Els microtúbuls interpolars són prescindibles en la fiosis de la meiosi ii – comunicacions de la natura – Comunicacions 2021

Assignatures

  • Mitosi
  • Microtúbuls

Resum

El fus mitòtic consisteix en dos tipus de microtúbuls. Els microtúbuls dinàmics de cinetocors capturen cinetocors, mentre que els microtúbuls interpolars estables serveixen com a columna vertebral estructural que connecta els dos pols de l’fus. S’ha cregut que tots dos són indispensables per a la divisió cel·lular en eucariotes. Aquí vam demostrar que els microtúbuls interpolars són prescindibles per a la segona divisió de la meiosi en el llevat de fissió. Fins i tot quan els microtúbuls interpolars són interromputs per un fàrmac despolimerizante de microtúbuls, els pols de l’fus se separen i els cromosomes segreguen el pol en la segona divisió de la meiosi en la majoria dels zigots, produint espores viables. La membrana de la forespora, que encapsula el nucli en la segona divisió de la meiosi i està guiada per septinas i les proteïnes d’avantguarda, és responsable de dur a terme els esdeveniments meiòtics en absència de microtúbuls interpolars. A més, durant la segona divisió fisiològica de la meiosi sense la pertorbació dels microtúbuls, l’acoblament de la membrana de les espores contribueix estructuralment a la separació de l’pol d’el fus i la divisió nuclear, generant prou força per a la separació de l’pol d’el fus i els esdeveniments subsegüents independentment dels microtúbuls interpolars.

Introducció

els microtúbuls tenen funcions essencials en la divisió cel·lular dels eucariotes. El fus mitòtic consta de dos tipus de microtúbuls: microtúbuls kinetochore (ktMTs) i microtúbuls interpolars (ipMTs) 1, 2, 3. Els ktMT repeteixen dinàmicament la polimerització i la despolimerització dels dímers de α / β-tubulina, capturant i tirant dels cinetocors de cromosomes. Per contra, les ipMT estables serveixen com la xarxa troncal estructural que connecta els dos pols 4 de l’fus.

La necessitat dels microtúbuls de fus per a la segregació de cromosomes s’ha demostrat en molts estudis durant les últimes dècades, l’ús de medicaments o el tractament amb fred per despolimeritzar els microtúbuls, així com l’ús de cèl·lules mutants defectuoses en l’organització dels microtúbuls. El requisit de ktMTs sembla evident, ja que una falla en la unió de microtúbuls kinetochore pot causar aneuploïdia maig. Se sap que la proteïna Ase1 / PRC1 associada als microtúbuls agrupa les ipMT a la zona mitjana de l’fus en la mitosi tardana (anafase) 6, 7, 8, 9. La disfunció de Ase1 / PRC1 no afecta la unió dels microtúbuls kinetochore en la metafase, però causa un col·lapse de l’fus a l’anafase, que sovint condueix a la producció d’aneuploides. L’aneuploïdia pot conduir a la inestabilitat genòmica i, per tant, està estretament relacionada amb la tumorigènesi 10. Per tant, es creu que ambdós tipus de microtúbuls són indispensables per a la correcta segregació cromosòmica en els eucariotes. La major part d’aquest coneixement, però, es basa en estudis de cèl·lules mitòtiques, i es comprèn poc si aquesta propietat es comparteix amb cèl·lules meiòtiques.

En aquest estudi, vam realitzar observacions de cèl·lules vives en cèl·lules tant mitòtiques com meiòtiques del llevat de fissió Schizosaccharomyces pombe per reavaluar la importància biològica dels microtúbuls en la segregació de cromosomes. Afegim un fàrmac de despolimerització de microtúbuls, metil-2-bencimidazol-carbamat (MBC), a cèl·lules de tipus salvatge abans de la divisió mitòtica o meiòtica i monitoritzem la progressió de l’cicle cel·lular utilitzant microscòpia de fluorescència en temps real (Fig. Suplementària S1a . cicle de vida de pombe). Trobem que les ipMT són prescindibles en la segona divisió de la meiosi (MII), en contra de la creença general d’un requisit absolut dels microtúbuls. La separació de l’pol d’la claveguera i els esdeveniments subsegüents van ocórrer normalment fins i tot en absència de ipMT en MII. A més, identifiquem que la membrana de foresporas, que encapsula el nucli, és responsable de la generació de la força per separar els pols en lloc dels microtúbuls. Inesperadament, fins i tot quan els microtúbuls estaven intactes, l’eliminació de la membrana de les espores va reduir la proporció de la separació de l’pol d’el fus. Proposem que la membrana de foresporas és el primer material no microtubular que produeix la força per a la divisió cel·lular en condicions fisiològiques.

Els microtúbuls interpolars són prescindibles en MII.

