Assignatures
- Splicing alternatiu
- Cèl·lules mare pluripotents induïdes
- Cèl·lules mare neurals
- Neurologia
- Patogenesia
Resum
Les mutacions que causen esclerosi lateral amiotròfica (ELA) impliquen en gran mesura als reguladors de l’processament d’ARN expressats en forma ubiqua. Per comprendre l’impacte molecular de les mutacions causants d’ELA en el desenvolupament neuronal i la malaltia, analitzem els transcriptomes durant la diferenciació in vitro de les neurones motores (MN) de l’control humà i les cèl·lules mare pluripotents induïdes mutants VCP específiques de l’pacient (iPSC ). Identifiquem una major retenció d’introns (IR) com una característica dominant d’el programa d’entroncament durant la diferenciació neural primerenca. És important destacar que l’IR es produeix prematurament en cultius mutants de VCP en comparació dels seus homòlegs de control. Aquests esdeveniments d’IR aberrants també es veuen en conjunts de dades de RNAseq independents de MN mutants SOD1 i FUS. L’IR més significatiu es veu en la transcripció de SFPQ. La proteïna SFPQ s’uneix àmpliament al seu intró retingut, exhibeix una menor abundància nuclear en cultius mutants de VCP i es perd dels nuclis de MN en models de ratolí i ALS esporàdica humana. En conjunt, vam demostrar SFPQ IR i la pèrdua nuclear com distintius moleculars d’ALS familiar i esporàdica.
Introducció
L’esclerosi lateral amiotròfica (ELA) és una afecció ràpidament progressiva i incurable relacionada amb l’edat, que condueix a la degeneració selectiva de les neurones motores (MN). Les mutacions causants d’ALS impliquen reguladors crucials de l’processament d’ARN, normalment expressats al llarg de el desenvolupament, en la patogènesi subjacent. Això planteja la possibilitat que els canvis postranscripcionals que es produeixen en les primeres etapes de la vida, inclòs el desenvolupament neurològic, puguin exercir un paper fonamental en la patogènesi molecular subjacent de l’ELA. Comprendre l’impacte de les mutacions causants d’ALS en el desenvolupament neurològic i la malaltia ens permetrà dilucidar els esdeveniments moleculars d’inici. Això, al seu torn, pot guiar el desenvolupament de noves teràpies dirigides als mecanismes primaris abans que la malaltia progressi massa.
Tant el desenvolupament com l’homeòstasi de les neurones es basen fonamentalment en la implementació precisa d’el processament d’ARN alternatiu de tipus cel·lular i per etapa, inclòs l’entroncament alternatiu (AS) i la poliadenilació alternativa (APA) 1, 2, 3. S’han establert diversos mecanismes d’AS, que inclouen omissió de exó, exons mútuament excloents i retenció d’introns (IR). L’ús alternatiu de l’exó es caracteritza particularment en les neurones per regular la diversitat de proteïnes i la funció abril. Els tipus de cèl·lules neuronals mostren una major proporció d’introns retinguts en comparació amb altres teixits i existeix un cos d’evidència en expansió que demostra un paper funcional per l’IR en el desenvolupament neuronal i la homeòstasi 5, 6, 7, 8. S’ha demostrat que l’augment de IR durant la diferenciació neuronal regula a la baixa l’expressió de transcripcions que són innecessàries per a la fisiologia neuronal madura juliol. Un estudi recent va mostrar evidència de processament postranscripcional de transcripcions que retenen introns en resposta a l’activitat neuronal 8.
APA és una manera alternativa de processament d’ARN que genera diferents extrems 3 ‘més freqüentment a la regió 3’ no traduïda (3 ‘UTR) de l’ARNm, engendrant isoformes de longitud variable de 3’ UTR. Les 3 ‘UTR serveixen com una plataforma clau en la xarxa reguladora d’ARN que controla l’eficiència, la localització i l’estabilitat de traducció de l’ARNm 9, 10. Les UTR 3 ‘alberguen una extensa variabilitat de la longitud específica de el teixit que afecta significativament la seva funció 11. De tots els tipus de cèl·lules humanes, les isoformes específiques de el cervell tenen les UTR de 3 ‘més llargues 12, 13. A més, les mutacions que pertorben l’estructura secundària de l’ARNm i els llocs d’interaccions ARNm-miARN poden portar a la neurodegeneració 14. Tot i aquestes troballes, les funcions de la regulació IR i 3 ‘UTR en el context de el desenvolupament de MN i l’homeòstasi han romàs poc estudiades en comparació amb altres formes d’EA.
AS i APA estan coordinats per l’acció individual o de combinacions de proteïnes d’unió a ARN (RBPs) que actuen en trans que s’uneixen a llocs específics dins (pre) mRNA 15, 16. Les RBP intervenen l’entroncament de mRNA, l’exportació nuclear i la localització.L’acumulació d’evidències implica els PRR com a reguladors clau tant de el desenvolupament neurològic com de les formes específiques de neurodegeneració. De fet, les mutacions en diverses RBP, inclosa la proteïna d’unió a l’ADN de resposta Transactiva, 43 kDa (TDP-43), fusionada en sarcoma (FUS) i el factor associat a la proteïna d’unió a caixa TATA 15 (TAF15) s’han vinculat causalment a la forma familiar d’ELA el que porta a defectes de processament d’ARN en models de ratolí 17, 18.
la nostra hipòtesi és que l’entroncament aberrant i l’APA exerceixen papers importants tant en el desenvolupament com en la malaltia de el sistema nerviós. En aquest context, intentem comprendre com les diferents maneres d’AS i APA apareixen a la neurogènesi motora humana i examinar sistemàticament l’impacte de les mutacions causants d’ELA en la remodelació postranscripcional durant la restricció de l’llinatge. A l’combinar la diferenciació dirigida de cèl·lules mare pluripotents induïdes per l’home (iPSC) amb la seqüenciació d’ARN resolta en el temps, primer identifiquem el programa seqüencial de remodelació postranscripcional subjacent a la neurogènesi motora humana. Recentment, vam identificar fenotips cel·lulars clars d’ELA mitjançant l’ús de iPSCs derivades de pacients relacionades amb valosina (VCP) 19. Aquesta plataforma ens va permetre comparar VCP mutant (VCP mu) per controlar els cultius durant la diferenciació de MN i identificar la desregulació d’entroncament dependent de mutació en una etapa específica de el desenvolupament. Identifiquem el factor d’acoblament prolina i ric en glutamina (SFPQ) com la transcripció de retenció d’introns més significativa entre les diverses mutacions causants d’ALS (VCP, SOD1 i FUS). Mostrem que la proteïna SFPQ s’uneix àmpliament al seu intró retingut, que exhibeix alta abundància citoplasmàtica en VCP mu en comparació amb els controls. Fonamentalment, la proteïna és menys abundant en els nuclis dels cultius de VCP mu i finalment es perd dels nuclis de MN en models de ratolins (models de ratolins transgènics SOD1 mu i VCP mu) i mostres post-mortem esporàdiques humanes d’ALS. En resum, el nostre estudi implica SFPQ IR i la pèrdua nuclear com distintius moleculars generals de l’ELA familiar i esporàdica.
L’IR és la manera d’entroncament predominant en la neurogènesi motora.
per examinar els canvis postranscripcionals durant la neurogènesi motora humana, analitzem les dades de seqüenciació d’ARN d’alt rendiment (ARN-seq) per l’ARN poliadenilado aïllat de cèl·lules mare pluripotents induïdes (iPSCs; dia 0), precursors neurals (NPC; dia 7 ), MN precursors “amb patró” (medul·la espinal ventral; PMNs; dia 14), MN postmitòtics però electrofisiològicament immadurs (MN; dia 21), i MN electrofisiològicament madurs (mMNs; dia 35) derivats de dos pacients amb ALS Mutació de el gen VCP i dos controls sans (fig. 1a; 31 mostres de 5 punts temporals i 3 genotips, 2 clons de 2 controls sans i 3 clons de 2 pacients amb ELA amb mutacions de VCP: R155C i R191Q). Les mostres cel·lulars de cada etapa de diferenciació de MN es van caracteritzar com es va informar anteriorment. Aquí, vam realitzar una extensa caracterització addicional per confirmar els cultius MN altament enriquits (> 90%; Fig. 1a complementària). És important destacar que l’eficiència de diferenciació de MN va ser similar entre el control i els cultius mutants de VCP (fig. 1 b, c). Usant un conjunt de 19 marcadors genètics clau de la maduració de la MN espinal i el desenvolupament embrionari, confirmem més una troballa previ que les NMM derivades de iPSC s’assemblen a les MN 20 fetals en lloc de a les adultes (Fig. 2a, b suplementària). Agrupació jeràrquica no supervisada (correlació de rang de Spearman i agrupació completa) de les 31 mostres utilitzant 15, 989 mostres segregades de gens expressats de forma fiable en funció de la seva etapa de desenvolupament dins de l’llinatge MN en lloc de pel fons genètic mutant o de control (Fig. 1b).
