Proteòmica en malalties infeccioses | Malalties Infeccioses i Microbiologia Clínica

Introducció

Les malalties infeccioses comporten un dels majors problemes de salut a nivell mundial, provocant una gran morbimortalitat i assolint nivells de milions d’afectats cada any1. L’increment de viatges, canvis demogràfics i resistències a antimicrobians contribueix significativament a aquest fenomen. El tractament de les malalties infeccioses es basa en un primer diagnòstic seguit de l’administració de l’fàrmac corresponent.

La majoria de les malalties infeccioses són la conseqüència d’una complexa xarxa d’interaccions que poden implicar de centenars a milers de factors, tant d’el patogen com de l’hoste. Per assolir un millor enteniment dels processos de les malalties infeccioses és essencial realitzar estudis traslacionals i multidisciplinaris on s’integren la cooperació amb el personal implicat en les diferents àrees de treball.

Les anàlisis més exhaustius realitzats fins al moment en Pel que fa a la recerca de biomarcadors i noves dianes per a fàrmacs i vacunes s’han realitzat a partir d’estudis en genòmica i transcriptòmica. En les últimes dècades ha augmentat significativament el nombre d’estudis proteòmics en malalties infeccioses i en tot l’àmbit clínic per a la recerca de biomarcadors i noves dianes per a la vacunació i fàrmacs.

La seqüenciació de l’genoma microbià ha revolucionat el estudi dels patògens, no només a nivell de microbiologia bàsica, sinó també en diagnòstic, epidemiologia, fisiopatologia, tractament de les malalties i desenvolupament de vacunes. A més, la seqüenciació de l’genoma microbià ha possibilitat l’estudi dels seus proteomes. El primer genoma seqüenciat va ser el virus de l’Epstein-Barr (1984), de 170Kbs2, i una dècada després, el 1995, es va seqüenciar el genoma del bacteri gramnegativa Haemophilus influenzae, de 1,8Mb3.

Molts estudis es basaven en l’anàlisi dels gens expressats en diferents tipus cel·lulars i teixits en diferents contextos fisiològics, principalment mitjançant una anàlisi d’ARN missatger (ARNm), sense existir sovint una correlació directa entre el contingut en ARNm i el contingut proteic. La manca de correlació entre els nivells ARNm-proteïna es deu al fet que el conjunt de proteïna produïda per una quantitat donada d’ARNm depèn de l’estat fisiològic de la célula4. Un exemple d’aquesta absència de correlació entre transcriptòmica (ARNm) i proteòmica (proteïna) es demostra en el treball de Franco et al.5, on es comparen dues soques de Helicobacter pylori, un carcinogènica i un progenitor no carcinogènic. Les anàlisis en ARNm no van mostrar diferències entre les dues soques, mentre que a nivell proteic aquests ceps eren diferenciables.

La proteòmica és considerada el següent pas en l’estudi d’un sistema biològic, després de la genòmica i transcriptòmica. La complexitat dels estudis proteòmics és més gran, ja que el genoma d’un organisme és estàtic, mentre que el proteoma difereix d’una cèl·lula a una altra i entre estats. El terme proteoma6, definit per Marc Wilkins el 1994, és una imatge dinàmica de totes les proteïnes expressades per un organisme, cèl·lula o compartiment subcel·lular concret, en un moment donat i sota determinades condicions, constituint el mapa d’expressió proteica d’una cèl·lula, teixit o organisme donat. Un factor addicional de complexitat són les modificacions que pot experimentar l’estructura o seqüència bàsica de la proteïna (per exemple, el processat proteolític) i les modificacions postraduccionals (PTM), que serveixen per modificar o modular l’activitat, funció o localització de una proteïna en diferents contextos fisiològics o metabòlics. Finalment, un altre factor de complexitat és el moonlighting o multifuncionalitat, en què una mateixa proteïna pot realitzar diverses funciones7.

La proteòmica, terme també encunyat per Wilkins, és un nou enfocament en l’estudi de les proteïnes que ha evolucionat en els últims anys gràcies a la integració de tecnologies com a mètodes de separació de proteïnes d’alt rendiment, espectrometria de masses (MS) i, sobretot, eines en bioinformàtica que han permès l’anàlisi d’un gran volum de dades. Gràcies a la seva aplicabilitat, la proteòmica permet no només identificar les proteïnes, sinó també categoritzar i classificar-les en quant a la seva funció i interaccions.

