Anàlisi de la variació intraespecífica de Conidiobolus coronatus usant RAPD i seqüències ITS | Malalties Infeccioses i Microbiologia Clínica

Introducció

Conidiobolus coronatus (C. coronatus) (entomophthorales) és un fong cosmopolita i patogen d’insectes de diferents órdenes1; s’ha trobat sobre fusta en descomposició, fullaraca, suelo2 i també com a patogen de mamífers, incloent a l’home, a qui produeix rinoentomoftoromicosis, que afecta la superfície de l’tracte respiratori, pot danyar la mucosa nasal i paranasal i fins i tot estendre a la pell de la nas, llavi superior i àrea fronto-glabelar3.

L’informe de dany en humans és poc freqüent i es restringeix a regions amb climes tropicals i d’alta humedad4. L’extensa distribució de C. coronatus i els pocs casos de rinoentomoftoromicosis reportats suggereixen que no tots els aïllaments són patògens per a l’humà i animals superiores3,5.

A la planta de producció de xampinyons (Agaricus bisporus) Fongs Rioxal (Perote, Veracruz, Mèxic) es va detectar un brot epizoótico de C. coronatus sobre mosques de l’espècie Lycoriella ingènua (L. ingènua), considerada la principal plaga de l’champiñón6. El xampinyó es produeix en naus tancades que presenten condicions similars a un clima tropical húmedo7 i en les que hi ha mosques infectades per C. coronatus. Els treballadors s’exposen a dos factors per períodes perllongats, el que implica que es troben en contacte amb les espores de fong i, tot i això, no existeixen informes de rinoentomoftoromicosis originats en plantes de producció de xampinyó.

La relació entre C. coronatus i la seva àmplia gamma de hospederos és digna d’estudi i es pot considerar un indici de variació intraespecífica. Basat en l’anterior, l’objectiu d’aquest treball va ser investigar si existeix o no variació genètica entre aïllaments de C. coronatus provinents de lesions en humans i altres fonts (sòl, insecte, compost).

Per a determinar la variabilitat genètica entre aïllaments provinents de diferents hospederos es requereix d’l’ús de tècniques moleculares8. El espaiador intern transcrit (ITS per les sigles en anglès) és el locus més popular en la investigació micològica basada en seqüències; és el més reeixit per a la identificació d’un gran nombre de fongs, de manera que s’ha designat com un marcador d’ADN d’el codi de barres universal per fongs; a més, la seva provada capacitat per a l’estudi de la variació inter- i intraespecífica el converteix en una eina molt poderosa9-12. De la mateixa manera, la tècnica de polimorfisme derivat de l’amplificació aleatòria d’ADN (RAPD per les sigles en anglès) ha adquirit diversos usos en l’estudi de la diversitat genètica; en els fongs ha estat utilitzada amb èxit principalment en estudis intraespecíficos13. Es van implementar aquestes 2 tècniques en 11 aïllaments de C. coronatus i els seus resultats es van analitzar i discutir en termes de la distància genètica segons la font de la qual van ser aïllats (sòl, insecte i humà).

Materials i métodosAislamientos

Es van usar 11 aïllaments de C. coronatus; 8 d’ells es van obtenir de col·leccions públiques i 3 es van aïllar per compte propi (Lyco 1, 4 i 5). Tots es van processar per analitzar-los amb les tècniques RAPD i amplificació de la regió ITS1-5.8S rADN-ITS2 (introns situats entre els gens rADN 28S i 18S). La llista de tots els aïllaments i la font que es van prendre es mostra a la taula 1.

Els aïllaments de C . coronatus Lyco 1, 4 i 5 és van obtenir a la planta de PRODUCCIÓ de xampinyons Fongs Rioxal (Segons Mètode de Papierok Hajek14 i), és va detectar on el brot epizoótico d’ONU Sobre fong entomopatógeno mosques de l’espècie L. ingènua, Que va ser per l’especialista IDENTIFICAT Arthur A. Callaghan CoM C. coronatus. Tots per la aïllaments van presentar les característiques morfològiques pròpies de l’espècie (per Exemple, vellosos conidis produïts només per espècie AQUESTA). Van realitzar és tan postulats de Koch i Amb Ells Que es va comprovar C. coronatus SER l’agent causal de la MALALTIA Sobre la L. ingènua.