la retenció d’introns és el canvi d’entroncament predominant durant la neurogènesi motora primerenca i es produeix prematurament en els cultius de mu de VCP. un esquema que representa l’estratègia de diferenciació iPSC per a la neurogènesi motora. Les fletxes indiquen punts de temps de mostreig en dies. Els clons iPSC es van obtenir de dos pacients amb mutacions confirmades de VCP (R155C i R191Q, un total de 3 línies iPSC, 1 inducció de cada línia) i 1 clon de cada un dels 2 controls sans (un total de 2 línies iPSC diferents , 2 induccions d’una línia i 1 Inducció des de l’altra línia).Cèl·lules mare pluripotents induïdes (iPSC); precursors neurals (NPC); Neurones motores precursores “modelades” (medul·la espinal ventral; PMN); neurones motores postmitòtiques però electrofisiològicament immadures (MN); MN electrofisiològicament madures (MMN). b L’agrupació jeràrquica no supervisada de 15, 989 gens agrupa les 31 mostres d’acord amb l’etapa de desenvolupament neuronal, en lloc dels antecedents genètics. Cercles grisos = mostres de control; cercles de magenta = VCP mu mostres; Els punts de temps de mostreig s’indiquen dins dels cercles. c Gràfics circulars que representen proporcions d’esdeveniments d’entroncament a les mostres de control i VCP mu en diferents etapes de la neurogènesi motora en comparació amb el punt temporal anterior. Les àrees de l’gràfic són proporcionals a el nombre total d’esdeveniments en cada etapa. Retenció d’introns (IR); exó alternatiu (Altex); microexones (MIC); Alternativa 5 ‘i 3’ UTR (Alt5 i alt3). d, f Gràfics de barres que representen el nombre d’esdeveniments d’entroncament exónico i intrónico, respectivament, en control (barres grises) i VCP mu samples (barres magenta) en punts de temps específics durant la diferenciació de MN. e, g Gràfics de barres que mostren la puntuació d’enriquiment de les vies biològiques GO associades amb les transcripcions que experimenten esdeveniments d’entroncament exónico i intrónico en mostres de control. h A la part superior, les gràfiques de caixa representen les distribucions de percentatge de retenció (veure Mètodes) per 167 introns curats manualment en rèpliques en diferents etapes de diferenciació en les mostres de control (esquerra) i VCP mu (dreta). Els diagrames de caixa mostren el resum de cinc números de la mitjana, els quartils inferior i superior, els valors mínim i màxim. Més avall, mapes de calor d’el percentatge relatiu estandarditzat d’IR en 167 introns en mostres repetides en cada etapa de diferenciació. i Com en h, però per a la diferenciació in vitro de hESCs a l’etapa d’inducció neural (1 setmana), NPC (4-10 setmanes) que produeix només neurones després d’una diferenciació addicional i després de > 15 setmanes, una etapa més gliogénica que produeix les dues neurones i cèl·lules glials 22
Imatge de mida completa
A continuació examinem la dinàmica temporal de AS durant la diferenciació de MN . Usant el VAS-EINES 21 de la canonada de RNA-seq, identifiquem 1599 i 1507 esdeveniments AS al llarg de el temps en les mostres de control i VCP mu, respectivament (fig. 2c, d). D’acord amb estudis anteriors, > 60% dels esdeveniments de AS en etapes posteriors de la diferenciació de l’terminal MN van ser exon alternatius (inclusió i exclusió d’exons en casset) i esdeveniments d’omissió de intró (fig. 2c, d). Trobem que les mostres de control i VCP mu exhibeixen un augment progressiu similar a la inclusió de l’exó en cassette al llarg de el temps (Fig. 1c, d) en gens enriquits per a l’organització de components cel·lulars i les funcions de ononología de gens de axonogénesis (GO) (fig. 1e).
en contrast, l’IR va representar > 65% dels esdeveniments AS en la fase anterior de restricció de llinatge de NPC a PMN (Fig. 1c). L’expressió dels transcrits de retenció d’intró va augmentar en la transició de NPC a PMN (és a dir, patró neural) en mostres de control (fig. 1f). Curiosament, les mostres de VCP mu van mostrar un augment sorprenent en l’expressió dels transcrits que retenen l’intró en la transició de desenvolupament anterior de les iPSC a les NPC (és a dir, inducció neural; Fig. 1f). Trobem que el 53% dels esdeveniments d’IR van començar amb el patró en les mostres de control (NPC a PMN); en contrast, el 72% dels esdeveniments d’IR en les cultures mu de VCP van començar amb la inducció neural (iPSC a NPC; Fig. 2e complementària, dreta). És important destacar que el 60% de tots els esdeveniments d’IR van involucrar introns i transcripcions idèntics entre l’VCP mu i les mostres de control (fig. 2e complementària, a dalt a l’esquerra), que involucren en gran mesura gens relacionats amb el processament i entroncament de l’ARN (fig. 1 g). Els esdeveniments restants van ser exclusius de les cultures VCP mu o es van produir en un punt de temps diferent. Això indica que les mostres de VCP mu mostren una activitat IR similar a l’observada en les contraparts de control durant la diferenciació, però en una etapa prematura.
Després, curem manualment cada esdeveniment d’IR identificat automàticament a la petita llista 167 amb alta confiança. Es va assignar un valor de retenció per a cada esdeveniment d’IR relatiu a l’expressió dels exons flanquejants (veure Mètodes). És immediatament evident a partir de la Fig. 1h que els 167 introns es retenen sistemàticament més en VCP mu en l’etapa NPC en comparació amb les mostres de control de qualsevol etapa.
Com validació inicial, avaluem si els 167 introns també es retenen en dos conjunts de dades transcriptòmiques independents de cèl·lules mare embrionàries humanes 22, 23. L’examen del seu nivell general de retenció va confirmar que la IR durant la neurogènesi primerenca és un fenomen generalitzable en diversos models experimentals (Fig. 1i i Fig. 2f suplementària). A continuació, examinem si els introns retinguts presentaven característiques estructurals característiques que poguessin distingir-los dels introns empalmats convencionalment i trobem que el conjunt altament segur de 167 introns retinguts és més llarg i més conservat que els introns no retinguts de el mateix conjunt de gens (Fig. 2g complementària).
el VCP exerceix un paper en la progressió de l’cicle cel·lular i un percentatge major d’IR pot resultar d’l’enllaç establert entre l’eficiència de l’entroncament i el cicle cel·lular 24. Per tant, examinem si l’acceleració aparent en els programes d’AS al VCP mu s’explica per un augment dependent de la mutació en l’activitat de l’cicle cel·lular. Fem servir la citometria de flux en iPSCs, NPCs i PMNs tractats amb l’agent fluorescent intercalat i l’agent estequiomètric iodur de propidi per examinar el contingut d’ADN. Aquests experiments efectivament van excloure les diferències en el cicle cel·lular entre VCP mu i les mostres de control (fig. 2 h-j suplementària). Així, col·lectivament, aquestes troballes demostren que l’IR és el canvi d’entroncament predominant que afecta les etapes primerenques de la restricció de l’llinatge neural. És important destacar que l’IR es produeix tant a nivells elevats com prematurament en els cultius de VCP mu en l’etapa NPC, el que no pot explicar-se per les diferències en l’activitat de l’cicle cel·lular.
IR aberrant en els MN que porten diverses mutacions causants d’aLS
El distintiu patològic en > 97% de tots els casos d’ELA (esporàdics i familiars) és la deslocalització nuclear- citoplasmàtica de TDP-43 25, 26. No obstant això, l’absència d’una mala localització de TDP-43 en el 3% dels casos sosté que encara queden per descobrir mecanismes patògens comuns. Per abordar això, a continuació, examinem l’impacte de les mutacions causants de SOD1 i FUS ALS que, de manera característica, no exhibeixen un senyal d’ubicació errònia de TDP-43. Analitzem conjunts de dades transcriptòmiques per SOD1 mutant (SOD1 mu) (n = 5, 2 SOD1 A4V derivades de pacients i 3 mostres de MN purificades amb FACS de control isogénico, on es va corregir la mutació) 27 i mostres de FUS (FUS mu) (n = 6, 3 FUS R521G derivats de l’pacient i 3 controls MN no afectats) 28. Confirmem que l’IR és la manera predominant d’entroncament a MN derivat d’ambdós mutants (fig. 3a complementària), el que suggereix un fenomen molecular unificador a través de diversos antecedents genètics d’ALS (VCP, SOD1 i FUS). És important destacar que el nostre conjunt d’alta confiança de 167 esdeveniments IR que ocorren prematurament durant la diferenciació de VCP mu MN també es veuen afectats generalment en FUS mu i SOD1 mu MN (fig. 2a); específicament, els esdeveniments 74 i 59 IR mostren un augment estadísticament significatiu en SOD1 mu i FUS mu MN, respectivament, en comparació amb els controls (valor de p < 0, 01; prova de recompte de Fisher; Fig. 3b complementària). L’extensió de l’entroncament per a aquests introns retinguts significativament tant en SOD1 mu com a FUS mu es mostra en un mapa de calor a la Fig. 2b. Aquests formen una xarxa de proteïnes enriquides en l’entroncament i la traducció de l’ARN (fig. 2c, d). Això demostra que els esdeveniments d’IR identificats en el nostre model d’ALS també s’inclouen en MN que porten altres mutacions causants d’ALS que no mostren una mala localització de l’TDP-43. De manera acumulativa, aquestes troballes confirmen la possibilitat de generalització d’un ANAR aberrant en diferents formes genètiques d’ALS.