El camp d’estudi de la proteòmica és realment ampli, però podem agrupar en 3 subgrups: a) proteòmica d’expressió, l’objectiu és identificar les proteïnes presents a la mostra així com obtenir tota la informació sobre abundàncies , PTM i localització subcel·lular; b) proteòmica estructural, que permet l’obtenció de l’estructura tridimensional de les proteïnes, i c) proteòmica funcional, la finalitat és esbrinar la funció de les proteïnes i conèixer les interaccions que puguin efectuar.

Les tècniques en proteòmica ofereixen un nou i potent enfocament per al diagnòstic de patògens, seguiment de brots, dinàmica patogen-hoste, control de la malaltia i desenvolupament de fàrmacs i vacunes.

la present revisió té com a objectiu mostrar l’àmplia varietat de tècniques i aplicacions disponibles en el camp de la proteòmica destinades a l’estudi de les malalties infeccioses.

metodologies proteòmiques

les tècniques en proteòmica envolten multitud de metodologies experimentals, com electroforesi en 2 dimensions (2de), cromatografia líquida (LC ) i MS. La combinació d’aquestes tècniques amb un posterior anàlisi bioinformàtica és utilitzada per a l’estudi proteic d’una gran varietat d’organismes. Aquestes tècniques són potencialment valuoses, encara que hi ha complexitats en les mostres que poden afectar la seva anàlisi i interpretació, com són el grau de PTM, l’abast dinàmic de l’expressió (p.ex., l’abundància d’albúmina en plasma emmascara proteïnes minoritàries) i problemes de detecció de proteïnes associades a membrana8.

el major obstacle per al progrés en l’àrea de la proteòmica és la dificultat en la recopilació de patògens in vivo en suficient abundància i de forma adequada per a anàlisi proteòmics. Tot i ser aquestes les condicions idònies per a estudis d’expressió de proteïnes en microorganismes patògens, hi ha casos en què no es pot fer i el cultiu axénico (in vitro) es converteix en la millor opció. S’han analitzat multitud de patògens utilitzant tècniques proteòmiques en condicions in vitro. Aquests estudis permeten conèixer la magnitud d’expressió de proteïnes i tenir una idea global del seu proteoma. Basar-se únicament en l’estudi de l’proteoma en aquestes condicions pot provocar la pèrdua d’una informació fundamental9-12, ja que no permet identificar les proteïnes implicades en infecció, com a factors de virulència, proteïnes que permeten l’evasió de la resposta immune de l’hoste i proteïnes que permeten la utilització de la maquinària cel·lular de l’hoste per propagar-se. Una simulació experimental de les condicions d’infecció in vivo és la infecció de cultius cel·lulars (simulació in vitro d’l’entorn d’infecció) o la utilització de models animales13,14. El desavantatge en aquests estudis rau en la presència d’una gran “contaminació” per proteïnes de l’hoste, a més d’una baixa obtenció de biomassa de l’patogen.

En conjunt, enfocaments experimentals in vitro / ex vivo tenen implicacions significants pel que fa a la identificació de noves vacunes, dianes per a fàrmacs, biomarcadors d’infectivitat i progrés de malaltia.

la majoria de les proteïnes implicades en els primers estadis d’infecció de l’hoste són les proteïnes de superfície cel·lular. Aquestes proteïnes són la connexió entre la cèl·lula i el medi extracel·lular, de manera que són el mediador principal a la infecció. Per tant, són components de gran interès per al desenvolupament de noves vacunes i per a la caracterització de noves dianes per a fàrmacs. La informació d’aquestes molècules es troba en baixa representació en els estudis proteòmics per la seva baixa abundància, poca solubilitat i la problemàtica en el seu fraccionament sense una contaminació per proteïnes citoplasmáticas15,16. En el cas de l’estudi dels bacteris grampositius i fongs, també és important conèixer la composició proteica de la paret cel·lular i no només de la membrana plasmática17.

Preparació de mostra

L’obtenció i preparació de les mostres és un dels passos més rellevants en els estudis proteòmics. És de vital importància que les mostres siguin preses i processades mitjançant el mateix protocol perquè els resultats obtinguts siguin veraços, reproduïbles i que les diferències observades no siguin fruit de la manipulació.

El processament de la mostra en el laboratori difereix segons la procedència d’aquesta i la finalitat de l’estudi. En els estudis en cultiu axénico no cal un aïllament previ per a l’obtenció de la mostra proteica. Per contra, quan s’analitza el microorganisme en estat infectiu, la preparació de la mostra precisa d’un aïllament de l’microorganisme respecte a les cèl·lules de l’hoste.Els mètodes més comunament utilitzats per a la separació són la centrifugació, la separació immunomagnètica (IMS) i la classificació de cèl·lules mitjançant citometria de flux (FACS).