Els aïllaments d’11 C. coronatus és la van mantenir, temperatura ambient i en un preservar aigua destil·lada estèril. Per a la seva Desenvolupament, és inocular en MEDI dextrosa Sabouraud agar a 25 ° C

Extracció d’ADN

Es obtuvó miceli liofilitzat dels 11 aïllaments de C. coronatus SEGUINT pel Mètode descrit Guzmán-Franco et al.15 . L’ADN és extreure Mitjançant El Mètode de CTAB (bromur de hexacetiltrimetilamonio) Modificat de Ahrens i Seemüller16. El macerat és col·loco En un tub Eppendorf gos 400μl de Solució de lisi (sodi clorur de 0,4 M, 10 mm Tris-HCl, 2 mM EDTA, 1% de PVP) es va barrejar i Amb Un agitador vòrtex homogeneïtzar par. De seguida és van agregar 50? L de SDS a l’20%, 40? L de proteinasa K (10 mg / ml) i es incubo a 65 ° C Durant Una Hora. Després és agregar Solució 600ul de 3% CTAB (Sigma Chemicals, EE. UU.) I és incubo Novament Durant 45 min a 65 ° C. Posteriorment és va addicionar volum de les Nacions Unides de cloroform isoamílic i alcohol (24: 1), i és va barrejar centrífug 10 minuts a 14.000rpm, on és van formar 2 fases; La fase aquosa és col·loco En un tub Eppendorf amb volum de les Nacions Unides i de isopropanol és incubo a -20 ° C per 60 min; DESPRÉS és centrífug 10 minuts a 14.000rpm. ADN resuspès el ser En 50? L d’Aigua destil·lada estèril; Concentració i la Qualitat de l’ADN és estimo Amb Un NanoDrop ND-1000 V3.7 (Thermo Scientific®, EE. UU.). Per Darrer, l’ADN és va visualitzar En un gel d’agarosa a l’1% de X 1 en tampó TBE (Tris0,089M, Àcid bòric 0,089M, 0,002M EDTA) bromur gos tenyit d’etidi (0,5μg lloguer d’1 per 10 minuts) I amb un és fotografiar fotodocumentador-Gel Doc MOD. 2000 (Bio-Rad®, EE. UU.).

Amplificació RAPD

La Reacció en cadena de la polimerasa (PCR Per Les seves sigles en espanyol) és Realitzo En un termociclador meu Thermal Cycler ™ termociclador Bio-Rad 580BR model 09275. Es van usar tubs d’Eppendorf 0,5ml; volum El Final de la Barreja FUE 25? l / i PCR contenia 4μl d’ADN (80ng / ml), tampó 10X, clorur de magnesi 3 mM, 2,5 mm Cada de dNTP (gen Choice), 1,5 U de Taq polimerasa (biogènica) Cada i 2μl d’Iniciador (10 pmoles).Es van utilitzar iniciadors aleatoris de la sèrie A de Operon Technology® i de la sèrie B de Invitrogen (taula 2). De 19 iniciadors provats, només aquells que van donar resultats reproduïbles (3 amplificacions) es van utilitzar en l’anàlisi RAPD, de manera que a la fi es van seleccionar 13.