les transcripcions involucrades en la inducció neural mostren una retenció generalitzada d’introns en els MN derivats de les mutacions causants d’aLS FUS i SOD1. a Gràfiques de caixa que mostren la distribució de l’percentatge de retenció per 167 introns curats manualment en les MN de control (caixa blanca), les MN mutants mu FUS (caixa gris) o les mostres SOD1 mu MN (barra blava) 28, 50. Les mostres mutants exhibeixen sistemàticament una major proporció d’IR en comparació amb els controls. Els diagrames de caixa es mostren a la Fig. 1h. b Mapa de calor agrupat jeràrquicament (distància de Manhattan i agrupament de Ward) de nivells relatius d’IR en 40 gens que mostren una retenció estadísticament significativa durant la neurogènesi motora tant en SOD1 mu com a FUS mu MN.Cercles blaus = mostres SOD1 mu, cercles grisos = mostres FUS mu i cercles buits = mostres de control. c Xarxa d’interaccions proteïna-proteïna per gens que exhibeixen ANAR durant la neurogènesi motora en SOD1 mu o FUS mu MN. Les vores representen interaccions proteïna-proteïna determinades experimentalment anotades a la base de dades STRING 51. Els nodes indiquen proteïnes, acolorides d’acord amb les condicions en què la transcripció corresponent mostra IR; les mides dels cercles són proporcionals a el nombre de vores a la xarxa. d Gràfics de barres que mostren les puntuacions d’enriquiment (valor P de la prova de comptatge de Fisher) de les vies biològiques GO associades amb els gens que mostren ANAR durant la neurogènesi motora en SOD1 mu i / o FUS mu MN en comparació amb els controls
Imatge de mida completa
Remodelació de UTR transitòria 3 ‘a neurogènesi primerenca
l’entroncament i la regulació de la poliadenilació solen estar interconnectats. Per examinar si la longitud de 3 ‘UTR varia al llarg de la diferenciació i com el mu de VCP afecta aquest procés, primer vam estendre el catàleg actual de l’anotació Ensembl 3’ UTR utilitzant les nostres dades de RNA-seq (veure mètodes); Per a cada gen, analitzem les seves longituds màximes expressades en el curs de la diferenciació. Tant en el control com en les mostres de VCP mu, les longituds mitjana de 3 ‘UTR per 12, 364 gens expressats contínuament augmenten durant el curs de el temps de diferenciació. No obstant això, de manera excepcional, les UTR 3 ‘a les mostres de control s’escurcen temporalment durant l’etapa NPC (valor de p < 0, 01; prova de Wilcoxon; Fig. 3a ). Com s’espera un allargament de 3 ‘UTR en el desenvolupament embrionari, l’escurçament observat en l’etapa NPC (en comparació amb iPSC) és sorprenent.
Variació de la longitud de 3 ‘UTR durant la neurogènesi motora humana. a Diagrames de caixa de les distribucions de longituds UTR màximes de 3 ‘expressades en diferents etapes de la diferenciació de MN en les mostres de control (esquerra) i VCP mu (dreta). Valor p obtingut amb la prova de Wilcoxon. b Gràfics de barres que mostren els nombres de 3 ‘UTR amb canvis estadísticament significatius entre el promotor distal (esquerra) i el promotor proximal (dreta) en diferents etapes de diferenciació en comparació amb iPSCs en control (barres grises) i VCP mu mostres ( barres magenta). Inserció, gràfics circulars que representen les proporcions de gens que exhibeixen l’ús de UTR a 3 ‘alternatiu a les mostres de control i VCP mu (blanc), només les mostres de control (àrea gris) o només les mostres VCP mu (àrea magenta ). c Anàlisi d’enriquiment d’GO de rutes biològiques associades amb gens que mostren canvis distals estadísticament significatius en l’ús de el lloc poli (A) en MMN de control en comparació amb les iPSC de control. d, i Esquerra, les vistes de el navegador d’el genoma dels perfils de RNA-seq a les 3 ‘UTR dels gens GNL1 i TARDBP que mostren canvis estadísticament significatius de proximal a distal en l’ús de el lloc poli (A) en MMN en comparació amb iPSCs. A la dreta, gràfics de barres que mostren l’ús distal de la UTR de 3 ‘en relació amb la UTR proximal de 3’. P- valors obtinguts amb la prova de comptatge de Fisher. f Igual que c per als gens que mostren canvis proximals estadísticament significatius en l’ús de el lloc poli (A) en els NPC de control en comparació amb els iPSC de control. g, h Igual que d per els gens ZNF254 i DARS que mostren canvis distals a proximals estadísticament significatius en l’ús de el lloc poli (A) en els NPC en comparació amb els iPSC
Imatge de mida completa
Per investigar més a fons la dinàmica de l’processament UTR a 3 ‘, analitzem els llocs de poli (a) en tàndem que estaven ubicats en el mateix exó terminal. Utilitzant el nombre de lectures assignades a l’terminal de 300 nt de l’segment de cada 3 ‘UTR com a proxy per al nivell d’expressió de isoforma, quantifiquem l’ús de el lloc poli (A) alternatiu en diferents etapes de desenvolupament en comparació amb les iPSC. 822 gens mostren canvis UTR 3 ‘estadísticament significatius en el control i / o VCP mu (fig. 3b). En 171 gens, hi ha un major ús de el lloc poli (A) distal tant en el control com en els mu MMN de VCP (fig. 3b), d’acord amb un estudi previ 29; aquests gens estan enriquits en termes GO relacionats amb l’entroncament d’ARNm (fig. 3c). En l’etapa MN < 10, els gens mostren un ús diferencial significatiu de 3 ‘UTR quan es comparen directament els cultius de control i VCP mu, el que confirma una regulació de longitud de 3 ‘UTR similar a la diferenciació terminal entre control i VCP mu (fig. 4a suplementària).És de destacar que, en diversos casos, les mostres de VCP mu van mostrar un significatiu canvi distal de promotor en una etapa comparativament més primerenca per controlar les mostres. Aquests exemples inclouen GNL1 (fig. 3d) i TARDBP (fig. 3e); aquest últim també mostra una acumulació de isoforma UTR 3 ‘llarga en SOD1 mu MN en comparació amb els controls, però no en FUS mu (fig. 4c, d). Cap d’aquestes variacions en UTR a 3 ‘va conduir a canvis mesurables en l’expressió de gens o proteïnes (Fig. 4e, f, g complementària).
Dels 822 gens, 169 exhibeixen un canvi proximal a promotor estadísticament significatiu específicament en els NPC de control en comparació amb els iPSC (fig. 3b). Diverses rutes biològiques, com la transcripció i la regulació de la neurotrofina, estan representades entre les transcripcions que mostren un escurçament UTR transitori de 3 ‘(fig. 3f). Aproximadament el 80% d’aquests esdeveniments estan absents en VCP mu (fig. 3b, g, h); això es confirma encara més quan les mostres de VCP mu i control es comparen directament en l’etapa NPC (fig. 4a, b). Aquestes dades demostren que els pics de variació de longitud 3 ‘UTR extensos abans d’IR i caracteritzen la transició de iPSC a NPC. És important destacar que les mostres de VCP mu no mostren cap procés semblant aparent.
La regulació a la baixa de l’factor d’entroncament coincideix amb un ANAR aberrant
Després d’haver identificat les principals diferències d’entroncament en les mostres d’ELA en comparació amb el control, a continuació es va tractar de comprendre si el fons genètic de l’ELA condueix a diferències transcripcionals mesurables durant la neurogènesi motora. Específicament, investiguem els canvis d’expressió que no s’identifiquen de manera òptima mitjançant l’agrupació jeràrquica (fig. 1b), que sovint està dominada per un sol programa de transcripció. Apliquem la descomposició de valor singular (SVD) a tota la matriu d’expressió (15, 989 gens en 31 mostres; Fig. 1a) per identificar els principals programes transcripcionals i els processos biològics associats subjacents a la neurogènesi motora 30. Usant aquest mètode, trobem que (1) la neurogènesi progressiva, (2) la inducció neural i el patró transitoris, i (3) la diferenciació terminal amb alguna contribució a la inducció neural componen els principals programes d’expressió cel·lular ortogonal que operen al llarg de el curs de el temps de desenvolupament; aquests tres primers components capturen el 69% de la variància en l’expressió gènica (Fig. 4a – c, fig. 5a complementària). L’anàlisi d’enriquiment funcional de GO dels grups de gens que es van associar positivament o negativament amb aquests components (fig. 4d-f) confirma encara més l’associació biològica de cada component principal. És important destacar que les mostres de control i VCP mu es comporten de manera similar en aquests primers tres components. Una anàlisi lineal multivariada va confirmar que el temps en el cultiu en lloc de la mutació VCP és la variable que explica els components 1, 2 i 3 (Fig. 5b complementària).
la regulació a la baixa global de components d’entroncament coincideix amb IR. a – c Anàlisi de descomposició de valor singular de l’expressió de 15, 989 gens en n = 31 mostres. A l’esquerra, els gràfics de línies mostren els perfils d’expressió dels tres primers vectors singulars \ (\ overrightarrow v _1 \) a través de \ (\ overrightarrow v _3 \), capturant el 47%, 15% i 7% de la variància en l’expressió gènica, respectivament. Els punts de dades de color gris i magenta indiquen l’expressió per a les mostres de control i VCP mu. A la dreta, el mapa de calor de l’expressió estandarditzada de gens els perfils d’expressió es correlacionen positivament (indicat pels tres rectangles més foscos) i negatiu (indicat pels tres rectangles més clars) amb els primers tres vectors singulars de la dreta. Els gràfics de barres de d – f mostren les puntuacions d’enriquiment per a les funcions biològiques de GO dels gens que es correlacionen positivament (tres barres superiors) o negativament (tres barres inferiors) amb els tres primers vectors singulars de la dreta. g Diagrames de barres a la part superior, que representen el nombre de gens regulats a la baixa en mostres de mu de VCP en comparació amb el control en diferents etapes de la diferenciació de MN. Més avall, mapa de calor de les funcions biològiques de GO enriquides entre gens regulats en els punts de temps corresponents.h Diagrames de caixa que mostren les distribucions dels canvis en els canvis log2 per 66 gens de el factor d’entroncament essencial entre els mutants ALS i els controls; caixes blanques = VCP mu en comparació amb els controls, caixa blava = SOD1 mu en comparació amb els controls isogénicos, caixa verda = FUS mu en comparació amb els controls
Imatge de mida completa
a continuació, vam realitzar una anàlisi diferencial de l’expressió gènica per avaluar si els gens específics estan regulats diferencialment en diferents etapes de desenvolupament neuronal en VCP mu en comparació amb les mostres de control. Dos-cents cinquanta-sis gens van ser estadísticament regulats a la baixa en VCP mu en l’etapa NPC durant la qual ocorre un ANAR aberrant (log2FC > 1.5 i valor de P < 0.01); aquests gens estan altament enriquits en l’entroncament d’ARNm i en les funcions GO de processament de l’extrem 3 ‘(fig. 4g). Cal destacar que 47 d’aquests gens codifiquen RBPs (fig. 5d complementària). Hi havia molts menys gens regulats a l’alça (fig. 5c suplementària). També examinem els nivells d’expressió de 66 gens reguladors d’entroncament coneguts 31; hi ha una clara regulació descendent global en l’etapa NPC de les mostres de VCP mu i en els MUS de SOD1 mu i FUS independents que coincideixen amb un ANAR aberrant en cada cas (fig. 4 h).