El primer mètode, la centrifugació, és el recomanat per patògens amb paret cel·lular (plantes, fongs, algues, arqueges i bacteris grampositius), prèvia lisi de les cèl·lules eucariotes (hoste) per pressió osmótica18,19 o detergents com el tritónX-11413.

En el segon mètode, la tècnica d’IMS, s’utilitzen partícules magnètiques conjugades amb una immunoglobulina (Ig) específica enfront de l’microorganisme d’interès. Aquests microorganismes poden ser fàcilment enriquits i purificats, generant suficient biomassa virtualment lliure de proteïnes de l’hoste per una exhaustiva anàlisi de l’proteoma. L’avantatge més important respecte a la centrifugació és l’obtenció d’una mostra lliure de contaminants procedent de l’hoste. Per contra, aquesta tècnica requereix anticossos específics enfront de estructures de la superfície de l’patogen.

En el tercer mètode, el FACS, s’utilitzen anticossos específics per al marcatge fluorescent de l’microorganisme diana, amb la finalitat de facilitar la separació d’aquest respecte a altres microorganismes o detritus de la cèl·lula hoste. Aquesta tècnica pot separar milers de partícules per segon, però l’acumulació de suficient material patogen per a l’aplicació de tècniques proteòmiques requereix bastants hores de classificació, fent-la molt costosa.

Tots aquests mètodes de separació han de ser optimitzats per incrementar la velocitat de processament de la mostra i reduir el risc de digestió parcial per proteases, a més de reduir la probabilitat de contaminació amb proteïnes de l’hoste.

Els estudis en proteòmica es poden dirigir a l’estudi de l’proteoma total, subproteoma o una proteïna concreta. La selecció d’una proteïna o població proteica determinada s’ha de realitzar mitjançant un fraccionament de la mostra. Entre les tècniques utilitzades per a aquesta finalitat cal destacar la purificació d’afinitat en tàndem (TAP) 20, co-immunoprecipitació (CO-IP) 21 i el xip d’exploració de l’peptidoma mitjançant HLA22,23.

Tècniques proteòmiques

les tècniques proteòmiques es divideixen en qualitatives i quantitatives. Les primeres informen sobre l’expressió o no d’una determinada proteïna o conjunt proteic (presència / absència), mentre que la proteòmica quantitativa permet determinar i comparar la quantitat de proteïna present a la mostra.

En els estudis en proteòmica, la mostra és una barreja complexa de centenars / milers de proteïnes. Per aquest motiu és essencial la utilització d’una tècnica de separació. Aquestes tècniques s’agrupen en: en gel i gel-free. Les tècniques en gel són aquelles en què s’utilitza un entramat de polímers per a la separació. Les tècniques gel-free realitzen la separació de la mostra proteica en solució mitjançant diferents tipus de cromatografia líquida (intercanvi iònic, afinitat, fase reversa …). A la taula 1 es mostren els avantatges i desavantatges de les diferents tècniques proteòmiques.

Proteòmica cualitativaTécnicas en gel

La separació de les proteïnes en gel és una eina que permet la separació d’aquestes per propietats com la mida (Mr), el punt isoelèctric (pI) i / o la conformació (gels nadius). La separació en gel es pot realitzar per una sola propietat (monodimensional) o per 2 propietats consecutives (bidimensional). A causa de la complexitat dels extractes proteics totals, la separació de les mostres en electroforesi bidimensional (2de) ofereix una major resolució. Mitjançant aquesta tècnica les proteïnes són separades per pI i posteriorment per Mr, obtenint un mapa global de l’proteoma de la mostra.

La tècnica 2de únicament pot ser aplicada satisfactòriament si hi ha un mínim de 108 cèl·lules aïllades. Aquesta tècnica permet separar entre 3.000-5.000 proteïnes únicas24, diferenciades generalment en un únic espot. No obstant això, una mateixa proteïna pot identificar-se en diferents espots, indicant que aquesta proteïna presenta diverses isoformes que difereixen en pI i / o Mr. Aquestes isoformes poden informar sobre les possibles PTM d’una determinada proteïna. Les PTM més freqüents són fosforilacions, glucosilaciones o proteòlisi limitada25. Un altre fenomen menys comú és la identificació de dues proteïnes en el mateix espot, per la seva mateixa pI i Mr.