El programa d’amplificació va ser d’un cicle de desnaturalizac ió inicial a 94 ° C per UNMIN, seguit de 38 cicles de desnaturalització a 94 ° C per 30 s, hibridació a 35 ° C per 30 s, i extensió a 72 ° C per 1,5min, seguit d’una extensió final a 72 ° C durant 5 min. La mida dels fragments amplificats es va estimar utilitzant un marcador de pes molecular de 1kb (QIAGEN). En l’amplificació de cada iniciador es van utilitzar com a testimonis Zoophthora radicans (aïllat de Plutella xylostella) i Cercospora agavicola (aïllat d’Agave tequilana) (fig. 1), que no es van incloure en l’anàlisi de dades RAPD. El maneig d’aquests aïllaments (creixement i extracció d’ADN) es descriu en Guzmán-Franco et al.15 i Ayala-Escobar et al.17.

Anàlisi de dades RAPD

La presència o absència de patrons de bandes RAPD es va considerar com un caràcter independent i es va analitzar visualment a partir de fotografies dels gels d’agarosa; la presència es registrava amb 1 i l’absència amb 0. Amb aquests resultats es va construir una matriu binària on es trobaven els polimorfismes de cada un dels iniciadors. A partir d’aquesta matriu de similitud i de el coeficient d’aparellament simple, es va construir un dendrograma; per generar i visualitzar les relacions es va usar NTSYS 2.0. Per obtenir un dendrograma de major solidesa es van realitzar 1.000 rèpliques Bootstrap (BS) amb Winboot.

Amplificació de la regió ITS

Es van amplificar les regions ITS1-5.8 ADNr-ITS2 de l’ADN ribosomal per als 11 aïllaments de C. coronatus usant els iniciadors universals ITS 5 (5’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) i ITS 4 (5’TCCCCGCTTATTGATATGC) 18. Les amplificacions es van realitzar en tubs Eppendorf de 0,5ml i el volum final de la mostra per reacció va ser 25μl. Cada reacció contenia 2μl d’ADN (80ng / ml), buffer 10x, clorur de magnesi 2,6mM, 2,5 MM de cada dNTP (Gene Choice), 1,5 U / ml de Taq polimerasa, 2μl de cada iniciador (20pmol) . Els tubs testimonis contenien aigua destil·lada estèril en lloc d’ADN.El programa d’amplificació va ser d’un cicle de desnaturalització inicial a 95 ° C per 5min, després 35 cicles de desnaturalització a 95 ° C per 30 s, hibridació a 50 ° C per UNMIN, extensió a 60,3 ° C per 1,5min i una extensió final a 72 ° C durant 5 min. La mida dels fragments amplificats es va estimar utilitzant marcadors de pes molecular de 1kb i 100 pb (QIAGEN).

Per trobar diferències a nivell de nucleòtids entre els aïllaments, els productes de PCR-ITS es van enviar per a la seva neteja i seqüenciació a l’empresa Macrogen (Corea). La seqüenciació es va realitzar en dues direccions usant els iniciadors universals 4 i 518.

Anàlisi de dades de la regió ITS

Les 11 seqüències d’ITS es van editar manualment amb Bioedit i FinchTV 1.3. L’alineament múltiple de seqüències es va realitzar amb Clustal W. Les seqüències es van dipositar en el NCBI Genbank (taula 1). Per construir un arbre filogenètic més fiable, addicionals a les 11 seqüències de C. coronatus obtingudes en aquest estudi, es van utilitzar 3 seqüències de C. coronatus i una de Conidiobolus thromboides de l’NCBI Genbank (taula 1).

la selecció de C. thromboides com a grup extern es va fer a partir d’un blast (NCBI Genbank) amb les 11 seqüències de C. coronatus i una anàlisi de parsimònia, els resultats van llançar que està estretament emparentat amb C. coronatus però és diferent a la regió ITS.

amb MEGA5 es va construir un arbre filogenètic amb els mètodes de màxima parsimònia, neighbour-joining (NJ) i mínima evolució; en els 2 últims es va usar el model de Tamura-Nei. Per avaluar la confiança de la relacions filogenètiques; la solidesa dels nodes es va estimar per anàlisi BS amb 2.000 rèpliques.