En resum , trobem que els programes de processament de transcripció i ARN reflecteixen la trajectòria de desenvolupament dels MN ja que les vies específiques s’activen de manera dirigida per etapes. Tot i els defectes postranscripcionals, el programa transcripcional primari no s’interromp durant la diferenciació de MN per la mutació VCP. No obstant això, una regulació descendent global en l’expressió dels components d’entroncament passa de manera concomitant amb un ANAR aberrant en diverses mutacions causants d’ALS.
Transcripcions ANAR citoplásmicas i pèrdua nuclear de la proteïna SFPQ
el gen SFPQ, membre de la família de l’comportament de Drosophila, entroncament humà (DBHS), codifica una proteïna que exerceix funcions clau en la transcripció, l’entroncament, el processament de l’extrem 3 ‘i la viabilitat dels axons 32 , 33, 34, 35. Aquí, l’intró 9/9 de 9 kb en el gen SFPQ mostra l’esdeveniment de IR més prominent identificat durant la neurogènesi motora en les nostres mostres de VPC mu NPC en comparació amb les contraparts de control. És important destacar que el SFPQ IR aberrant també es produeix en SOD1 mu i FUS mu MN en comparació amb els controls (fig. 5a, c). Validem SFPQ IR i la seva desregulació en VCP mu en comparació amb les mostres de control mitjançant l’anàlisi de qPCR de múltiples línies iPSC independents (tres clons de tres controls sans-quatre clons de dos pacients amb mutacions de VCP; Fig. 5b i Fig. 6a suplementària). A més, validem dos reguladors d’entroncament FUS i DDX39, que estan igualment fortament afectats en les NPC VCP mu, i en SOD1 mu i FUS mu MN (fig. 6b-g suplementària).
Retenció aberrant de l’intró SFPQ en diverses formes genètiques d’ALS i la seva interacció amb la proteïna SFPQ. a Esquerra, vistes de el navegador d’el genoma dels perfils de RNA-seq per al gen SFPQ de retenció d’introns en el control i mostres d’VCP mu en les etapes iPSC, NPC i PMN. El intró de 9 kb 9/9 d’interès s’indica amb un requadre groc. A la dreta, els gràfics de barres que quantifiquen el percentatge d’IR al llarg de tot el curs de el temps en el control i les mostres de VCP mu (mitjana ± sd; prova de recompte de Fisher). b Gràfics de barres que mostren els nivells d’IR de SFPQ mesurats per qPCR; barres blanques = controls, barres negres = VCP mu. Els nivells d’IR en cada punt de temps es van comparar amb els de l’etapa iPSC de el mateix grup. N = 3 línies de control i N = 4 línies VCP (mitjana + sd * p < 0.05, ** p < 0.01, ANOVA d’una via amb correcció de Dunnet per comparacions múltiples). c Gràfics de barres que mostren el percentatge de SFPQ IR per FUS mu o SOD1 mu MN en control comparat amb (mitjana ± sd; prova de recompte de Fisher). d Les gràfiques de barres representen el nivell d’enriquiment en la unió de RBP a l’intró retingut en comparació amb els introns no retinguts dins el mateix gen; barres blaves = gen SFPQ, barres verdes = gen FUS. i – f Vista del navegador d’el genoma dels esdeveniments de reticulació de SFPQ ECLIP al llarg de les anotacions de transcripció de SFPQ i FUS. Els quadres grisos ressalten la ubicació dels introns retinguts. g Gràfics de barres que mostren el nivell de localització nuclear i citoplasmàtica de les transcripcions d’IR mesures per qPCR.Els nivells d’IR en cada fracció es van comparar amb els de la fracció nuclear de les iPSC de control. N = 3 línies de control i N = 4 línies VCP, mitja + valor sd P d’ANOVA de dues vies amb correcció de Tukey per a comparacions múltiples. h Localització subcel·lular de SPFQ determinada per immunocitoquímica en iPSCs, NPCs i PMNs. La proporció de la intensitat mitjana de la tinció SFPQ al nucli (N) davant el citoplasma (C) es va determinar automàticament en les cèl·lules mu CTRL i VCP. Les dades mostrades són la relació N / C mitjana (± sd) per camp de visió de quatre línies de control i quatre línies de mu de VCP. Valor de p de prova t no aparellada amb correcció de Welch. Vegeu també Fig. 7d complementària
Imatge de mida completa
Examinem les dades d’ENCODE ECLIP a gran escala de 112 RBP en cèl·lules K562 i HepG2 per identificar candidats que s’uneixen als introns retinguts en SFPQ i FUS 36, 37. La classificació d’aquestes RBP per la proporció d’esdeveniments de reticulació al intró retingut en comparació amb els introns no retinguts en el mateix gen revelar que SFPQ i HNRNPM són les RBP més altament enriquides (fig. 5d-f i Fig. 7a suplementària). Això indica que la proteïna SFPQ s’uneix directament als introns retinguts SFPQ i FUS.
A l’descobrir evidències d’interaccions entre la proteïna SFPQ i el intró 9/9 de SFPQ, vam intentar comprendre la naturalesa d’aquesta interferència. Els canvis en IR no estan acompanyats per una diferència estadísticament significativa en els nivells d’expressió de gens o proteïnes entre VCP mu i les mostres de control (Fig. 7b, c). En el seu lloc, utilitzem el fraccionament citoplásmico nuclear i identifiquem una abundància estadísticament major de la isoforma de retenció de l’intró SFPQ en el citoplasma mu de VCP en comparació amb els cultius de control (fig. 5 g). Aquestes troballes junts van portar a la investigació de la distribució subcel·lular de la proteïna SFPQ. Trobem una pèrdua nuclear modesta però estadísticament significativa de la proteïna SFPQ en cultius VCP mu (fig. 5 h).
En resum, l’augment més significatiu d’IR a través d’VCP, FUS i SOD1 es veu en la transcripció de SFPQ. Aquesta seqüència intrònica està unida àmpliament per la proteïna SFPQ i tots dos membres d’aquest complex (és a dir, la proteïna i el transcrit de retenció d’introns) exhibeixen una distribució cel·lular aberrant.
Pèrdua nuclear d’SFPQ a través d’ ELA familiar i esporàdica
Havent establert una disminució de l’abundància nuclear de la proteïna SFPQ en la diferenciació de cultius de iPSC, es va buscar provar la generalització d’aquesta troballa a través de models d’aLS transgènics de ratolí in vivo i teixit humà post mortem de casos d’ELA esporàdics. Amb aquesta finalitat, primer examinem dos models transgènics d’ALS de ratolí, inclosos SOD1 G93A i VCP A232E. Usant aquest enfocament, vam demostrar la pèrdua nuclear de la proteïna SFPQ dels MN de la medul·la espinal amb les dues mutacions genètiques relacionades amb ALS (fig. 6a). Per tant, la pèrdua nuclear de la proteïna sorgeix en diferents formes genètiques de l’ELA que se sap que exhibeixen proteinopatía TDP43 (VCP mu) i aquelles que no ho fan (SOD1 mu). Observant que el 90% dels casos d’ELA no són familiars, a continuació examinem el teixit post mortem de la medul·la espinal dels casos d’ELA en humans esporàdics. De fet, vam demostrar una pèrdua nuclear sorprenent de la proteïna SFPQ en l’ELA esporàdica humana en comparació amb els teixits de control normals, el que subratlla la rellevància més àmplia d’aquesta troballa (fig. 6b). A partir d’aquests resultats, arribem a la conclusió que la pèrdua nuclear de la proteïna SFPQ és un segell distintiu a través de diversos models in vitro i in vivo que representen ALS familiar i esporàdica.