Els microtúbuls es van visualitzar amb la proteïna fluorescent verda (GFP) marcada amb α2-tubulina (Atb2), el cos de l’pol d’el fus (SPB, un centrosoma fúngic equivalent) es va marcar amb la proteïna fluorescent cian ( CFP), el component de mig pont SPB Sfi1 (Sfi1-CFP) i els cinetocors es van marcar amb Mis6 (Mis6-2mCh) etiquetats de fàbrica de 2 m. Durant la mitosi normal en absència de MBC, els microtúbuls que es nuclearon de les dues SPB van interactuar per formar un fus bipolar robust i separar les SPB 11, 12 (fig. 1a). Fins a la metafase, la regió central de l’fus mostrava un senyal GFP-Atb2 relativament tènue (12 minuts), el que reflecteix el fet que diversos ktMT curts estaven situats a prop de les SPB, mentre que les ipMT connectaven les dues SPB 4 (fig . S1B addicional) per a un esquema). En l’anafase B (22 min), la claveguera es va allargar a través del lliscament de ipMT interdigitantes a la zona mitjana de la claveguera. Es van observar propietats similars per al fus en la meiosi I (MI) i en MII (fig. 1 b, fig. Suplementària S1C). Afegim MBC i observem cèl·lules que acabaven d’entrar a la mitosi. Com era d’esperar, la nucleació dels microtúbuls de les SPB es va inhibir severament, i les SPB mai es van separar en presència de MBC (90 min; Fig. 1c i Fig. S1d suplementària), el que confirma la importància dels microtúbuls en la divisió mitòtica. Per contra, quan es van agregar els MBC als zigots abans de la MII (0 min; Fig. 1d), els SPB podrien separar-se, tot i que la microcubulación va ser inhibida considerablement per la MBC (fig. S1e complementària). Es va detectar un senyal GFP-Atb2 només al voltant dels pols de l’fus, el que indica que les ipMT que connecten les dues SPB es van interrompre (42 min). En presència de MBC, només es van detectar microtúbuls curts associats amb cinetocors (fig. 1e), el que suggereix que podrien servir com ktMT. Els cinetocors es van separar per igual als dos pols en la majoria de les cèl·lules tractades amb MBC (veure més a baix), el que indica que els microtúbuls curts eren suficients per a la captura i connexió dels cinetocors als SPB. No només la separació de SPB i la segregació de cromosomes, sinó també la divisió nuclear es van dur a terme amb èxit en presència de MBC (fig. 1f).

Image

(a – e) Imatges de cèl·lules vives de cèl·lules que porten GFP-Atb2 (microtúbuls; verd), Mis6 -2mCherry (Mis6-2mCh; kinetochores; vermell) i Sfi1-CFP (SPB; blau). Es mostren imatges de lapse de temps de cèl·lules que experimenten mitosi normal (a) i meiosi II (MII) (b). Per a les cèl·lules MII en b i d, les regions enquadrades dels zigots es mostren engrandides com imatges de lapse de temps. La forma de les cèl·lules es perfila en corbes de punts; n = 10. (c) Es va afegir un fàrmac de despolimerització de microtúbuls, MBC, a una cèl·lula que ingressa a la mitosi (0 min), just abans de la separació amb SPB. MBC va inhibir la formació de microtúbuls i la separació de SPB fins al final de l’observació (90 min). (D) Es va agregar MBC a una cel·la que ingressa a MII (n = 14). Les puntes de fletxa indiquen que es va produir una separació SPB fins i tot en absència de ipMT. (I) Kymographs de lapse de temps dels eixos durant MII, sense (esquerra) i amb (dreta) MBC (n ≥10). Les regions rectangulars que contenen els eixos es retallen de les imatges de lapse de temps i s’alineen cap avall en el transcurs de el temps. SPBs i kinetochores separats fins i tot en absència de ipMTs (dreta). La longitud de les fletxes correspon a 5 min. (F) La divisió nuclear de zigots MII sense (esquerra) i amb (dreta) MBC es va monitoritzar amb el marcador d’embolcall nuclear Cut11-3mRFP (vermell), juntament amb GFP-Atb2 (verd) (n ≥6). Les regions enquadrades es mostren ampliades com imatges de lapse de temps a continuació. (G) cut7-446 zigots mutants sotmesos a MII que es van marcar amb GFP-Atb2 (verd), Mis6-2mRFP (vermell) i Sfi1-CFP (blau) (n = 6). Durant la MII, les SPB es van separar i el fus bipolar es va formar a la temperatura restrictiva (32 ° C), a la qual les cèl·lules mitòtiques van fallar en la separació de SPB amb el fus monopolar. Barres d’escala, 2 micres.

Imatge de mida completa

Com que és possible que l’efecte de la MBC sigui parcial i que romangui una quantitat indetectable de ipMT i puguem dur a terme la separació de SPB i els esdeveniments subsegüents, examinem el mutant cut7 en el nostre sistema. Cut7 és el ortòleg de llevat de fissió de la família BimC / EG5 / kinesin-5 kinesin 12, 13. Cut7 connecta microtúbuls antiparalelos que emanen de cada SPB i llisca els microtúbuls cap a fora, separant així els SPB. Durant la mitosi, els SPB en el mutant sensible a la temperatura cut7-446 no van aconseguir separar-se a la temperatura restrictiva, el que va resultar en la generació de fusos monopolars 13 (fig. S2 suplementària).En contrast, els SPB van poder separar-se durant la MII en zigots de 7 a 446 a temperatura restrictiva (fig. 1 g). Això demostra que la separació de SPB durant MII no es basa en la interacció de ipMT intervinguda per Cut7. Per tant, arribem a la conclusió que les ipMT són prescindibles a l’realitzar esdeveniments de fase M essencials, com la separació de SPB, la segregació de cromosomes i la divisió nuclear a MII (fig. S3 complementària).

