faltaven …, fins i tot en terrenys no directament lligats a la seva especialitat, el que la majoria admirava i respectava.
Entusiasta, cordial, atent, aquest era el ‘Jacques’ que descriu també Jacob i és el que va estimular el meu compromís amb la ciència, el que em va permetre acabar els meus estudis universitaris. Vaig tenir la sort de participar en el que va ser la gran aventura de l’operó i més tard en plena eu fòria de la Alosteria vaig participar en molts experiments sobre enzims al·lostèrics amb JP Changeux. A l’acabar la meva llicenciatura, em van confiar analitzar a la GDH (glutàmic-deshidrogenasa) d’E coli per posar en evidència les seves propietats alostéricas. Purificació, cinètiques de tot tipus, determinació de la velocitat de sedimentació, de Km i Ki de diferents substrats en les dues direccions …, totes mostraven el comportament esperable per un enzim al·lostèric, però cap nova propietat per a ‘el model’, així que només quedar en els meus quaderns. Després de més d’un any, aquesta línia de treball va ser abandonada; no es publicava res que no fos considerat com nou i acceptat per li patró. ¡Quina hagués estat la seva sorpresa (i alegria) si hagués descobert que el Repressor, el seu repressor Lac, és una proteïna al·lostèrica!.
Quan la meva carrera científica va estar encaminada, Monod va posar una llum d’alerta: “Carmen , aquest ofici és molt dur, deixi-ho a els nois! “. Tota una explícita opinió que mostra el difícil que ha estat per a les dones l’accés a el món de la ciència, com ho analitza Sandra Legout. Encara que va haver moltes científiques treballant en el seu laboratori , crec que he estat l’única dona que ha realitzat una tesi sota la seva direcció.
També vaig conèixer a l’altre protagonista, ‘Monod’. Així com tots vam poder comprovar i apreciar la seva creativitat i intel·ligència, podia ser extremadament rígid en modificar qualsevol aspecte referit a l’ ‘dogma central’: ADN > ARNm proteïnes. No va resultar fàcil que acceptés la regulació positiva d’arabinosa (Engelsbeg a 5) i més pròxima de nosaltres, la de maltosa (M Schwart a 5). en aquest context els meus resultats de Tesi sobre, ‘La repressió catabòlica en l’operó lactosa’, que proposaven una regulació a nivell traduccional, o la presència d’un segon promotor per a l’inici de la traducció (el que després seria una seqüència Shine- Delgarno), no van ser benvinguts i no es van publicar! Va preferir aprofundir en els estudis de repressió catabòlica amb els efectes de l’AMPc, on es van posar en evidència efectes regulatoris a nivell transcripcional. Aviat apareixerien treballs mostrant efectes regulatoris de la repressió catabòlica a nivell de traducció; jo mateixa, lluny de l’Institut, vaig poder aportar dades en aquest sentit.
Amb el pas el temps, Monod va anar guanyant terreny. Aquest es va exacerbar per la seva necessitat incomprensible de festeig que alguns van fomentar. A molts ens va semblar lamentable el seu pas de el te a l’whisky envoltat d’una cort addicta, ja que en la nostra opinió no necessitava d’ella per ser valorat. La seva intransigència en acceptar resultats diferents, sobretot quan els seus impulsors no participaven de ‘la cort’, el van portar a cometre injustícies. Així és com no va entendre o acceptar els resultats de la ‘transcriptasa inversa’ en bacteris, que descrivia Mirko Beljanski ja el 1967 en el seu propi Service abans que H. Temin ho fes en virus, el que li va valer el Premi Nobel juntament amb D. Balimore i R. Dulbecco el 1975. en canvi es va cometre una gran discriminació amb Mirko tant en termes científics com pel que fa als recursos que us ha donat a l’Institut. Precisament en aquesta època, durant els meus experiments sobre repressió catabòlica, vaig suggerir que altres mecanismes diferents de l’repressor podrien intervenir en la regulació de Lac. Llavors vaig pensar que una transcriptasa inversa podria jugar un paper en aquest tipus de regulació. Vaig mesurar aquest enzim en condicions o no de repressió catabòlica i vaig observar diferències significatives que podrien justificar un tipus de regulació per una altra via. Malgrat les advertències de David (Li patró n’aimera pas ça!), Quan em vaig trobar amb Monod per analitzar els progressos del meu treball, va tractar primer de convèncer-me del poc fiables que eren les dades (i de la ‘enzim de Mirko’) i, després de la meva resistència i insistència en una anàlisi més científic, em va comminar a abandonar aquesta línia.