la depuració nuclear d’SFPQ és un segell molecular de l’ALS genètica i esporàdica. a Anàlisi de la localització subcel·lular de SFPQ a MN en la medul·la espinal ventral de ratolins de tipus salvatge, VCP A232E i SOD1 G93A. El citoplasma MN es va identificar mitjançant tinció de xat, els nuclis es van contrastar amb DAPI. Les dades que es mostren són la proporció nuclear / citoplasmàtica (N / C) (mitjana ± SD) per cèl·lula de tres ratolins SOD1 G93A i 3 VCP A232E de tipus salvatge. Barra d’escala: 20 micres. P- valors de la prova t de Welch d’un costat. Les cèl·lules d’animals individuals en cada condició es van agrupar després d’excloure l’efecte de ratolins individuals mitjançant la comparació de models lineals complets (malaltia i factor individual) amb models lineals reduïts (només malaltia) utilitzant el Criteri d’Informació d’Akaike. b Anàlisi de la localització subcel·lular de SFPQ a MN en la medul·la espinal ventral de controls sans i pacients amb ELA esporàdica (SALS).El citoplasma MN es va identificar mitjançant tinció de xat, els nuclis es van contrastar amb DAPI. Només es van considerar per a l’anàlisi dels MN amb un nucli visible. Barra d’escala 50 micres. Les dades mostrades són una relació N / C (mitjana ± SD) per cel·la de tres casos per grup
Imatge de mida completa
Discussió
Els objectius de aquest estudi van ser dobles: (i) resoldre els esdeveniments de processament d’ARN alternatius subjacents en les diferents etapes de la restricció de llinatge MN i (ii) buscar mecanismes patògens primaris comuns entre formes patològicament divergents d’ELA (és a dir, amb o sense proteinopatía TDP43). Per aconseguir això, integrem la diferenciació dirigida de iPSCs específiques de l’pacient en MN espinals amb seqüenciació d’ARN i examen bioinformàtic complet. Vam demostrar que un sòlid programa d’entroncament subjau en el desenvolupament de MN com es resumeix a la Fig. 6a. A l’resoldre la naturalesa precisa dels programes postranscripcionals seqüencials subjacents a les diferents etapes de la diferenciació de MN, revelem que el moment d’aquests esdeveniments moleculars acuradament coreografiats es veu pertorbat per la mutació VCP causant d’ALS. A l’analitzar mostres de MN relacionades amb ALS addicionals, també vam mostrar que els antecedents dels gens ALS, com SOD1 i FUS, afecten l’estructura de transcripció dels reguladors d’entroncament d’ARN clau d’una manera similar als objectius del programa de entroncament aberrant en mostres de VCP. A més, mostrem que una regulació a la baixa global dels components d’entroncament coincideix amb els defectes d’entroncament. Aquest “debilitament” de la maquinària d’entroncament proporciona una explicació plausible per l’IR aberrant que trobem en l’ALS relacionada amb la mutació VCP, SOD1 i FUS. La transcripció SFPQ exhibeix el intró retingut més significativament, a què la proteïna SFPQ s’uneix amb avidesa, proporcionant evidència d’una interacció directa entre la proteïna i la transcripció que reté l’intró. També vam demostrar que la transcripció de retenció de intró SFPQ s’exporta a l’citoplasma. Això passa en major mesura en el mutant VCP que coincideix amb l’aberrant programa IR. Això ens va portar a examinar la localització cel·lular de la proteïna SFPQ, que va descobrir la seva pèrdua nuclear a ALS. SFPQ codifica un regulador clau de la localització i desenvolupament axonal de l’ARNm 38. En conjunt, aquests resultats plantegen la idea que l’estructura de transcripció desregulada pot jugar un paper clau en la degeneració axonal durant el desenvolupament de l’ELA. De fet, SFPQ està emergint com un regulador clau de la neurodegeneració més àmpliament 34, 38, 39, 40.
Els canvis dinàmics de AS s’han informat prèviament al forebrain de rosegadors entre diferents etapes de desenvolupament 41 , 42. Aquí hem identificat modificacions no reconegudes prèviament en l’estructura de transcripció de gens que regulen el processament i entroncament de l’ARN en els primers passos de la restricció de l’llinatge MN humà (fig. 7a). Vam demostrar que un màxim de remodelació de 3 ‘UTR, inclòs l’escurçament de 3’ UTR, precedeix a IR. Específicament, hi ha una variació de longitud de 3 ‘UTR estadísticament significativa que afecta les estructures de l’transcrit a mesura que les cèl·lules surten de la pluripotència durant la inducció neural. Això precedeix el pic d’acumulació de transcripció de retenció de intró que es produeix en el patró neural de la medul·la espinal ventral. Després d’això, l’allargament UTR progressiu en 3 ‘, la inclusió d’exons en casset i l’entroncament d’introns caracteritzen les fases restants de la diferenciació terminal a MN com es va mostrar anteriorment gener, 6.
Diagrama esquemàtic de el model proposat. una caricatura que resumeix el curs temporal dels esdeveniments postranscripcionals subjacents a la neurogènesi motora humana en el control i les mostres VCP mu. Els nostres resultats suggereixen que els esdeveniments predominants de processament d’ARN en una etapa primerenca de la diferenciació neural són l’IR i la remodelació 3 ‘UTR. Aquests esdeveniments comencen prematurament en mostres de VCP mu, però no afecten els principals programes de transcripció subjacents a la diferenciació de MN humà. b Caricatura que resumeix la conseqüència funcional d’un ANAR aberrant en el gen SFPQ a través de diverses formes genètiques i esporàdiques d’ALS. El intró 9/9 de 9 kb en SFPQ es conserva en tots els fons mutants d’ALS, el que condueix a una major abundància citoplasmàtica de les transcripcions afectades. La proteïna SFPQ s’uneix àmpliament a l’intró retingut. La proteïna SFPQ en si mateixa es reubica des del nucli a citoplasma en tots els fons mutants d’ALS, així com en mostres post-mortem de pacients esporàdics amb ELA.
Imatge de mida completa
Les UTR a 3 ‘exerceixen funcions clau en la regulació de l’expressió gènica postranscripcional i els ARNm expressats en teixits cerebrals generalment tenen UTR a 3’ més llargues en comparació amb altres teixits 12, 13. De fet, s’observa un allargament progressiu de l’ARNm 3 ‘UTR durant el desenvolupament embrionari de l’ratolí 29. Aquí observem una extensa variació en la longitud de 3 ‘UTR durant la inducció neural de les iPSC humanes. Inesperadament, trobem un escurçament transitori de 3 ‘UTR que precedeix a l’allargament progressiu de 3’ UTR reportat prèviament durant la diferenciació terminal. La funció molecular d’aquest escurçament segueix sense estar clara, encara que altres estudis reporten un paper potencial de l’3 ‘UTR en la formació de paràsits i la sortida de la pluripotència 43, 44. La naturalesa altament transitòria d’aquest procés regulador pot explicar per què ha evadit la detecció experimental fins a la data. El nostre disseny experimental resolt en el temps ha permès la identificació de programes transcripcionals seqüencials subjacents a la neurogènesi motora humana.
L’IR s’està convertint en un nou mecanisme postranscripcional que regula l’expressió gènica. Els tipus de cèl·lules neuronals i immunes tenen majors proporcions d’introns retinguts en comparació amb altres teixits juliol. Estudis anteriors han demostrat ANAR progressiu durant la diferenciació terminal de les neurones de ratolí i la rellevància de les transcripcions que retenen l’intró en la regulació de l’expressió de gens específics de neurones lligades funcionalment en models de ratolí 6, 7. Aquí proporcionem evidència d’un augment transitori en les transcripcions de retenció d’introns en l’etapa PMN que es dirigeix a una xarxa de reguladors d’entroncament. A l’reconèixer la interacció entre els esdeveniments d’IR i els paraspeckles nuclears, això planteja la possibilitat que aquestes transcripcions contribueixin a l’estabilització dels paraspeckles o que siguin segrestades dinàmicament en aquestes estructures nuclears per inhibir la seva funció. Els experiments futurs determinaran l’estabilitat i la localització d’aquests transcripcions.
Vam demostrar que la sincronització dels programes post-transcripcionals es veu pertorbada en mostres amb mutacions de VCP causants d’ALS, amb IR prematur i incrementat i, en certa mesura, amb una variació de longitud de 3 ‘UTR. Curiosament, els reguladors d’entroncament d’ARN clau seleccionats pel programa d’entroncament aberrant en mostres VCP mu també van mostrar un ANAR ampli en els MN que alberguen mutacions en altres gens causants d’ELA, inclosos SOD1 i FUS. En particular, observem una expressió reduïda dels components clau de l’spliceosome coincidint amb un ANAR aberrant en VCP, SOD1 i FUS. Això és consistent amb un estudi recent que mostra l’associació entre IR i el reclutament reduït de factors d’entroncament 45. Tot i que el programa d’entroncament aberrant en les mostres de VCP mu podria estar vinculat a la degeneració neuronal, la manca de canvis en els programes transcripcionals associats amb la neurogènesi motora indica que les disfuncions en el processament d’IR i de l’extrem 3 ‘no afecten fonamentalment el desenvolupament neuronal. Aquestes troballes en conjunt plantegen la hipòtesi que la IR aberrant representa manifestacions subtils d’una via desregulada de les neurones en desenvolupament, el que eventualment contribueix a la major vulnerabilitat dels MN madurs.
La transcripció de retenció de intró més significativa a través dels models VCP mu, SOD1 mu i FUS mu iPSC va ser SFPQ, que codifica una proteïna que exerceix funcions clau en vies sortints relacionades amb l’ELA, inclosa la transcripció d’ARN, l’entroncament, el processament de l’extrem 3 ‘i la viabilitat de l’axó 32, 33, 34. Els experiments posteriors van mostrar que la transcripció de retenció d’introns és més abundant al citoplasma de VCP mu en comparació amb les contraparts de control, i coincideix amb la disminució nuclear de la proteïna SFPQ. També trobem que la proteïna SFPQ s’uneix àmpliament al seu intró retingut. L’autoregulació entre les proteïnes d’unió a ARN (RBPs) (per exemple, TDP43) es reconeix i, per tant, aquesta troballa és consistent amb la literatura anterior 46, 47. De manera crucial, trobem la pèrdua nuclear de la proteïna SFPQ en tots dos models transgènics de SOD1 i VCP de ratolí, i en la medul·la espinal ALS esporàdica post mortem humana, el que suggereix que això representa un segell molecular de l’ALS. Per tant, proposem que la interacció entre la proteïna SFPQ i la seva transcripció que reté l’intró imposa la seva co-localització aberrant al citoplasma (fig. 7b).L’abundància reduïda de la proteïna SFPQ nuclear pot afectar l’entroncament previ a l’ARNm, el que podria contribuir als defectes postranscripcionals que nosaltres i altres hem identificat en ALS 48, 49. En conjunt, trobem que l’IR en la transcripció de SFPQ i la pèrdua nuclear de la proteïna SFPQ són característiques moleculars comuns en diverses formes genètiques i esporàdiques d’ALS.
Declaració d’Ètica
El consentiment informat es va obtenir de tots els pacients i controls sans en aquest estudi. Tots els protocols experimentals es van dur a terme d’acord amb les normes i directrius aprovades pel Comitè Nacional d’Ètica d’Investigació de l’Hospital Nacional de Neurologia i Neurocirurgia de l’UCLH i l’Institut de Neurologia de la UCL (09/0272).