Segregació normal de cromosomes en absència de ipMTs en MII

Les cèl·lules mitòtiques tractades amb una alta dosi de MBC generalment donen com a resultat un fenotip letal de “tall”, que mostra una citocinesi forçada amb cromosomes no separats 14, 15, 16. Per determinar si la divisió ipMT independent observada durant la MII pot provocar una segregació anormal dels cromosomes, es van etiquetar els centròmers el cromosoma II (cen2) amb GFP (el sistema cen2 – GFP 17) i es van filmar les cèl·lules per fer kymographs . Durant la mitosi en absència de MBC, un únic punt Sfi1-CFP es va dividir en dos en l’inici mitòtic (fig. S4A suplementària). Simultàniament, els focus cen2 – GFP van començar a oscil·lar entre els dos SPB fins a la metafase. Els punts cen2 – GFP es van separar després cap cada SPB (anafase A), i la distància inter-SPB va augmentar, el que reflecteix l’allargament de la claveguera (anafase B) 17, 18. Es va observar una cinètica similar durant MII (WT MII, -MBC, fig. 2a). Quan es va agregar MBC a l’inici mitòtic, els SPB van deixar de dividir-se i els focus cen2 – GFP van cessar d’oscil·lar (fig. S4B complementària), el que va provocar una fallada en la segregació de cromosomes. En contrast, el 80% dels zigots MII tractats amb MBC van segregar cen2- GFP a dos pols (WT MII, + MBC, fig. 2a, b), el que indica novament que el MII és molt menys sensible a l’MBC que la mitosi i l’IM.

Image

(a ) Kymographs de cèl·lules de tipus salvatge (WT) i Mad2 under que experimenten MII en absència (-) o presència (+) de MBC (n ≥14). Els centròmers el cromosoma II es van marcar amb GFP (cen2- GFP; verd), i els seus SPB es van controlar amb Sfi1-CFP (vermell). Es va afegir MBC abans de la separació SPB. La longitud de les fletxes correspon a 5 min. (B) La precisió de la segregació de cromosomes durant MII en cèl·lules de tipus salvatge i Mad2 was es va quantificar (prova t de dues cues no aparellat, n ≥14). També es mostren imatges típiques per a la segregació de cen2- GFP igual i desigual. (C) La durada de MII es va mesurar a l’monitoritzar els senyals Cut11-3mRFP. Cut11-3mRFP va formar focus en les SPB a l’entrada de MII i va desaparèixer a l’inici de l’anafase. Les línies en el diagrama de caixa i bigotis de dalt a baix són el valor màxim, el percentil 75, la mitjana, el percentil 25 i el valor mínim (n ≥16). Els asteriscs indiquen valors atípics. (D) Localització de Mad2 durant MII en absència (esquerra) o presència (dreta) de MBC (n ≥10). Mad2-mCherry (Mad2-MCH; vermell) es va monitoritzar amb Mis6-2GFP (verd) i Sfi1-CFP (blau). El temps en què els focus Mad2 van aparèixer per primera vegada en els cinetocors es designa com 0 min. L’addició de MBC va retenir Mad2 en els cinetocors durant més de 12 minuts, moment en el qual els focus Mad2 es van traslladar a SPB en absència de MBC. Barres d’escala, 2 micres. (E) La durada de la localització de Mad2 en els cinetocors amb o sense MBC es va determinar a partir de les observacions en d. Recordeu que la localització Mad2-mCherry a SPB, el que significa un alliberament de l’activació del punt de control, no es compta aquí. Les línies en el diagrama de caixa i bigotis de dalt a baix són el valor màxim, el percentil 75, la mitjana, el percentil 25 i el valor mínim (n ≥10). Els asteriscs indiquen valors atípics. (F) La progressió meiòtica de l’cultiu sincrònic diploide pat1-114 es va monitoritzar comptant el nombre de nuclis per cèl·lula en cada punt temporal. La meiosi es va induir per canvi de temperatura (a les 0 h). Es va agregar MBC quan la població de cèl·lules binucleades (post-MI) estava en un màxim (a 3.3 h). (G) La viabilitat de les espores de les cèl·lules diploides pat1-114 tractades amb o sense MBC com a f es va examinar mitjançant anàlisi de tètrada (n > 300).