Per analitzar més a fons la diversitat genètica dels aïllaments, les seqüències d’ITS es van agrupar d’acord amb el seu substrat o hospedero: 1) insecte , 2) sòl, 3) humà i 4) compost; amb el programa MEGA5 es va fer un recompte per determinar el nombre de llocs variables a l’interior de cada grup i entre tots els grups, així com la regió en la qual es trobaven (ITS1-5.8S rADN-ITS2) (taula 3). Per aquestes 2 avaluacions no es va considerar a el grup extern.

ResultadosAnálisis RAPD

Els iniciadors seleccionats van amplificar 48 bandes amb una variació polimòrfica de 22 a 100%; es van obtenir 34 bandes polimòrfiques, resultant en 70,83% de polimorfisme; es van obtenir de 2 a 9 bandes per iniciador (taula 2). La figura 1 mostra els patrons de bandeig obtinguts per l’amplificació amb l’iniciador A18 i s’aprecia la diferència genètica entre els aïllaments avaluats procedents de diferents fonts.

El dendrograma construït a partir de l’anàlisi dels patrons de bandeig obtinguts amb els 13 iniciadors revela la formació de 4 grups principals (A, B, C i d) amb un 40% de similitud. Els resultats indiquen un alt nivell de diversitat genètica. L’estabilitat dels agrupaments obtinguts es va avaluar amb una anàlisi BS amb 1.000 rèpliques (fig. 1). El grup A inclou 8 aïllaments dividits en 2 subgrups, i i ii; el subgrup i conté els aïllaments obtinguts de L. ingènua Lyco 1, Lyco 4 i Lyco maig (Lyco 1 i Lyco 4 tenen un 100% de similitud); el subgrup ii està format pels aïllaments de sòl staffs 4: 004, staffs 15: 008, staffs 1: 037, staffs 10: 027 i staffs 04: 427 (staffs 4: 004, staffs 15: 008 tenen un 100% de similitud ). El grup B només inclou l’aïllament ARSEF 1884 pres de Mocis latipes, amb 80% de similitud. El grup C només inclou l’aïllament ARSEF 512 provinent de Nilaparvata lugens, amb 50% de similitud. En el grup D només hi ha el aïllament ATCC 32865 provinent de lesions humanes, amb 40% de similitud, i aquest presenta la major distància genètica respecte de la resta dels aïllaments (fig. 2).

Anàlisi de la regió ITS

els iniciadors ITS usados18 amplificar un fragment de 666 pb (els espais es van considerar com llocs informatius) corresponent a les regions ITS1-5.8S rADN-ITS2 en els 11 aïllaments avaluats. La longitud de cadascuna de les regions va ser homogènia en tots els aïllaments: ITS1 223 pb; 5.8S rADN, 155 pb; ITS2, 288 pb. L’alineament i anàlisi de la seqüències amb el programa MEGA5 de la regió ITS1-5.8S rADN-ITS2 d’aïllaments de C. coronatus (taula 1) mostra 69 llocs variables entre els 14 aïllaments. D’aquests, 40 es troben en ITS1, convertint-la en la regió més polimòrfica, tant de tots els grups com dels aïllaments de cada grup. La regió 5.8S és la més conservada, ja que només presenta 3 llocs variables entre els 14 aïllaments. A l’interior de cada grup també hi va haver diferències en el nombre de llocs variables totals, sent el grup procedent d’insectes el de major nombre (29) i el grup d’humans el més homogeni (5) (taula 3).

la variabilitat de la regió ITS va proporcionar informació sobre els patrons de diversificació de C. coronatus. Es va construir un arbre filogenètic amb els mètodes estadístics de màxima parsimònia, neighbour-joining (NJ) i mínima evolució i usant a C. thromboides com a grup extern. Es va obtenir el mateix resultat amb les 3 aproximacions tant en la topologia com en el suport de les branques (valor BS); la regió ITS va diferenciar clarament a C. coronatus de C. tromboides (espècie properament relacionada). A la figura 3 es mostra l’arbre resultat de l’anàlisi de NJ.

Les distàncies genètiques entre aïllaments es representen per la longitud de la branca dels grups que es formen. Es van formar els grups A, B i C. El grup A inclou 10 aïllaments dividits en els subgrups i i ii; el subgrup i conté els aïllaments Lyco 1, Lyco 4 i Lyco maig (obtinguts L. ingènua), FSU 784 (obtingut de compost de xampinyó) i P1 (obtingut d’insecte). En el subgrup ii es troben els aïllaments staffs 4: 004, staffs 15: 008, staffs 10: 027, staffs 1: 037 i staffs 04: 427 (obtinguts de sòl); el valor BS de el node que uneix els subgrups I i II és baix (44%), però el valor BS de el node que uneix els aïllaments de l’subgrup i és de 79% i d’el subgrup ii és de 88%. El grup B inclou els aïllaments ARSEF 512 i ARSEF 1884 (aïllats d’insectes homòpters i coleòpters, respectivament) i finalment, en el grup C es troben els aïllaments ATCC 32865 i VPCI-126P (presos de lesions humanes). Aquest grup presenta la major distància genètica respecte dels altres aïllaments i el seu valor BS és de 98%.

Discussió

Els resultats d’aquest treball mostren l’evident variació genètica entre els aïllaments de C. coronatus avaluats, agrupats segons el seu origen en: 1) insecte, 2) compost, 3) sòl i 4) humà.

tot i que els principis de la tècnica amb seqüències d’ITS difereixen dels de la tècnica RAPD19,20, es compleix amb el que indica Soll21, que afirma que perquè els resultats obtinguts amb un mètode es considerin vàlids, han de confirmar-se amb al menys una tècnica diferent. Els nostres resultats són consistents amb les dues tècniques basats en què: 1) existeix variació intraespecífica en els aïllaments avaluats; 2) els aïllaments d’humans presenten la major divergència genètica respecte de la resta dels aïllaments; 3) la major distància genètica entre grups d’aïllaments es dóna entre els provinents d’humans i els Lycos (aïllats de L. ingènua).

Tot i que resultats com els de Ribes et al.5, Valle et a l’ .3 i Wieloch et al.4 suggereixen que no tots els aïllaments són patògens per a l’humà i que, al seu torn, això és un indici de variació intraespecífica de fong, no hi ha estudis que ho recolzin. Aquest treball és el primer en avaluar i demostrar que hi ha variació intraespecífica a nivell molecular de C. coronatus relacionada amb la font de la qual van ser presos.

Estudis similars han avaluat la variació en altres entomoftorales amb RAPD i amplificació de ITS22,23. Així com els nostres resultats mostren una clara distància genètica entre aïllaments provinents de diferents fonts, Fargues et al.9 i Morton et al.24 van reportar la relació entre la variació genètica i el hostatger.

Hi ha estudis de l’complex Fusarium , que encara que no és entomoftoral, comparteix amb C. coronatus la característica d’infectar una àmplia gamma de hospederos, inclòs l’humà. Zhang et al.25 van buscar variació intraespecífica sense èxit en 471 aïllaments presos d’humans, terra, animals, aire d’hospitals i plantes. La raó d’això és que Fusarium és un fong multihospedero26, el que implica que un mateix aïllament pot infectar un gran nombre d’organismes de diversos phyla.

Cada microorganisme té un conjunt de característiques que funcionen com a factors de virulència en els seus hospederos; però, es desconeix fins a quin punt condicionen els mecanismes d’infecció en diferents grups de hospederos. Una causa d’això és l’absència de models que permetin analitzar la virulència entre grups infectados27. Tenint en compte les diverses fonts en què s’ha trobat a C. coronatus i els nostres resultats que mostren clarament la variació intraespecífica entre aïllaments, considerem que C. coronatus podria servir com a model per avaluar mecanismes de virulència que ho fan específic per a cada un els grups d’organismes als quals ataca.

Tot i que els nostres resultats mostren una clara diferència a nivell molecular entre aïllaments de C. coronatus provinents d’humans i altres fonts, en aquest treball no es presenten resultats morfològics o fisiològics dels aïllaments per comprovar si les diferències genètiques es tradueixen en diferències fenotípiques; però, hi ha observacions pròpies (només amb alguns aïllaments) i d’altres autors que ens ajuden a inferir, a més de plantejar la possibilitat que hi hagi algun aïllament que no sigui patogen d’humans. Hall et al.28 consideren que la capacitat de desenvolupar-se a 37 ° C és un criteri per avaluar el potencial dels fongs com patògens d’humans; Mier et al.29 van treballar en un cep provinent d’humà i es va desenvolupar a 37 ° C, mentre que Papierok et al.2 van estudiar 10 ceps, de les quals només una d’origen humà i una aïllada de l’miriápodo Hanseniella unguiculata van créixer a 37 ° C; la resta provenia d’insectes de diversos ordres. En el nostre cas, es va observar l’efecte de la temperatura sobre els aïllaments Lyco 1, 4 i 5, trobant que no hi va haver desenvolupament a 37 ° C (dades no presentades). A més, observem que l’aïllament ATCC 32865 (pres d’humà) va trigar gairebé 4 dies més en omplir una caixa Petri de 85mm de diàmetre amb respecte als obtinguts d’insectes (dades no presentades) i tenia una aparença cotonosa, de poca rugositat i tonalitats grisenques, característiques que no es van presentar en els altres aïllaments avaluats. Aquestes característiques també sustenten les diferències entre l’aïllament d’humans i la resta, el que podria atribuir-se a la font de la qual es va obtenir i suggereix que aquesta pot ser un factor que genera distàncies genètiques. Els resultats de López-Martínez et al.30 també suggereixen la variació intraespecífica i que no tots els aïllaments són patògens de mamífers; van realitzar proves en ratolins, hàmsters i cobayos amb una soca de C. coronatus presa de Aenolamia postica i encara que va haver una invasió inicial en tots els animals, va desaparèixer 15 dies després de la inoculació, el que indica que el fong no va ser capaç d’establir-i infectar-los. L’anterior posa de manifest l’absència de patogenicitat d’aquest cep en particular en mamífers.

D’aquesta manera, els nostres resultats sobre la distància genètica amb ITS i RAPD entre l’aïllament ATCC 32865 (d’humà) i els presos d’insectes, juntament amb les característiques fisiològiques i morfològiques dels aïllaments Lycos descrites anteriorment, suggereixen que aquests no són patògens per a l’humà; aquesta podria ser la raó per la qual, malgrat que els treballadors estan en contacte amb el fong, no hi ha informes de dany en humans per C. coronatus en plantes productores de xampinyó.

Els nostres resultats no són concloents per suggerir l’ús de C.coronatus en el control biològic d’insectes; cal investigació per determinar-lo, com va passar amb el cep 251 de l’fong Purpureocillium lilacinus que és usada actualment per al control biològic de nematodes, tot i que el fong està reportat com a patogen d’humans i animals. Aquesta soca és l’única que no produeix la paecilotoxina, que és l’agent causal de dany en humanos31. Cal esmentar que per a C. coronatus ja es va identificar el metabòlit coronatin-1 en larves de Galleria mellonella i, tot i que cal determinar la seva manera d’acció, seria interessant investigar si aquest metabòlit és capaç de causar alteracions en humans4.

la grandària de la mostra i el nombre de hospederos / substrats d’aquest treball van ser limitats, la qual cosa podria haver afectat l’anàlisi de la diversitat genètica i el nombre de branques que es van formar en els arbres filogenètics. Es recomana realitzar proves amb un major nombre d’aïllaments i incloure estudis de morfologia i fisiologia. Tot i aquestes limitacions, els nostres resultats amb les tècniques RAPD i ITS proporcionen informació sobre la diversitat intraespecífica de C. coronatus relacionada amb el hostatger / substrat.

Conflicte d’interessos

Els autors declaren que no existeix cap conflicte d’ interès.