La preparació de la mostra per a l’electroforesi bidimensional és crucial per a l’obtenció de resultats òptims, sent necessaris processos de solubilització, disgregació, desnaturalització i reducció de les proteínas26.

Una possibilitat que ofereixen els gels 2D és la seva combinació amb tècniques de marcatge de proteïnes permetent la comparació de proteomes en un mateix gel, evitant d’aquesta manera les variacions interassaig (entre gels / experiments). Aquesta tècnica és coneguda com a gel bidimensional diferencial (2D-DIGE). El marcatge mitjançant fluoròfors pot ser aplicat a l’estudi comparatiu de 2 proteomes permetent una quantificació relativa de les mostres. Aquest marcatge pot dirigir-se a conjunts específics de proteïnes; per exemple, l’estudi de proteïnes amb regions exposades cap al medi extracel·lular. L’aplicabilitat d’aquesta tècnica ha permès l’estudi de l’surfoma27 evitant el fraccionament de proteïnes de superfície, les quals solen ser llargues i costoses.

Els gels 2D-DIGE es poden aplicar a la recerca de dianes terapèutiques analitzant el proteoma in vitro enfront de l’proteoma de l’patogen en situació d’infecció, obtenint en el mateix gel la comparativa de l’proteoma en ambdues situacions. A causa de la dificultat per obtenir mostra suficient de patogen en situació d’infecció, s’han realitzat estudis en els quals es compara el proteoma de l’microorganisme in vitro en diferents fases de creixement. En el treball de Hayashi et al.28 es van estudiar les proteïnes expressades per Legionella pneumophila en 2 fases de creixement: exponencial i postexponencial, observant-se una elevada expressió de factors de virulència en la fase postexponencial. Gràcies a aquest estudi es pot establir en futurs treballs en Legionella el proteoma en fase postexponencial com aproximació de l’proteoma en infecció.

Un desavantatge important de la tècnica 2de és la limitació en la capacitat d’enfocament de proteïnes de mitjana a baixa abundància causa de la gran gamma de nivells d’expressió de proteïnes. Les proteïnes més afectades per aquesta limitació són les proteïnes de membrana i proteïnes de baix pes molecular, que es troben subrepresentades en proteomes totals. Aquestes proteïnes poden ser millor detectades mitjançant altres tècniques proteómicas29.

Tècniques gel-free

La tècnica gel-free requereix una primera separació de les proteïnes presents a la mostra mitjançant cromatografia líquida per diferents propietats, definides segons la columna utilitzada . Existeixen al mercat diferents tipus de columnes, sent les més utilitzades les de fase reversa, intercanvi iònic, afinitat i exclusió molecular. Posteriorment es realitza una anàlisi mitjançant MS per a la identificació de les proteïnes (LC-MS / MS).

Les tècniques de separació gel-free són aconsellables quan la quantitat de mostra és escassa, com és el cas de experiments en infecció en els quals s’obté una baixa quantitat de microorganismes. En aquests casos, les tècniques gel-free MS són adequades per oferir una millor sensibilitat, ja que permet monitoritzar 500-600 proteïnes des únicament 106 células14 (una quantitat 100 vegades menor que en els gels 2D). Aquesta tècnica permet la detecció de proteïnes difícilment separables en 2de, com proteïnes molt hidrofòbiques, proteïnes de membrana i proteïnes amb pI o Mr extrems, com són les proteïnes ribosomals amb un pI básico30-32. Un clar exemple en el qual es demostra aquesta major sensibilitat és el treball realitzat en Mycoplasma genitalium, model de genoma i proteoma mínim, en el qual es va estudiar la fracció rica en proteïnes de membrana mitjançant fraccionament per tritón114. L’anàlisi d’aquesta fracció es va realitzar tant per 2de com per LC-MS, obtenint-se una clara diferència pel que fa a nombre de proteïnes identificades. Mitjançant 2de es van identificar 49 proteïnes, mentre que per LC-MS es van identificar 242 proteínas33.

Proteòmica quantitativa

La proteòmica quantitativa és una eina útil per a les anàlisis proteòmiques mitjançant LC-MS / MS34. Els mètodes de quantificació es poden classificar en quantificació relativa / absoluta o amb / sense marcatge.

Els mètodes de quantificació relativa (ICAT, iTRAQ, IPTL o SILAC) són utilitzats per a la comparació d’abundàncies de proteïnes o pèptids entre mostres. D’altra banda, mitjançant l’ús de pèptids sintètics marcats isotòpicament s’obté una quantificació absoluta dels pèptids diana.