Derivació de fibroblasts humans i iPSC
Els fibroblasts dèrmics es van conrear enmig OptiMEM + FCS a l’10%. Els següents plasmidis episomals es transfectar per a la generació iPSC: pCXLE hOct4 shp53, pCXLE HSK i pCXLE Hul (Addgene), com es va informar anteriorment 56. Els detalls de les línies utilitzades en aquest estudi es proporcionen a la Taula Suplementària 1. Dues de les línies de control utilitzades (control 2 i control 3) estan disponibles comercialment i es van adquirir de Coriell (nombre de catàleg ND41866 * C) i ThermoFisher Scientific (nombre de cat. nombre A18945), respectivament.
Cultiu de cèl·lules
Les PSC induïdes es van mantenir en Geltrex (Life Technologies) amb medi de Essential 8 Medium (Life Technologies) i es van passar utilitzant EDTA (Life Technologies, 0, 5 mm). Tots els cultius cel·lulars es van mantenir a 37ºC i 5% de diòxid de carboni.
Diferenciació neurona motora
La diferenciació de MN es va dur a terme utilitzant una versió adaptada d’un protocol 19 publicat anteriorment. Breument, les iPSC es van diferenciar per primera vegada en neuroepitelio mitjançant plating a 100% de confluència enmig químicament definit que consisteix en DMEM / F12 Glutamax, Neurobasal, L-Glutamina, suplement de N2, aminoàcids no essencials, suplement de B27, β- mercaptoetanol (sobretot de Life Tecnologies) i insulina (sigma). El tractament amb molècules petites del dia 0 a 7 va ser el següent: dorsomorfina 1 micres (Millipore), SB431542 2 micres (Tocris Bioscience) i CHIR99021 3, 3 micres (Miltenyi Biotec). En el dia 8, la capa neuroepitelial es va dissociar enzimàticament utilitzant dispasa (GIBCO, 1 mg ml- 1), es va col·locar en plaques recobertes amb laminina i després es va modelar durant 7 dies amb àcid retinoic 0, 5 micres i purmorfamina 1 micres. En el dia 14, els precursors de la medul·la espinal MN es van tractar amb purmorfamina 0, 1 micres durant 4 dies més abans de diferenciar-terminalment durant > 10 dies a Compost I 0, 1 micres (Enzo Life Sciences) per promoure la sortida de l’cicle cel·lular. En els punts de temps rellevants, les cèl·lules es van recol·lectar per a l’extracció d’ARN o es van fixar en paraformaldehid a el 4% per al immunomarcatge.
Extracció d’ARN i seqüenciació
El kit de cèl·lules d’ARN simple de Promega Maxwell RSC que inclou tractament amb ADNasa, juntament amb l’instrument Maxwell RSC, es va utilitzar per a les extraccions d’ARN. Per a les validacions de qPCR, l’ARN es va extreure amb el RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen). El Nanodrop es va usar per avaluar la concentració d’ARN i la relació 260/280, i el bioanalitzador Agilent es va usar per avaluar la qualitat. Les puntuacions d’integritat d’ARN (RIN) van ser > 8 per a totes les mostres utilitzades en aquest treball. Les biblioteques de RNAseq es van preparar utilitzant el kit d’ARNm trenat Truseq (Illumina) amb 1 mg d’entrada de poli (A) + ARN. Després, els productes es van purificar i enriquir amb amplificació per PCR per crear les biblioteques de cDNA finals. Les biblioteques es van enviar per seqüenciació d’alt rendiment, es van executar durant 75 cicles en una cel·la de flux ràpid, en la instal·lació central de NGS de l’Institut de Neurologia utilitzant el Hiseq2500. Per a l’anàlisi de transcrits nuclears i citoplásmicos, es va utilitzar el kit de purificació d’ARN citoplásmico i nuclear (Norgen Biotek Corp).
Dades de seqüenciació d’ARN
Es van obtenir lectures d’ARN de seqüència única de 50 pb a partir de cinc etapes diferents de la diferenciació de MN de les mostres de control i VCP mu (iPSC, i dies 7, 14, 21 i 35); les mostres s’enumeren en les Dades Suplementaris 1. El nombre d’accés de Gene Expression Omnibus (GEO) per a les biblioteques de RNA-seq és GSE98290.També hem obtingut la seqüenciació d’ARN de finalització i aparellada derivats de dos estudis independents de la diferenciació neuronal in vitro de HESCS (GSE20301 22 i GSE86985 23); Dos estudis independents sobre formes familiars d’ALS, ja sigui causades per Mutant SOD1 (n = 5; 2 sod1a4v derivades de pacients i 3 mostres de control mn isogènic on s’ha corregit la mutació; HB9 Facs purificat MNS, GSE54409 27 o FUS (n = 6; 3 FUS derivat del pacient R521G i 3 controls de germans saludables MNS, GSE77702 28; Dues dades de RNA-Seq de l’ESC humà compartit per Miha Modic; dos Fetal SPMN (E-MTAB-3871; NIH roadmap Epigenomics Mapping Consortium) i Adult SPMN (làser) -SPMN CAPTURE; GSE76514 53) Mostres.
Dades d’expressió pre-processament
Llegències individuals i aparellades per a cadascuna de l’estudi es van alinear inicialment a les seqüències Ribosomal ARN per filtrar les lectures Això pot venir de la contaminació Ribosomal ARN mitjançant Bowtie2 (-v 0) 57. Les llegides restants es van alinear amb el genoma humà (H19) utilitzant l’alineador de splice conscient de Tophat2 58 amb paràmetres predeterminats. Totes les biblioteques generades en aquest estudi tenien < 1% RRNA, 90% Strandedness i > 70% exon IC llegeix.
Quantificació genètica i caracterització sense supervisió del conjunt de dades
La quantificació absoluta dels gens es va realitzar mitjançant el recompte HTSEQ 59. L’anàlisi posterior es va realitzar amb la R TAPA ESTATÍSTICA VERSIÓ 3.3.1 (2016) i Bioconductors Biblioteques Versió 3.3 (R: R: Un llenguatge i medi ambient per a la informàtica estadística. Viena, Àustria: Fundació R per a la informàtica estadística; 2013).
Abans de l’anàlisi de clústers sense supervisió de les 31 mostres de diferenciació MN, vam identificar gens expressats de manera fiable per a cada condició (VCP MU o control als dies 0, 7, 14, 21 i 35). Per a una mostra donada, l’histograma del recompte de gens Log2 és generalment bimodal, amb els modes corresponents a gens no expressats i expressats. Els gens expressats de manera fiable es van identificar mitjançant la instal·lació d’una barreja gaussiana de dos components a les dades de gens de recompte de registre de LOG2 amb el paquet R 60. Es va considerar que un gen es va expressar de manera fiable en una condició determinada si la probabilitat que pertanyés a la classe no expressada era inferior a l’1% en cada mostra que pertany a la condició. 15, 989 gens es van seleccionar en funció de la seva expressió detectada en almenys una de les 10 condicions (és a dir, cinc horitzons diferents de restricció de llinatge per al control i VCP MU). A continuació, normalment hem normalitzat les columnes de la matriu del recompte del gen amb el paquet R Limma 61. La matriu jeràrquica sense supervisió de la matriu de recompte de gens filtrat i normalitzat es va realitzar amb la correlació de classificació de Spearman com una mesura de distància i un algorisme de clúster complet.
Hem realitzat SVD de l’expressió dels 15, 989 gens a les cinc etapes diferents de la diferenciació de Mn de controls saludables i VCP MU. A continuació, vam seleccionar els components que capturen majors de la variància en l’expressió gènica. Per visualitzar els vectors singulars adequats (es deixa a l’esquerra {{{{{} SeptualArrow V} \), vam representar l’expressió de l’eix vertical en funció de l’època corresponent a cada mostra de l’eix horitzontal i pintar-ho tot Mostres corresponents a controls saludables grisos, i els corresponents a VCPMU a Magenta. A continuació, vam identificar els gens els perfils d’expressió que es van correlacionar (correlació de Pearson entre el perfil d’expressió de gens individuals i els vectors singulars a la dreta) i van contribuir (projecció de cada perfil d’expressió gènica individual en vectors singulars adequats) més fortament (ja sigui positivament o negativament) amb el perfil d’expressió de la Vectors singulars. Per tal d’identificar els gens representatius per a cada vector singular, els gens es van classificar segons les puntuacions de projecció i correlació. La màxima (puntuacions més positives tant en projecció com en correlació) i més baixos (les puntuacions més negatives tant en la correlació i projecció) Els gens van ser seleccionats per a cada vector singular utilitzant l’agrupació de K-Meig per a l’anàlisi de l’enriquiment de la baixa.
Anàlisi d’APA des de l’ARN-seq
Per a la identificació d’identificació alternativa de 3 ‘UTR de RNA-seq, es va obtenir una cobertura de nucli de nucleòtids per a cadascuna de les 31 mostres que utilitzen Genomecov des de la suite de bedools 62. A continuació es van identificar les regions transcrites contínues mitjançant una finestra lliscant a través del genoma que requereix una cobertura mínima de set lectures en més de 80 posicions per finestra de 100 BP; Les regions veïnes separades per regions baixes es van fusionar com es descriuen anteriorment 13. Els fragments expressats es van associar a la superposició de 3 ‘UTR utilitzant les últimes versions HG19 ENSEMBL V75 63.Les regions expressades aïllades que no es van superposar amb cap característica es van associar amb la més propera UTR si (1) la característica anotada més propera no era més que un UTR, (2) si la cadena de la regió expressada estava en línia amb el Strand de la UTR 3 ‘més propera i (3) si la distància a la UTR 3’ era inferior a 10’000 kb, que és la gamma de distància intragènica. Els UTR ha estat sotmesos a un filtratge extens per excloure possibles transcripcions intragèniques, transcripcions superposades i introns conservats com es descriuen anteriorment 13. Finalment, vam intercanviar el segment més llarg de 3 ‘UTR anotats amb dades RNA-Seq amb una anotació de poli (a) de lloc construïda mitjançant lectures de biblioteques de seqüenciació de 3’ en mostres humanes 64 per obtenir Poly Poly Poly (a) dins del segment de 3 ‘UTR de cada transcripció.