Imatge de mida completa

En la mitosi i l’IM, el punt de control de l’acoblament de l’fus (SAC) opera per monitoritzar la connexió dels microtúbuls als cinetocors. Els components de SAC, inclòs Mad2, reconeixen els cinetocors no units i inhibeixen l’activació de l’complex / ciclosoma promotor de l’anafase, de manera que les cèl·lules poden esperar en metafase fins que la unió millori 19. Durant la mitosi, MBC causa defectes en el fus i activa SAC 15, 20. És possible que l’activitat de SAC sigui necessària per al MII independent de ipMT causat per MBC.D’aquesta manera, supervisem el comportament de cen2- GFP en el mutant d’eliminació Mad2 (Mad2 Δ). En absència de MBC, els zigots Mad2 under van experimentar una segregació cromosòmica normal com en els zigots de tipus salvatge (Mad2 Δ MII, -MBC, fig. 2a, b). Quan es va agregar MBC a l’inici de la MII, ~ 60% dels zigots Mad2 exhib van mostrar una segregació desigual de cen2- GFP, que va ser significativament més gran que la segregació desigual ~20% que va ocórrer en els zigots de tipus salvatge (Fig. 2b ). Els zigots de tipus salvatge tractats amb MBC durant MII van mostrar un retard en l’inici de l’anafase II (fig. 2c). Això es va cancel·lar eliminant Mad2, el que indica que el retard es va deure a l’activació de l’SAC (fig. 2c). D’acord amb això, Mad2-mCherry va mostrar una localització prolongada de cinetocors en zigots de tipus salvatge en presència de MBC (fig. 2d, e). Aquests resultats indiquen que, durant la MII en presència de MBC, Mad2-SAC assegura la correcta unió dels microtúbuls als cinetocors, el que suggereix que els microtúbuls curts romanents que van sobreviure després de l’addició de la MBC efectivament serveixen com ktMTs i que la seva inclinació adequat a kinetochores desactiva la vigilància Mad2-SAC (fig. S3e, f) suplementària. Aquests resultats indiquen a més que és improbable que la divisió independent de ipMT sigui un desajust desregulat que doni lloc a una segregació aleatòria dels cromosomes i a el despreniment de l’nucli de manera inadequada, com les mutacions de tall letal.

A continuació, avaluem si el tractament amb MBC durant la MII podria afectar la viabilitat de les espores. El mutant pat1-114 es va usar per induir meiosi sincronitzada 21, 22, 23. Es va afegir MBC a les 3.3 h després de la inducció de la meiosi, quan la població de cèl·lules amb dos nuclis (és a dir, post-MI) estava en un màxim (~ 90%; Fig. 2f). La MBC va causar una reducció en la viabilitat de les espores a l’50% de la de les cèl·lules tractades de forma simulada (fig. 2 g). Aquest valor pot reflectir la fidelitat de la segregació cromosòmica: la freqüència de la segregació fidel de cen2- GFP en les cèl·lules MII tractades amb MBC va ser de l’80% (fig. 2b), el que implica que la freqüència estimada de la mateixa segregació de els tres cromosomes seria d’un 51% ((0.8) 3 = 0.512), que és comparable a la viabilitat de les espores observada en presència de MBC.

la membrana forespora és responsable de MII sense ipMTs.

Atès que les ipMT eren prescindibles per als esdeveniments MII, ens preguntem què podria servir com el pilar estructural per a separar les SPB i mantenir l’estructura bipolar independentment de les ipMT. Com MII està acoblat a la esporulació (l’esdeveniment terminal en la meiosi corresponent a la gametogènesi en els eucariotes superiors), sospitem que algun sistema citoesquelético relacionat amb l’esporulació podria estar involucrat en els esdeveniments independents de ipMT. Un candidat podria ser la membrana de l’espora, que és un precursor de la membrana plasmàtica de l’espora que envolta els nuclis durant la MII 24. La membrana de les espores es va visualitzar amb la proteïna t-SNARE etiquetada amb GFP Psy1 / Sintaxina 1 (GFP-Psy1) 25. Com es va informar anteriorment 26, la membrana de les foresporas va començar a acoblar-al voltant de les SPB en forma de mitja lluna després que es van separar mitjançant ipMT (15 min; Fig. 3a). La membrana gradualment va encapsular els nuclis a mesura que avançava l’anafase II (36 min i 72 min). No obstant això, en els zigots tractats amb MBC, la separació de SPB sense ipMT es va produir simultàniament amb l’inici de l’creixement de la membrana de les espores (30-35 min; Fig. 3a). La membrana de les espores continuar creixent i finalment envoltar els dos nuclis, el que va resultar en la seva divisió (100 min). Això ens va portar a la hipòtesi que, en absència de ipMTs, la membrana de la forespora pot servir com un esquelet estructural, el creixement cap a l’exterior podria generar una força que separa les SPB i restringeix el nucli.