Proteòmica quantitativa mitjançant marcatge

Les tècniques quantitatives mitjançant marcatge utilitzen compostos isotòpics per a un posterior anàlisi mitjançant MS, obtenint una quantificació relativa. El marcatge de les proteïnes pot efectuar-se durant el creixement cel·lular o un cop realitzada l’extracció d’aquestes. Les mostres a comparar són diferenciades mitjançant marcatge isotòpic. Segons la tècnica de marcatge diferenciem: ICAT (Isotope code affinity tagging: marcatge per afinitat amb codificació isotòpica) 35, iTRAQ (multiplexed isobaric tagging chemistry: etiquetatge isobàric multiplexat químic) 36 i IPTL (isobaric peptide Termini labeling: unió terminal isobàrica de l’pèptid) 37.

la quantificació relativa mitjançant marcatge permet la comparativa de 2 poblacions segons el seu creixement cel·lular mitjançant SILAC (stable Isotope labeling by / with amino àcids in cell culture: marcatge isotòpic estable d’aminoàcids en cultiu cel·lular). En aquesta tècnica, els marcadors isotòpics no radioactius són incorporats durant el creixement cel·lular a les proteïnes sintetitzades de novo38-41.

Les tècniques de quantificació mitjançant marcatge tenen certes limitacions, com és l’increment de la complexitat en la preparació de la mostra (pel tractament independent de la mostra), la necessitat d’una gran concentració d’aquesta, els costos elevats dels reactius, marcatges incomplets que distorsionen el resultat i la necessitat de programari específic per a la quantificació.

proteòmica quantitativa lliure de marcatge

Les estratègies lliures de marcatge poden ser utilitzades per a quantificació tant relativa com absoluta. Aquestes tècniques aconsegueixen una major rapidesa, resultats més nets i una anàlisi simple dels resultats. Per aquest motiu són prometedores en la quantificació de proteïnes poc abundants per la seva alta sensibilitat, encara que per ser aplicades s’han de tenir en compte certs criteris: a) cal disposar d’espectròmetres de masses amb gran precisió i instruments HPLC amb un temps segur de retenció; b) ha de ser aplicat suficient material per a determinar la concentració proteica abans del mesurament per MS amb la finalitat d’aplicar quantitats equivalents de pèptids, i c) el nombre de pèptids de la cèl·lula hoste ha de ser reduït a el mínim per evitar falsos positius.

La quantificació de proteïnes per aquest mètode es basa generalment en 2 categories: a) mesurament dels canvis d’intensitat dels ions, ja sigui per àrea dels pics o per l’altura d’aquests en espectrometria, ib ) recompte d’espectres de les proteïnes identificades després de l’anàlisi MS / MS42-53.

Una millora de la proteòmica quantitativa sense marcatge és la incorporació de pèptids sintètics marcats isotòpicament com a estàndards interns. Aquests pèptids permeten una quantificació absoluta (AQUA: absolute Quantification) dels pèptids de interés54.

Instruments per a anàlisi i identificació proteica mitjançant espectrometria de masses

La identificació de proteïnes es realitza en la seva gran majoria mitjançant espectròmetres de masses. Aquests instruments permeten l’obtenció d’ions a partir de molècules orgàniques, separant-los i detectant en funció de la seva massa / càrrega (m / z). Els espectròmetres de masses consten de 3 components: font d’ionització, analitzador de massa i detector. Hi ha diferents tipus d’espectròmetres de masses segons la combinació dels diferents elements. Els més comunament utilitzats són:

• •

  MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization-Time Of Flight: desorció / ionització mitjançant làser assistit per matriu, “temps de vol” ): utilitzat comunament per a la identificació de proteïnes mitjançant empremta peptídica i l’estudi dels perfils proteics d’una mostra i interaccions de proteïnes. Cal destacar el desenvolupament de la tècnica del “Imaging”, que permet una visualització en 2 dimensions de la distribució de metalls traça, metabòlits, lípids de superfície, pèptids i proteïnes, directament en els teixits sense realitzar una fixació o extracció previa55,56.

• •

  SELDI-TOF (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time Of Flight: desorció / ionització mitjançant làser de superfície millorada, “temps de vol”): aquest instrument utilitza la mateixa tecnologia que el MALDI-TOF incorporant la funcionalització de la placa (intercanvi iònic, fase reversa, anticossos, ADN, altres proteïnes, etc.) en la qual es carrega la mostra. La comparació de les proteïnes retingudes a la placa entre diferents mostres pot ser utilitzada per a la recerca de biomarcadores57.