Hem utilitzat el nombre de llegits a -300 NT regió terminal de cada 3 ‘UTR isoforms com a proxy per al nivell d’expressió isoforma UTR 3’ per identificar els canvis en l’ús de proximal i llocs distal poli (a). La densitat de la mapada es llegeix en la regió terminal de -300 NT de 3 ‘UTR Isoform és bimodal, amb un pic de baixa densitat probablement corresponent a la transcripció de fons, és a dir, 3’ Isoformes UTR de baixa abundància o 3 ‘UTR isoformes a les quals es llegeixen que es llegeixen espuralment, i un pic d’alta densitat corresponent a les isoformes UTRES. Per tal d’identificar de manera fiable expressada 3 ‘UTR isoformes UTR en l’estudi, es va instal·lar una barreja gaussiana de dos components a les dades mitjançant el paquet R 60; Es va denominar una isoforma expressada de manera fiable si en ambdues rèpliques tenien menys de l’1% de probabilitats de pertànyer a la categoria de fons.
Per tal d’identificar les transcripcions que mostren un canvi marcat en l’ús de llocs de poli (a) entre les condicions , Hem marcat les diferències en l’ús proximal-a-distal (a) Ús del lloc utilitzant les dues puntuacions següents:
\ (s_1 = {mathrm {log}} _ 2 esquerra ({frac {{{{} I _ {mathrm {proximal}}}} {{i _ {mathrm {distal}}}}} dreta) _ {mathrm {cond1}} – {mathrm {log}} _ 2 esquerra ({frac { {I _ {mathrm {proximal}}}} {{i _ {\ mathrm {distal}}}}} dreta) _ {mathrm {cond2}})
\ (s_2 = frac {{I _ {mathrm {proximal}}}} {{i _ {mathrm {proximal}} + i _ {mathrm {distal}}}} _ {mathrm {cond1}} – frac {{mathrm {proximal}}}} {{i _ {\ mathrm {proximal}} + i _ {mathrm {distal}}}} {mathrm {cond2}} a l’esquerra)
l’estadística La importància dels canvis en la ràtio proximal-to-distal (a) es va avaluar la relació entre dues condicions per la prova del recompte exacte de Fisher mitjançant el recompte de lectura primant de resum-up de promotor-proximal versu s promotor-distal 3 ‘utr isoforms que originen qualsevol de les condicions. Hem ajustat el control P -Value per a una tarifa de descobriment falsa (FDR) de 0,01. Hem restringit la nostra anàlisi en transcripcions ENSEMBL que contenen almenys dos 3 ‘UTR que generen la poliadenilació tàndem expressada en condicions d’interès. Els torns proximals es van seleccionar llavors quan (S_1 LE – 1), (S_2 LE – 15%) i FDR < 0,01; Es van seleccionar el canvi distal quan es selecciona quan (S_1 GE 1), (S_2 GE 15%) i FDR < 0,01.
splicing Anàlisi
La identificació de totes les classes de com a esdeveniments en la diferenciació MN es va realitzar amb les eines vastes de pipeline 21 de RNA-Seq. Per a un esdeveniment com a esdeveniment que es consideri diferent regulat entre dues condicions, hem requerit una mitjana mínima Δpsi (entre les rèpliques emparellades) d’almenys un 10% i que la transcripció orientada per l’esdeveniment de splicing en qüestió a expressar-se de manera fiable en totes les mostres de la Condicions comparades, és a dir, la cobertura de lectura suficient en totes les mostres d’interès. A continuació, es va realitzar el visualitzador de Genòmica Integrational (IGV) -Urated Manual Couration per eliminar la cobertura baixa IR obtenint 167 esdeveniments d’alta confiança. L’anàlisi enfocada a l’IR s’ha realitzat en aquests 167 esdeveniments IR per als quals s’ha calculat un percentatge d’IR, ja que la fracció del mapatge intró es llegeix al nombre mitjà de cartografia de lectures a les exons adjacents de 5 ‘i 3’ normalitzats a la longitud de la Ingressos i exons respectius. S’ha obtingut una prova de comptatge de Fisher P -Value en les proves d’IR diferencial entre les condicions.
Anàlisi diferencial de la expressió génica.
Per a l’anàlisi de l’expressió de gens diferencial, vam córrer Kallisto 54 i Sleuth 55. Kallisto es va utilitzar per (1) Construir un índex de transcripció de la versió ENSEMBL GRC38 85 Homo Sapiens Transcriptome (-k 31), (2) Pseudo-alinear l’ARN-Seq llegeix al transcriptoma i (3) quantificar abundàncies de transcripció (-b 100-single -l 275 -s 50-RF-Stranded). A continuació, vam identificar gens expressats diferencialment amb SLEUT. L’anàlisi posterior es va realitzar amb el paquet estadístic R versió 3.3.1 (2016) i bioconductor versió 3.3 (R: R: Un idioma i medi ambient per a la informàtica estadística. Viena, Àustria: Fundació R per a la informàtica estadística; 2013). Abans de seleccionar gens expressats de manera diferent, vam identificar gens expressats de manera fiable.Kallisto produeix abundància de transcripció, i així calculàvem l’abundància de gens sumant el recompte brut estimat de les isoformes constituents per obtenir un únic valor per gen. Per a una mostra donada, l’histograma del recompte de gens / transcripció de LOG2 és generalment bimodal, amb els modes corresponents a gens no expressats i expressats. Els gens / transcripcions expressades de manera fiable van ser identificats a continuació mitjançant la fixació d’una barreja gaussiana de dos components a la transcripció de comptes estimades de LOG2 i les dades genètiques R amb paquet mclust 60; Es va afegir un pseudoucount d’1 abans de la transformació de LOG2. Es va considerar que un gen es va expressar de manera fiable en una condició determinada si la probabilitat que pertanyés a la classe expressada va ser superior a 0,1 en cada mostra pertanyent a la condició. Finalment, els gens que mostraven un registre d’expressió diferencial de doble registre i un P -Value < 0,05, i que es van expressar de manera fiable en la condició de mutant o control VCP es van considerar significativament.
Anàlisi d’enriquiment de go
Anàlisi de l’enriquiment de go es va realitzar mitjançant la prova de Fisher clàssica amb el paquet TopGo Bioconductor 65. Només es van considerar els termes que continguin almenys 10 gens anotats. Es va utilitzar un P-Value de 0,05 com a nivell de significació. A les xifres, Top Significatius GO Termes van ser seleccionats manualment mitjançant l’eliminació de termes i termes redundants que contenen menys de cinc gens significatius.
Anàlisi de vermell
Informació d’interacció de proteïna experimental-proteïna-proteïna S’ha recuperat des de la base de dades de cadenes 66 i visualitzat en citoscape 67, 68.
Cartografia de dades ECLIP
Les dades ECLIP RAW es van descarregar de CODE 36, 37. Abans de l’alineació, es va realitzar l’eliminació de l’adaptador de dues etapes mitjançant CUTADAPT segons el procediment operatiu estàndard ECLIP. També s’utilitza un enfocament de dues etapes. En primer lloc, es va utilitzar Bowtie2 per eliminar les llegides alineades a RRNA o TRNA. Llavors, es va utilitzar l’estrella per alinear la resta de llegits a Grch38, amb només es conserven lectures de cartografia única. Els duplicats de PCR es van col·lapsar segons els identificadors moleculars únics i ubicacions de mapes. La posició de resolució de la resolució de la resolució de nucleòties es va calcular com a coordenada immediatament anterior a l’esdeveniment de truncament de transcripció inversa.
Transcripció inversa, qpcr i IR Validació
La transcripció inversa es va realitzar mitjançant la primera línia de revisió. Kit de síntesi de CDNA (termofer científic) utilitzant 1 μg de l’ARN total i hexamers aleatoris. qpcr es va realitzar utilitzant la barreja mestra de PowerUp Sybr Green (termofisher científica) i el sistema Agilent MX3000P QPCR o el sistema Quantstudio 6 Flex en temps real de PCR (Aplicat Biosystems). Els primers utilitzats es llisten en la taula complementària 2. L’amplificació específica va ser determinada per l’anàlisi de la corba de fusió i l’electroforesi de gel d’agarosa dels productes PCR. Es van utilitzar parells de primers amb una eficiència del 90-110%. Per a cada validació IR a la pantalla es van utilitzar tres primers parells: (1) Parella Primer F1 R1 (Intron Spanning, a través d’Exon-Exon Junction) es van utilitzar per analitzar els nivells d’expressió gènica; (2) Primer parell F2 R2 (un primer en un exó flanquejant l’intró que s’analitzarà, l’altre sobre l’intró) es va utilitzar per avaluar els nivells d’IR; i (3) Primer parell F3 R2 (els dos primers en els exons flanquejant l’intró d’interès, si és possible dissenyat a través de l’Exon-Exon Junction) es va utilitzar per mesurar els nivells de la transcripció spliced. Les mostres RT-Minus es van utilitzar com a controls negatius. Els nivells d’IR (Primer Parell F2R2) es van normalitzar sobre el nivell d’expressió de cada gen individual (Primer Parell F1R1). Els nivells d’expressió de gens es van mesurar utilitzant el mètode DDCT utilitzant tres gens de neteja (GAPDH, POLR2B i UBE2D3).