Image

(a) Imatges de cèl·lules vives de zigots MII que porten GFP-Psy1 (membrana d’espores; verd) i CFP-Atb2 (vermell) en absència de MBC (a dalt) (n = 18). Es va afegir MBC abans de l’aparició de MII (part inferior) (n = 18). La separació de SPB es va produir concomitantment amb l’inici de l’acoblament de la membrana de les espores. (B) Es va filmar MII de cèl·lules spo15 Carrying que portaven GFP-Atb2, Mis6-2mCherry (Mis6-2mCh) i Sfi1-CFP en presència de MBC (n = 10). Els SPB no s’havien separat a la fi de l’observació (94 min). (C) El mutant doble spo15 Δ cut7-446 que porta GFP-Atb2, Mis6-2mCherry i Sfi1-CFP se sotmet a MII a la temperatura restrictiva.El doble mutant va exhibir el fenotip de l’fus monopolar (n = 8), el que indica que la membrana de la forespora té un paper crucial en la formació de l’fus bipolar durant la MII en les cèl·lules cut7-446. (D) Patrons de segregació de cromàtides germanes durant MII en zigots de tipus salvatge i meu14 Δ spn6 monitored monitoritzats per cen2- GFP amb Sfi1-CFP (prova de t de dues cues no aparellat, n ≥14). També es mostren imatges típiques per a la segregació de cen2- GFP igual i desigual. (E) La divisió nuclear durant MII de zigots de tipus salvatge i meu14 Δ spn6 Δ es va monitoritzar mitjançant Cut11-mCherry (Cut11-MCH); les cèl·lules es van classificar com sotmeses a divisió normal, divisió anormal o sense divisió (n ≥18). També es mostren imatges típiques de cada categoria. (F) L’anell de la vora anterior format sobre el nucli es va visualitzar amb Meu14-mCherry (Meu14-MCH) (n ≥ 24). (A dalt, esquerra) En absència de MBC, els anells de la vora d’atac es van formar després de la separació de SPB. (A dalt, dreta) En presència de MBC, els anells de la vora anterior formats de cada SPB es van posar en contacte entre si, el que es va mantenir durant la separació de SPB (indicada per un marcador de SPB, Cut12-CFP) i el creixement de la membrana de les espores (visualitzat amb GFP). -Psy1). També es mostren els dibuixos esquemàtics dels nuclis (taronja) i els anells de la vora d’atac (vermell). (Part inferior) El complex d’Septina es va visualitzar amb Spn6-mCherry (Spn6-MCH) (n ≥ 8). (A baix a l’esquerra) En absència de MBC. (A baix a la dreta) En presència de MBC. També es mostren els dibuixos per als nuclis (taronja) i el complex de Septina (vermell). Barres d’escala, 2 micres.

Imatge de mida completa

Si la membrana de foresporas impulsa la separació de SPB en absència de ipMT, la inhibició simultània de la membrana de foresporas i la formació de microtúbuls la dificultarà. Per provar aquesta possibilitat, utilitzem el mutant spo15 Δ, en què els SPB no es modifiquen adequadament i la membrana de la forespora no s’acobla en ells 27. La separació de SPB mai es va observar en les cèl·lules spo15 treated tractades amb MBC (94 min; Fig. 3b), el que demostra que, de fet, va ser la membrana de la forespora la que va impulsar la separació de SPB en absència de ipMT. A més, no es va observar segregació de cromosomes ni divisió nuclear. De manera similar, la separació SPB que va tenir lloc durant la MII en els zigots cut7-446 va ser bloquejada per l’eliminació spo15 (fig. 3c). Per tant, la membrana de la forespora compensa els defectes estructurals de l’fus bipolar causats per una pèrdua de ipMT o una falla en el lliscament dels microtúbuls antiparalelos. Tant les cèl·lules spo15 treated tractades amb cèl·lules MBC (fig. 3b) com les cèl·lules spo15 7 cut7-446 (fig. 3c) no van aconseguir separar les SPB, segregar els cromosomes i dividir el nucli, encara que aquestes cèl·lules tenien microtúbuls romanents al voltant de les SPB. Aquestes observacions demostren que aquests esdeveniments meiòtics independents de ipMT estan controlats únicament per la membrana de les espores, però no pels ktMT restants.

L’anell d’avantguarda i el complex septin.

la vora de creixement de la membrana de foresporas està vorejat per l’estructura de la vora d’atac, que conté proteïnes com Meu14 (refs 28, 29) i està suportat pel complex de septinas 30 (Spn2, Spn5, Spn6 i Spn7). Tant l’estructura d’avantguarda com el complex de Septina són necessaris per a navegar pel creixement de la membrana de les espores en la direcció correcta 30. Bloquegem la funció de les dues estructures mitjançant l’ús de l’doble mutant meu14 Δ spn6 dis per desorientar el creixement de la membrana de l’espora. Les cèl·lules meu14 Δ spn6 treated tractades amb MBC podrien separar SPB durant el MII en certa mesura, probablement perquè la membrana de la forespora es podria acoblar inicialment sense septinas i Meu14. Aquestes cèl·lules, però, amb freqüència van fallar en la segregació de les cromàtides germanes per igual i en l’execució de la divisió nuclear (fig. 3d, e).