• •

  ESI (electrospray Ionization: ionització per electrospray): aquest dispositiu és especialment útil per a la seqüenciació peptídica, ja que permet la ionització de les macromolècules fragmentándolas pels enllaços peptídics (unions més febles), obtenint d’aquesta manera la seqüència aminoacídica56,58.

Bioinformàtica

Les anàlisis proteòmiques generen una gran quantitat de dades a analitzar. El desenvolupament d’eines bioinformàtiques, com la introducció de nous algoritmes, ha estat clau per manipular aquests conjunts de dades. Aquest camp permet i facilita la manipulació de dades a gran escala, desenvolupant programes i eines de recerca oportunes. Aquestes eines s’han aplicat amb gran èxit en el processament de dades MS tant en anàlisi d’empremta peptídica (identificació de proteïnes), empremta de fragmentació peptídica (identificació de la seqüència de pèptids) i seqüenciació de novo.

hi ha multitud de programes que permeten la identificació in sillico de proteïnes. En estudis proteòmics en malalties infeccioses hi ha programes que permeten la identificació i caracterització d’epítops de l’patogen que interaccionen amb el sistema immune de l’hoste, inmunoma. Les interaccions patogen-hoste no es coneixen en profunditat en moltes de les malalties infeccioses, per la qual cosa estudis bioinformàtics poden dirigir l’estudi d’aquestes interaccions.

AplicacionesProteoma de microorganismes

Els estudis de l’proteoma total dels microorganismes patògens són molt valuosos pel que fa a la informació que s’obté de l’expressió proteica en una condició determinada. En altres estudis és més interessant obtenir informació de determinats subproteomas, com les proteïnes exposades a la membrana, o conèixer quines proteïnes desencadenen la resposta immune en l’hoste. Cal destacar el paper de les PTM en la interacció entre el patogen i l’hoste, per la qual cosa s’hauria de tenir en compte el seu estudi en microorganismes patògens.

Proteïnes de membrana, de superfície i secretades

El subproteoma de membrana constitueix un conjunt de proteïnes relacionades amb la infecció. Existeixen tècniques per a la detecció de les proteïnes exposades a la superfície cel·lular (surfoma), com són el marcatge específic mitjançant fluoròfors al 2D-DIGE i l’afaitat cel·lular. La tècnica de l’afaitat mòbil s’ha utilitzat satisfactòriament en diversos patògens humans grampositius com en Streptococcus59 o en Staphylococcus aureus60, tot i que encara no es coneix amb certesa la seva aplicabilitat en bacteris gramnegatius.Aquests bacteris posseeixen una embolicada cel·lular menys rígida i menys resistent que les grampositius, de manera que el “afaitat” compromet la integritat de la membrana i provoca la lisi cel·lular. Com a alternativa a aquestes tècniques s’han millorat els protocols d’extracció de proteïnes de membrana existents a través de diferents detergents o aïllament de membranas61, com és el cas de la utilització de l’tampó carbonat per a l’eliminació de proteïnes solubles contaminants en les mostres.

les proteïnes secretades constitueixen un important subproteoma i poden desencadenar la lisi de les cèl·lules hostes mitjançant toxines, que poden influir en l’adhesió, colonització i invasió, així com la desviació de la resposta immune de l’hospedador62-66. Aquest important grup de proteïnes es perd durant el processament dels bacteris intactas67,68. Les proteïnes de les vesícules de membrana externa (OMV) constitueixen un subproteoma molt important en els patògens, ja que desencadenen reaccions inmunogénicas potents a l’ésser alliberades pel microorganisme a el medi extracel·lular. Les vesícules produïdes per Neisseria meningitidis han estat utilitzades pel seu efecte inmunoprotector front a aquest patógeno69,70.