Cap als anys 70, Jacob es va dedicar a l’estudi d’organismes eucariotes (ratolins) i es va mudar a el nou edifici Jacques Monod, a l’altre costat del carrer. Era tota una aventura creuar el carrer del Dr. Roux on es troben la cripta de Pasteur i la Biblioteca Central, testimonis d’una altra època. En aquest lloc, a Cap d’Any, els directors oferien a el personal els seus desitjos de felicitat. ¡També a la data de la mort de Pasteur es realitzava una commemoració amb tot el personal que després desfilaríamos per la cripta per donar el condol a les autoritats! Dos importants ocasions per creuar el carrer!
Monod, en canvi, va deixar el laboratori per la direcció de l’Institut Pasteur on va reorganitzar tant l’obtenció de recursos com la distribució de grups: els projectes d’investigació es realitzarien en París; les aplicacions i producció en Garches, tot un enrenou, ¡a l’Institut Pasteur! En una conversa que vaig tenir amb F. Jacob el 2010, repassem la nostra visió de la ciència actual: massa justificada cap a les ‘aplicacions’. Per tots dos va ser un plaer recordar el que va ser el període excitant que ens va tocar viure, el que alguns van denominar “la febre de la Biologia Molecular ‘. Només 2 períodes de la seva vida van ser tan excitants, l’altre va ser la seva vivència a Àfrica de nord durant els combats i com a metge durant la II Guerra Mundial.
Avui, 50 anys després d’aquestes vivències i molts quilòmetres de pel mig, segueixo valorant l’important que va ser trobar-me aquí en aquest moment i amb aquest entorn tan excepcional, el que va encendre la flama estimulant (li feu sacré) que em permet continuar sempre més enllà, tot i les traves amb les quals ens vam trobar a el dia a dia.
Bibliografia
1960 “l’operó: groupe de gens à expression coordonnée parell 01:00 Opérateur”. F. Jacob, D. Perrin, C. Sanchez et J. Monod. Compt. Rend Acad. Sci. 250, 1727 1729
1961 “Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins”. F. Jacob & J. Monod. Jmol Biol 3: 318- 336
1963 “Allosteric proteins and cellular control systems”. Monod, J., Changeux, J.-P., and Jacob, F. (1963) J. Mol. Biol. 6, 306-329
1987. “La Statue intérieure”. F Jacob Editions Odile Jacob
1980. “Les origines de la Biologie Moléculaire: Hommage à Jacques Monod”. A. Lwoff & A. Ullmannn. Collection Academic Press
1970. “Li hasard el la necessite. Essai sud la philosophie naturelle de la biologie moderne”. J. Monod, Éditions du Seuil
1964-1965- “Caracterització i paràmetres enzimológicos de la l-glutàmic-deshidrogenasa d’e coli “. C. Sánchez, J.Monod & JP Changeux. Inèdit
1966. -” sur les propiétés de la l-thréonine désaminase d’Biosynthèse d’1 mutant d’E.coli K12 “. C. Sanchez, JP Changeux. Bull. Soc. Chi. Biol. 48, 705.713
2009 . “Allostery in the Laci / GalR family: variations on a theme”. L. SWINT-Kruse and KS Matthews. Current Opinion in Microbiology 12: 129-137
1968 – “Etude de l ‘effet glucose sur l’ operó lactose d’E.coli K12”. C. Sánchez, Tesi de 3r cicle en Bioquímica, Universitat de Paris VI. novembre 1968. Director: J. Monod
1968- “Cyclic AMP es an antagonist of catabolite repression in Escherichia coli”. Ullmann A. &. Monod J. FEBS Letters vol2 nº1: 57-60
1969- “Catabolite repressió of the lac operon: repression of translation”. MD Yudkin and V. Moses. Biochem. J. (1969) 113, 423
1976- “Catabolite Translational effects on the lac messenger RNA of E. coli K12”. C. Sánchez Rivas & B. Mendez. Molec. Gen. Genet. 148, 98.104.