Significativament, els anells de vora anterior formats a partir de tots dos SPB van fer i van mantenir contacte físic entre si quan els SPB es van separar en absència de ipMT (fig. 3f). El complex de Septina visualitzat per Spn6-mCherry també va aparèixer simultàniament amb l’aparició d’anells de vora d’atac per alinear la membrana de l’espora (fig. 3f). Aquests resultats en conjunt proporcionen evidència genètica i visual que la membrana de la forespora correctament orientada per l’anell de la vora d’atac genera una tensió interpolar, el que de fet condueix a una separació constant dels SPB, la segregació de cromosomes i la constricció nuclear. L’anell de la vora d’atac que conté Meu14 està recolzat amb F-actina 31.Quan la polimerització d’actina es va inhibir amb la latrunculina A en presència de MBC, l’anell de la vora d’atac no es va contraure i va fracassar en la segregació de cromosomes i la divisió nuclear, tot i que es va produir una separació de SPB (fig. S5 complementària) . Aquest fenotip és similar a el de meu14 Δ spn6, validant la relació funcional de l’anell de la vora d’atac i l’actina.

Contribució de la membrana de la forespora a l’MII fisiològic.

Tots els resultats anteriors suggereixen que la membrana de les espores funciona com un dispositiu estructural que ajuda a l’fus. Per provar si la maquinària intervinguda per la membrana de les espores també contribueix a la MII fisiològica, en la qual els microtúbuls no estan pertorbats, utilitzem el mutant spo15 Δ, que no forma la membrana de l’espora. Encara Spo15 no és essencial per a la progressió de MII 27, ens centrem particularment en la fidelitat de la separació de SPB mitjançant el monitoratge d’un component de l’complex de porus nuclear, Cut11-3mRFP. Aquesta proteïna es localitza en els SPB quan estan incrustats en l’embolcall nuclear a l’inici de la fase M 32 (fig. 4a) i ja no tenen relació amb ells a l’inici de l’anafase. Per a cada nucli, vam registrar el temps de separació de SPB com dictamina la divisió de l’enfocament Cut11-3mRFP únic. Sorprenentment, les cèl·lules spo15 during durant MII ocasionalment van mostrar la desaparició d’un sol punt Cut11 sense separació, el que suggereix que la separació de SPB no va passar en MII (fig. 4a i Taula 1). No es va observar cap error en la separació de SPB durant la mitosi i el MI en cèl·lules spo15 Δ (fig. 4a i Taula 1). Per tant, la membrana de les espores, a l’almenys en part, contribueix a la separació eficient de SPB durant la MII fisiològica.

Image

(a) el comportament de Cut11-3mRFP es va filmar en cèl·lules de tipus salvatge i spo15 at a l’inici de la mitosi i MII (n ≥ 26). En les cèl·lules de tipus salvatge (WT), Cut11-3mRFP es va localitzar constitutivament en l’embolcall nuclear i va formar focus addicionals en les SPB a l’entrada mitòtica / MII; aquesta localització va continuar a través de la separació SPB (visible com dos focus) i va desaparèixer a l’inici de l’anafase. No obstant això, en les cèl·lules spo15 Δ a l’entrada MII, els focus Cut11-3mRFP ocasionalment van desaparèixer sense dividir-se, la qual cosa indica una fallada en la separació de SPB per l’inici de l’anafase (26-29 min). (B) Kymographs de lapse de temps que mostren la cinètica de l’fus durant MII en cèl·lules de tipus salvatge, spn6 Δ i meu14 Δ spn6 ((n ≥8). Un dels dos punts Cut12-CFP (SPB) en cada punt de temps es van alinear a la part inferior de la imatge per aclarir un increment de la distància inter-SPB. la longitud de les fletxes correspon a 5 min. Barres d’escala, 2 micres. (c) es van representar gràficament les cinètiques de les SPB a cèl·lules de tipus salvatge, spn6 Δ i meu14 Δ spn6 observed observades en b. Cada línia representa la cinètica per un sol nucli (n ≥8).

Imatge de mida completa

Taula de mida completa

per investigar més a fons si el creixement de la membrana de les espores contribueix a la separació de SPB durant la MII fisiològica, monitoritzem la cinètica de la distància inter-SPB (marcada per Cut12-CFP ). la distància inter-SPB va augmentar amb el temps de manera gradual durant la MII en cèl·lules de tipus salvatge, com va passar durant la mitosi (Fig. 4b, c). En contrast, el creixement desorientat de la membrana de les espores en les cèl·lules meu14 Δ spn6 was es va associar freqüentment amb una fluctuació en la distància inter-SPB (fig. 4b, c). Es va observar una fluctuació similar però menys notable en el mutant únic spn6 ((fig. 4b, c), el que indica que Meu14 i Spn6 funcionen en la guia de la membrana de les espores en una ruta paral·lela 30 (fig. 5a per a un esquema). la velocitat de separació de SPB a les cèl·lules meu14 Δ spn6 could podria ser transitòriament més ràpida que la de les cèl·lules de tipus salvatge (fig. 4c), probablement pel fet que el creixement desorientat de la membrana de forespora en elles va forçar una separació ràpida de les SPB. Aquests resultats demostren que la dinàmica de la membrana de les espores contribueix efectivament a la cinètica de la separació de SPB durant la MII en condicions fisiològiques. a més, les cèl·lules meu14 Δ spn6 showed van mostrar una divisió anormal en fins a el 20% dels nuclis de MII, el que suggereix la importància de l’organització adequada de la membrana de les espores per a una constricció precisa de l’nucli.