Biopel·lícules

Les biopel·lícules estan formades per una biocapa robusta de microorganismes i matriu extracel·lular. Aquesta estructura permet a les cèl·lules que la componen la unió a superfícies artificials o biòtiques, dificultant l’eliminació dels microorganismes que la componen71. Les biopel·lícules bacterianes representen una antiga estratègia de supervivència procariota. Donlan72 va definir la biopel·lícula com una comunitat microbiana sèssil, caracteritzada per cèl·lules que estan adherides irreversiblement a un substrat o interfase, o unes amb les altres, embegudes en una matriu de substàncies polimèriques extracel·lulars que elles han produït exhibint un fenotip alterat en relació amb la taxa de creixement i transcripció gènica. La biopel·lícula proporciona als bacteris embegudes en ella avantatges significants davant fluctuacions mediambientals d’humitat, temperatura i pH i reserva de nutrientes73. Per aquest motiu es van estudiar les diferències en l’abundància de proteïnes entre les cèl·lules crescudes en biopel·lícula i cèl·lules plantónicas mitjançant la tècnica 2de amb tinció de plata en Candida albicans. Com a resultat d’aquesta comparació, es va observar que les cèl·lules crescudes en biopel·lícula presentaven una menor capacitat antioxidativa a més de presentar la proteïna Pil1p, proteïna sensible a el tractament amb un tipus determinat de antifúngicos74. Aquest resultat va permetre trobar una diana i un tractament eficaços contra l’estat més resistent d’aquestes llevats.

Identificació de microorganismes i sensibilitat a antimicrobians

La identificació dels microorganismes causants d’infecció cal que s’aconsegueixi en el mínim temps possible. Per això, un camp ampli d’investigació és la recerca de tècniques d’identificació alternatives a les fenotípiques / metabòliques, que requereixen, a més de l’aïllament de l’microorganisme, entre 18-24h més per a la identificació d’aquest. Una opció per a la identificació ràpida de microorganismes és l’optimització de la MS. En la revisió de Jordana-Lluch et al.75 s’explica detalladament l’ús d’aquesta tècnica i els avenços obtinguts fins al moment.

L’aplicació de la MS en la identificació de microorganismes requereix únicament d’l’aïllament i una mitjana de 5min; però, en aquest procés no s’obtenen dades sobre la sensibilitat a antimicrobians. Per obtenir aquesta informació és necessària la realització de proves de sensibilitat de l’microorganisme, però aquestes proves requereixen d’un temps afegit. S’han realitzat estudis utilitzant la MS per detectar la presència de betalactamases, diferenciar entre S.aureus sensibles i resistents a meticil·lina, i fins i tot detectar factors de patogenicidad76-79.

Recerca de biomarcadors en fluids corporals

Els biomarcadors faciliten el desenvolupament d’eines específiques de diagnòstic, monitoritzant la resposta a la teràpia o el progrés de la enfermedad80. Quan analitzem mostres biològiques (de procedència humana o animal model), la dificultat rau en la creació de grups homogenis per assegurar una bona correlació de resultats. Per això és imprescindible l’estandardització de la classificació de les mostres.

La comparativa de fluids entre pacients i controls pot permetre la identificació de proteïnes diferencials. Aquestes proteïnes poden ser utilitzades posteriorment com a mètode de diagnòstic ràpid. Un estudi d’aquest tipus es va dur a terme amb el virus de l’Hepatitis E (HEV), en què el plasma i l’orina de pacients infectats van ser analitzats mitjançant 2D-DIGE front mostres control. Es va demostrar que més de 30 proteïnes s’expressaven de manera diferencial en pacients amb HEV aguda pel que fa als controles81.Aquests resultats demostren la potencialitat de la proteòmica en la recerca de biomarcadors.

Les proteïnes diferencials obtingudes en la comparació entre pacients amb diferents graus de la malaltia podrien ser utilitzades per determinar el pronòstic de l’pacient.

Inmunoma

La inmunoproteómica és una eina potencialment útil en el camp de recerca de biomarcadors per a malalties infeccioses, especialment en situacions on el patogen és difícil de conrear in vitro82-85. La tecnologia SELDI ha estat aplicada molt recentment en la identificació de biomarcadors per discernir ceps de Helicobacter pylori associades a diferents estats de la enfermedad86. D’aquesta manera s’identifiquen “signatures” d’anticossos en suero83,84.

La identificació i caracterització de proteïnes antigèniques és un requeriment per al desenvolupament de vacunes, ja que posseeixen un gran interès com a alternativa terapèutica a el tractament. Per a la investigació de la inmunorreactividad dels anticossos humans o anticossos de models animals enfront de les proteïnes microbianes, la combinació de 2de i inmunoblotting representa el mètode d’elecció. Extractes proteics totals de l’microorganisme patogènic són separats per 2de i les proteïnes immunoreactives són detectades mitjançant 2D inmunoblots amb sèrum de pacients infectats, en comparació amb el patró obtingut amb sèrums control87. Les proteïnes que generen senyal diferencial entre els dos grups són identificades per empremta peptídica.

L’expressió proteica varia segons l’estat i condició de creixement dels microorganismes. Per aquesta raó és aconsellable realitzar els inmunoblottings amb extracte proteic de l’microorganisme crescut in vivo, per evitar les variacions transcripcionals, traduccionals i postraduccionals trobades entre els cultius in vitro vs in vivo.