1972 Synthèse in vitro d’l’ADN sud uneix matrius d’ARN per s’uneix transcriptase d’Escherichia coli. Beljanski M. Compt Rend Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 1972 May 1. 5; 274 (20): 2801-4.
1972 “The RNA tumor viruses-background and foreground”. Temin HM. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1972 abril; 69 (4): 1016-20
2013 “Les femmes pasteuriennes: de la” cuisine “à la paillasse”. Sandra Legoût. Conférence culturelle du Musée Pasteur. 21 février 2013.
Notes:
Operón
Per a una determinada funció (metabolisme de la lactosa) es requereixen una sèrie d’enzims (ß-galactosidasa, ß-galactosil permeasa, transacetilasa). els gens corresponents es troben associats estructuralment i responen coordinadament a un equip de reguladors (proteïnes i seqüència operador) formant un operó.Les interaccions ambientals permetran (regulació positiva) o no (regulació negativa) la transcripció de la conjunta (unitat transcripcional) per després produir les proteïnes necessàries a la funció. En el cas de regulació negativa (com Lac) l’inductor (lactosa i / o alolactosa) intercepta l’associació de l’repressor a l’ADN (operador) i permet la transcripció del conjunt. La presència de glucosa, font de carboni preferent, interfereix la capacitat d’inducció de la lactosa exercint repressió catabòlica. Només a l’esgotar la glucosa s’expressen els gens lac; en aquestes condicions les corbes de creixement mostren 2 etapes amb diferents velocitats de creixement separades per un altiplà (diauxia).
Profago i lisogènia
Alguns virus de bacteris (bacteriòfags o fags) poden romandre ‘muts’ a l’interior del seu hoste en forma de profago i es diu que el seu hoste és lisogen per a aquest fag. Això implica que el bacteri és immune a virus similars; però en certes condicions (d’estrès) el profago es pot ‘despertar’ i lisar a l’hoste.
Conjugació
Es va posar en evidència en bacteris, primer en Escherichia coli, el que permetre parlar de la sexualitat dels bacteris. Algunes soques tenen la capacitat de transferir amb alta eficiència seu genoma (HFR, per alta freqüència de recombinació) a altres bacteris acceptores en una seqüència de temps relacionada amb la posició dels gens en el cromosoma. Es deu a la presència d’un facto F integrat al seu genoma absent en la acceptora (F-). En alguns casos s’han pogut aïllar soques portadores de l’factor F en forma de plasmidi que a l’escindir-se de l’genoma bacterià comporten alguns dels gens (F’o F prima). Això permet construir diploides parcials per a aquests gens (merodiploides). Quan l’ADN entrant és portador d’un profago, i el bacteri receptora és susceptible a aquest fag, en el moment en què ingressa l’profago al cep receptora aquest provoca la lisi (inducció cigótica). Això es deu a l’absència de repressor de l’cicle lític en el receptor.
Alosteria
Les proteïnes alostéricas són multímeros en els quals la unió d’una molècula d’efector (substrat o inhibidor) a un dels seus monòmers (protómero) provoca un canvi conformacional que modifica l’afinitat (Km, Ki) i / o la velocitat de la reacció (Vmax) per l’efector.
Transcriptasa inversa
Són enzims que a partir d’ARN, sintetitzen ADN. Els virus el genoma és ARN, requereixen d’aquest enzim per poder romandre i associar-se a l’genoma d’l’hoste.
Carmen Sánchez de Rivas, (Barcelona, 1939): llicenciada en Química i Fisiologia, doctora en Bioquímica (Université de Paris VI). Va desenvolupar la seva carrera científica entre França (Institut Pasteur i Universitat d’Orsay) i l’Argentina (Universitat de Buenos Aires). Actualment participa d’un grup d’investigació sobre bacteris gram positives, els seus fags i estrès. És investigadora ad-honorem de l’CONICET (Consell Nacional de Ciència i Tecnologia) d’Argentina.
Edició realitzada per César Vaig prendre López a partir de materials subministrats per CIC Network