Image

(a) Il·lustració esquemàtica de la funció de les septinas i les proteïnes d’avantguarda (LEP) en l’acoblament de la membrana de les espores.Els septins i els LEP tenen un paper important en l’orientació de la membrana de les espores. En el tipus salvatge (WT), la vora de creixement de la membrana de la forespora està vorejat per Leps que inclouen Meu14 per orientar i constrènyer adequadament la membrana de la forespora. El complex de Septina meiòtica (Spn2, Spn5, Spn6 i Spn7) orienta la direcció de creixement de la vora. Els Septins i els LEP controlen cooperativament la direcció de el creixement de la membrana de la forespora. El fenotip deficient en l’esporulació és més prominent quan spn6 combined es combina amb meu14; per tant, el mutant doble meu14 Δ spn6 was es va utilitzar en aquest estudi com un cep que no té septinas i LEP. En les cèl·lules meu14 Δ spn6, la membrana de les espores no pot encapsular adequadament el nucli, el que porta a la producció d’espores defectuoses. (B) Aquest estudi proposa un nou paper per a les septinas i les LEP en la segregació de cromosomes i la divisió nuclear durant la MII. En absència de ipMTs (WT + MBC), la membrana forespora, que comença a acoblar a partir de les SPB, divideix les SPB. La membrana de les espores és guiada després per estructures que contenen septinas i LEP per envoltar el nucli. Quan s’afegeix MBC a les cèl·lules meu14 Δ spn6 ((meu14 spn6 Δ + MBC), l’acoblament de la membrana de la forespora està desorientat i no es produeix la segregació dels cromosomes ni la divisió nuclear. Com els SPB que emanen dels microtúbuls estan connectats a la membrana de les espores, el seu acoblament no coordinat pot afectar l’eficiència i la fidelitat de la unió dels microtúbuls kinetochore. a més, les septinas i les LEP restringeixen el nucli lliure de ipMT a l’generar una força que normalment es fa servir per encapsular el nucli després de la divisió nuclear intervinguda per ipMT en MII de tipus salvatge.

Imatge de mida completa

Discussió

Hem demostrat la funció sense precedents de la membrana de les espores en la separació de SPB, la segregació de cromosomes i la divisió nuclear durant la MII. Proposem que, en l’etapa inicial de MII, la membrana de foresporas en desenvolupament genera una força de separació de SPB des de les SPB aparellades ha cia fora al llarg de la membrana nuclear, i després dóna suport al fus bipolar per a una eficient segregació de cromosomes. En absència de ipMT, les estructures de vora d’avanç desenvolupades a partir de les dues SPB xoquen, i la seva força de repulsió genera una tensió física entre les SPB (fig. 5). L’aparell de divisió intervingut per la membrana de les espores, reforçat per l’estructura de la vora d’atac i les septinas, pot facilitar la segregació per igual dels cromosomes i la constricció de l’embolcall nuclear, fins i tot en absència de ipMT. Curiosament, es va requerir que Mad2-SAC assegurés el moment adequat de la segregació de cromosomes en absència de ipMT, el que implica que la constricció nuclear intervinguda per la membrana de les espores podria estar regulada pel complex promotor de l’anafase / ciclosoma. Sobre la base de la capacitat de la membrana de les espores per compensar l’absència de ipMT durant MII, creiem que les funcions crucials de les ipMT són les següents: ancorar els pols de l’fus a l’embolcall nuclear per assegurar la força de la segregació de els cromosomes i dividir el nucli en anafase.

$ config not found

la divisió cel·lular sense l’homòleg de tubulina FtsZ es produeix en soques del bacteri Bacillus subtilis que són defectuoses en l’organització de la paret cel·lular 33. S’ha informat recentment que es produeix una divisió nuclear independent dels microtúbuls (fissió nuclear) en la mitosi de S. pombe quan la citocinesi (formació de la paret cel·lular en la sortida mitòtica) s’inhibeix artificialment 16, encara que no està clar com es genera la força. En aquest estudi, hem aclarit la mecànica per generar la força necessària per a la divisió nuclear sense ipMT durant la MII: el contacte físic de les vores de la membrana de les espores és el pivot. En contrast amb els estudis previs per a la mitosi, la força intervinguda per la membrana de les espores contribueix aparentment a la MII fisiològica.