La inmunoproteómica és útil per aportar propostes generals de diagnòstic o per a la selecció de biomarcadores83. A més, aquesta metodologia pot ser fàcilment aplicada a múltiples infeccions humanes i de veterinària de gran importància per la seva incidència i severidad88-96.

Vacunes i fàrmacs

La selecció de dianes per a fàrmacs i / o vacunes és essencial per a la obtenció d’un resultat òptim en el control i / o tractament d’una malaltia infecciosa. Els criteris a tenir en compte per seleccionar una diana són: a) que aquesta sigui essencial per a la infectivitat i proliferació de l’patogen en l’hoste; b) que tingui una baixa redundància en les vies de l’patogen, encara que tingui elevada redundància en les vies de l’hoste, sempre que es puguin mitigar els efectes tòxics; c) que estigui àmplia i consistentment expressada en els teixits d’infecció i en els diferents pacients de la població, i d) que sigui terapèuticament tractable utilitzant petites molècules com ara siRNA, anticossos o altres modalitats farmacèutiques.

La vacunologia inversa és una tècnica utilitzada en la recerca de noves dianes. Aquesta aproximació permet un cribratge a favor de les proteïnes amb potencial immunogènic. Les dades obtingudes de l’proteoma durant la infecció poden ser explotats com a base per al desenvolupament de noves quimioteràpies antimicrobianes i vacunes. Una baixa proporció d’aquestes proteïnes pot ser utilitzada com a diana per quimioteràpia antimicrobiana97 o com antigen per a vacunes protectoras98. Alguns patògens en els quals s’ha realitzat l’estudi de l’inmunoma són: Chlamydia pneumoniae, Haemophilus influenza, Neisseria meningitidis, Helicobacter pylori, Bacillus anthracis, Streptococcus agalactiae, Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium bovis98-111.

Conclusió

La proteòmica és una eina veritablement útil en l’estudi de les malalties infeccioses, proporcionant una visió global. Les anàlisis proteòmiques permeten la realització d’un estudi bàsic de la malaltia, facilitant la recerca de marcadors d’infecció o virulència. Posteriorment, els resultats obtinguts tenen una aplicabilitat translacional adreçada a el diagnòstic i pronòstic de la malaltia, a més de permetre el desenvolupament de noves teràpies antimicrobianes i l’avanç en vaccinologia.

Les tècniques proteòmiques no només permeten la identificació de nous marcadors, sinó que poden ser implantades com tècniques de diagnòstic ràpid, podent dirigir el tractament amb major celeritat evitant els cultius in vitro, que requereixen llargs temps d’incubació, retardant el diagnòstic, a més de generar falsos negatius en aquells microorganismes viables però no cultivables.

Aquesta revisió mostra com la proteòmica és una eina potent en recerca. A dia d’avui, molts experts consideren les tècniques en proteòmica útils en el descobriment de proteïnes d’interès clínic, com biomarcadors, però la seva aplicabilitat assistencial és baixa.El resultat obtingut en els treballs de recerca basats en proteòmica és adaptat a tècniques convencionals com l’ELISA, però aquestes no es mantenen com a eines en diagnòstic. Aquesta revisió pretén mostrar als experts de l’àmbit clínic noves tècniques disponibles per a resoldre les dificultats que es presenten dia rere dia.

Actualment, la proteòmica és una àrea valorada per la seva clara utilitat, tot i que encara hi ha molta feina que realitzar en àmbits com les malalties infeccioses. Per millorar la seva utilitat en el futur, hem de conscienciar a tot el personal implicat en l’àmbit assistencial de la seva importància, així com integrar els resultats dels estudis de totes les “òmiques”. Aquest últim aspecte és de gran importància, ja que, per exemple, el coneixement de l’genoma d’un microorganisme és de vital importància per a la interpretació dels resultats proteòmics.

Un altre aspecte limitant en la microbiologia clínica és l’aïllament de l’microorganisme per a la seva posterior identificació. Eliminant aquest pas, tant la genòmica com la proteòmica millorarien la seva aplicabilitat en la identificació de l’agent patogen en una infecció. Per això, aquestes millores farien possible l’acceptació de les tècniques proteòmiques en l’àmbit assistencial per a la detecció i diagnòstic en malalties infeccioses, reduint temps i costos.

Conflicte d’interessos

Els autors declaren no tenir cap conflicte d’interessos .