Anàlisi del ciclo celular
L’anàlisi del cicle cel·lular es va realitzar mitjançant citometria de flux segons Protocols estàndard. En poques paraules, les cèl·lules es van dissociar utilitzant l’acutasa o la tripsina (tecnologies de la vida), rentades i fixades en suspensió utilitzant un 70% d’etanol fred. Les cèl·lules estaven tacades amb el iodur de propidium (PI, 50 μg ml -1, Sigma Aldrich) en presència de rnase A (10 μg / ml, Sigma Aldrich). Les cèl·lules es van analitzar mitjançant un BD FACS Calibur (BD Bioscience). Es van excloure els dobletes de l’anàlisi i es van recollir 10, 000 esdeveniments a la porta d’una sola cèl·lula per mostra. Les dades del cicle cel·lular es van analitzar mitjançant el mòdul multicicle de FCS Express 6 (de Novo Software).
Animals, models transgènics i processament de teixits
Tots els experiments que es descriuen en aquest estudi es van dur a terme sota llicència de l’oficina de la casa del Regne Unit, i van ser aprovats pel panell de revisió ètica de l’Institut de Neurologia. Es van utilitzar les següents línies transgèniques de ratolí: (1) Sod1 G93a ratolins (B6SJL-TG (SOD1 * G93A) 1GUR / J, Jackson Laboratories) (2) Over-Express Human VCPA232E va ser generada per J. Paul Taylor et al, ST Hospital de recerca infantil de Jude, Memphis, TN, EUA i es descriuen a Custer et al, 2010 69 i criats a Fons de tipus Black 6 (C57 / B6) de tipus salvatge.Fons mixt de tipus WILD-TYPL / 6-SJL (Laboratoris de Jackson) es van utilitzar com a control. Per a la recollida de teixits, els animals van ser injectats amb anestèsia terminal (sodi pentobarbital, eutatal) i es van perfusar transcarralment amb el 4% paraformaldehid. La regió lumbar de la medul·la espinal va ser retirada i post-fixa amb un 4% paraformaldehid i crioprotected durant la nit amb un 30% de sacarosa; Es van tallar 10 o 20 μm de les criosions transversals en sèrie per a la taca d’immunofluorescència.
Teixit post-mortem humà
Seccions de teixits congelats derivats de les cordons espinals lumbars de tres anys i de sexe Pacients esporàdics, Durada de la malaltia 1, 2 i 2 anys, respectivament, i tres matèries de control d’edat i gènere sense antecedents de malaltia neurològica (N = 3 pacients i 9 seccions; mitjans de 68 anys: 68.55 i 69,5 + 2,12 anys ; vegeu la taula complementària 3). La mort dels temps de retard de congelació de la congelació també es compara entre els grups (retard: 25 + 5.29 i 29.33 + 9,29 h, per al control i els pacients amb sals, respectivament). Les mostres de medul·la espinal es van obtenir a partir del Banc de teixits Neurororsource, Institut de Neurologia UCL, Londres, Regne Unit. Les mostres van ser donades al banc de teixits amb un donant de teixits escrits el consentiment informat després de la revisió ètica del Comitè de NHS NRES London-Central i emmagatzemat sota una llicència del sector de la investigació de l’autoritat del teixit humà del Regne Unit (HTA).
Immunolabelling i Imaging
Per a immunocittociclisme i immunohistoquímica, les mostres es van bloquejar en un 10% de sèrum de cabra normal (NGS) o un 10% de sèrum de ruc (NDS), segons correspongui i permeabilitat en 0,3% Triton X-100 (Sigma-Aldrich; a PBS) a temperatura ambient (RT) durant 1 h. Immunolabelling es va realitzar amb anticossos primaris en NGS (5%) i Triton X-100 (0,1% en PBS) a 4 ° C durant la nit seguit d’anticossos secundaris específics d’espècies per a 1 h a RT i Dapi Nuclear Comptesa (100 ng / ml) durant 10 minuts a RT. Per a mostres post-mortem humans, la fixació i la permeabilitat en metanol fred (-20 ° C, 20 min) es va realitzar abans de la immunostaining. Els anticossos primaris es van diluir de la següent manera: Rabbit Anti Olig2 (Millipore, AB9610) 1: 200; ratolí anti smi32 (Cambridge Bioscience, SMI-32R-500) 1: 1000; COAT ANTI XAT (MILIPORE, AB144P) 1: 100; conill anti pax6 (biolegend, 901301) 1: 300; Ratolí i conill anti SFPQ (ABCAM, AB11825 i AB38148, respectivament) 1: 100; ratolí i conill anti beta-tubuliniii (biolegend, 801201), ratolí anti lim3 (Dshb, 67.4e12) 1:50; Pollastre anti nkx2.2 (Dshb, 74.505) 1:50. Les imatges es van adquirir utilitzant un microscopi confocal de 710 làser (Zeiss) o el sistema de detecció de fenix d’Opera Phenix (Perkin Elmer). Per a l’anàlisi d’imatges, es van utilitzar Fiji o el sistema d’anàlisi d’imatges de Columbus (Perkin Elmer).
western blotting
El blotting occidental es va realitzar segons els protocols estàndards (Biorad). Es van obtenir productes de lisos de cèl·lules senceres a partir de pellets de cèl·lules de congelació utilitzant el buffer Lisys Lisys-Lysis (Roche) complet ™. La concentració de proteïnes va ser determinada per l’assaig Pierce BCA (termoferí científic) i s’utilitza per maximitzar la càrrega igual a través dels gels (~ 9 μg per carril). Electroforesi es va executar en un gel de proteïna de proteïna de 4-12% Criteri ™ XT (Biorad) a tensió constant (200 V, una hora) i seguit de transferència de proteïnes a una membrana nitrocel·lulosa (Biorad). El bloqueig es va realitzar en PBS, un 0,1% de tween, 5% de llet seca en pols (meravella) a RT durant una hora seguit de la incubació d’anticossos primaris durant la nit a 4 ° C. Els anticossos primaris es van diluir en PBS, 0,1% de tween, 5% de llet sec en pols de la següent manera: ratolí anti sfpq (ABCAM, AB11825) 1: 250; conill anti tls / fus (ABCAM, AB84078) 1: 500; conill anti ddx39 (Sigma Aldrich, SAB2700315) 1: 500, conill anti dols (ABCAM, AB182157) 1: 1000; ratolí anti gln1 (anticossos-en línia, AA 1-373) 1: 1000; conill anti tdp-43 (ABCAM, AB133547) 1:10, 000; ratolí anti gapdh (tecnologies de la vida, clon 6C5, AM43000) 1: 5000. Per a les membranes de detecció es van incubar amb anticossos fluorescents específics de les espècies (Irdye, Licor) durant una hora a RT i es van fotografiar mitjançant un sistema d’imatge d’Odyssey FC (Licor).
Disponibilitat de datos
El número d’adhesió geogràfic per a les biblioteques RNA-seq recentment generades és GSE98290 (//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE98290). També hem obtingut la seqüenciació d’ARN de finalització i aparellada derivats de dos estudis independents de la diferenciació neuronal in vitro de HESCS (GSE20301 22 i GSE86985 23); Dos estudis independents sobre formes familiars d’ALS, ja sigui causades per Mutant SOD1 (n = 5; 2 sod1a4v derivades de pacients i 3 mostres de control mn isogènic on s’ha corregit la mutació; HB9 Facs purificat MNS, GSE54409 27 o FUS (n = 6; 3 FUS derivat del pacient R521G i 3 controls de germà saludable MNS, GSE77702 28; Dues dades d’ARN-seq de l’ESC humà compartit per Miha Modic; dos Fetal SPMN (E-MTAB-3871GENE E-Expression Omnibus; NIH full de ruta del full de ruta de mapatge de l’epigenòmica del consorci; // www .ebi.ac.Regne Unit / ArrayExpress / Experiments / E-MTAB-3871 /) i SPMN adult (SPMN capturat per làser; GSE76514 52, 53) Mostres. Podeu dirigir-vos a més informació i sol·licituds de recursos i reactius i es compliran pel contacte principal, Rickie Patani ().
Expresiones de gratitud
Els autors volen agrair als pacients per a donacions fibroblast. També agraïm Miha Modic per compartir les dades HESC RNA-Seq, Martina Halegger i Roberto Simone per a la seva entrada pel que fa al disseny de primers, ANOB M Chakrabarti per compartir fitxers de llit de dades ECLIP alineades. Agraïm Benjamin Clarke, Mhoriam Ahmed i els membres dels laboratoris de Schiavo i Greensmith per a un valuós suport tècnic. Agraïm a Selina Wray per proporcionar accés a les línies VCP Mutant IPSC. Aquest treball va ser recolzat per l’Institut Francis Crick, que rep el seu finançament principal de Cancer Research UK (FC010110), el Consell de Recerca Mèdica del Regne Unit (FC010110) i el Wellcome Trust (FC010110). Reconeixem finançament de Wellcome Trust a RP, a NML i JU, un Premi d’Infraestructures de Bioinformàtica MEDC EMEDLAB a NML (MR / L016311 / 1), el Premi UCL GRAND REPTES (CEH), una beca de recerca post-doctoral de Marie (657749- Neuroutr) i una beca de mobilitat avançada de la Fundació Swiss National Science Foundation (P300PA_174461) a RLNML és un líder del grup Winton en reconeixement al suport de la Fundació Caritat de Winton a l’establiment de l’Institut Francis Crick. Reconeixem la plataforma DPUK / MRC per a la prestació de l’òpera Phenix per a l’anàlisi IPSC d’alt rendiment i un suport generós de l’Institut Nacional de Recerca en Salut University College College Hospitals Centre de Recerca Biomèdica.
Material Suplementario Electrico.
-
Información suplementària
-
descripción d’arxius suplementaris adicionales
-
dats suplementarios 1