Especulem que aquesta maquinària intervinguda per membranes d’espores pot haver-se desenvolupat com un sistema de suport per a la segregació de cromosomes durant la MII, en la qual l’estructura de l’fus pot no ser tan robusta com ho és durant la mitosi o l’IM. L’eix meiòtic es construeix primer durant l’IM i després es desmunta, seguit de la reconstrucció durant el MII. En particular, MII és una “meiosi virtualment oberta” en què les proteïnes nuclears es dispersen fora de l’nucli durant l’anafase 34, 35. Aquestes situacions poden implicar que l’organització de l’fus podria ser menys eficient en MII que en la mitosi.D’altra banda, MII ha acoblar-se amb l’encapsulació dels nuclis germans per la membrana de les espores. Per tant, la membrana de forespora pot haver necessitat la capacitat de generar una força que ajudi a les funcions de l’fus. L’estructura de la membrana que involucra proteïnes d’avantguarda i septinas ha adquirit una funció dual: l’encapsulació de l’nucli i l’assistència de la segregació de cromosomes. És interessant observar les similituds i diferències entre aquesta estructura i la matriu de l’fus, que se suposa que manté l’estructura de l’fus en eucariotes superiors, com un esquelet fet de materials que no són microtúbuls 36. Una organització membranosa que inclou la làmina B s’ha demostrat recentment que funciona com una matriu de fus que envolta tot el fus de la prometafase per mantenir la seva estructura 37, 38, 39. No obstant això, a més de ser una bastida estructural, la membrana forespora pot generar una força per a la separació de SPB i la divisió nuclear. Els eucariotes superiors poden haver desenvolupat una maquinària dependent dels microtúbuls com el dispositiu avantatjós generador de força, i la matriu de l’fus membranós pot haver-se diferenciat com una estructura de suport.

Ceps de llevat i procediments genètics.

Els ceps utilitzades en aquest estudi s’enumeren a la Taula complementària S1. Els mètodes estàndard basats en PCR per a l’orientació de gens 4, 40 es van utilitzar per construir alteradors de gens i ceps marcades amb proteïnes fluorescents amb cassets de gens marcadors de selecció, excepte la soca 26 de GFP-Psy1, que es va construir mitjançant la integració d’un plasmidi que conté Construcció de fusió GFP-Psy1 (un regal de T. Nakamura). A. Yamamoto 17 va proporcionar el cep cen2 – GFP. Breument, les seqüències de Laco repetitives es van inserir a prop de la regió centrómera de l’cromosoma II (cen2), que va ser reconeguda per una proteïna de fusió Laci-senyal de localització nuclear-GFP coexpressada. Per a la inducció de la meiosi, es van observar cèl·lules h 90 homotálicas en el medi d’agar de esporulació per a tots els experiments, excepte per a la prova de viabilitat d’espores que es mostra a la Fig. 2f, g (veure a continuació).

Sincronització de meiosi i prova de viabilitat d’espores.

per a la prova de viabilitat d’espores (fig. 2f, g), utilitzem un sistema per induir meiosi sincronitzada utilitzant el diploide (h – / h -) pat1-114 + mat-Pc cep 41, determinant així quan la població binucleada estava en el seu punt màxim (i per tant quan afegir MBC). Per controlar la progressió meiòtica amb el nombre de nuclis, les cèl·lules es van tenyir amb 4 ‘, 6-diamino-2-fenilindol després de fixar-se en metanol a l’50%. La viabilitat de les espores es va examinar mitjançant anàlisi de tètrada. Les espores van ser germinades en el medi ric en extracte de llevat. La viabilitat és la mitjana de tres experiments independents.

Microscòpia

Per a l’obtenció d’imatges de cèl·lules mitòtiques de cèl·lules vives, es van utilitzar cèl·lules de creixement logarítmic cultivades al mig definit sintètic ric en tiamina a 30 ° C durant ≥13 h. Per a l’obtenció d’imatges de cèl·lules vives de cèl·lules en meiosi, es van utilitzar zigots localitzats en el medi d’agar de esporulació a 25 ° C durant ≥8 h. Es van observar cèl·lules vives en el medi mínim d’Edimburg amb o sense una font de nitrogen per analitzar el cicle mitòtic o la meiosi, respectivament. Les imatges de cèl·lules vives es van realitzar com es descriu 4 en un sistema DeltaVision-SoftWoRx (Applied Precision) usant un microscopi (IX71, Olympus) equipat amb isotiocianat de fluoresceïna, mCherry i filtres de CFP (tecnologia Chroma), un Pla Apo N × 60 (NA, 1.42) o una lent objectiu d’immersió en oli UPlan gripau × 100 (NA, 1.40) (Olympus), una càmera CoolSNAP HQ2 (fotomètrica) i un controlador de temperatura (Precision Control) a 25 ° C, excepte les figs 1g i 3c i figs suplementàries S2 i S3e, f (32 ° C es van usar per al mutant sensible a la temperatura cut7-446 i nuf2-1). z -Secció es va dur a terme en intervals de 0, 4 o 0, 5 μ m, i les imatges es van prendre cada 1 a 5 min. Les imatges es deconvolvieron i es va crear una projecció z- stack amb el mètode de suma o màxim. El canvi de temperatura per als mutants sensibles a la temperatura es va realitzar a l’mínim 1 h abans de l’observació.

Tractament de drogues

En imatges de cèl·lules vives, les imatges per primera vegada es van prendre sense MBC. Després es va afegir MBC (Sigma-Aldrich) a una concentració final de 50 mg ml -1 en tots els experiments. Es va afegir latrunculina A (Invitrogen) a una concentració final de 50 micres a l’mínim 1 h abans de l’obtenció d’imatges de cèl·lules vives.

Estadística

Es va utilitzar una prova t de dues cues no aparellada per a les anàlisis estadístiques.

Informació suplementària

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *